Методические рекомендации МР 1.2.0311-22 "Использование метода экстраполяции и интерполяции с имеющим норматив микрометровым аналогом по химической природе применительно к гигиенической регламентации наночастиц и других химических соединений на основании сравнительной оценки реагирования защитно-компенсаторных механизмов организма" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 декабря 2022 г.)

Методические рекомендации МР 1.2.0311-22
"Использование метода экстраполяции и интерполяции с имеющим норматив микрометровым аналогом по химической природе применительно к гигиенической регламентации наночастиц и других химических соединений на основании сравнительной оценки реагирования защитно-компенсаторных механизмов организма"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 30 декабря 2022 г.)

Введены впервые

I. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее - МР) определяют алгоритм использования метода экстраполяции и интерполяции применительно к гигиенической регламентации наночастиц и других химических соединений на основании сравнительной оценки реагирования защитно-компенсаторных механизмов организма.

1.2. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими, научно-исследовательскими и иными организациями, занимающимися вопросами оценки безопасности наноматериалов.

II. Общие положения

2.1. В настоящее время широко применяется сравнительный принцип оценки вредных эффектов наночастиц (далее - НЧ) и микрочастиц (далее - МЧ). Это связано с тем, что вещество, которое в микроразмерном состоянии в определенной дозе могло бы по своей химической природе рассматриваться как не обладающее вредными эффектами, может вызвать их, попадая в организм в наноразмерном состоянии [8].

Данное обстоятельство обуславливает необходимость проведения экспериментальных исследований для экстраполяции и интерполяции с имеющим норматив микрометровым аналогом по химической природе применительно к гигиенической регламентации НЧ и других химических соединений на основании сравнительной оценки реагирования защитно-компенсаторных механизмов организма.

2.2. Проведению сравнительных токсикологических исследований предшествует изучение кинетики агрегации МЧ и НЧ, их растворимости в различных биосредах (например, в надосадочной жидкости бронхоальвеолярного лаважа и стерильной бычьей сыворотке или ее аналоге).

III. Методика проведения исследований

3.1. Условием проведения экспериментального исследования для дальнейшего применения метода экстраполяции и интерполяции с имеющим норматив микрометровым аналогом по химической природе применительно к гигиенической регламентации НЧ и других химических соединений на основании сравнительной оценки реагирования защитно-компенсаторных механизмов организма является соотнесение временных рамок манипулирования с наносуспензиями и их введения в организм с кинетикой старения этих суспензий (нанозолей) таким образом, чтобы обеспечить минимальную степень агрегации частиц и в любом случае иметь ясное представление о фактическом размере первичных НЧ и/или их нано- и микроразмерных агрегатов на момент воздействия [2]. Указанная выше кинетика агрегации исследуется методом динамического рассеяния света на универсальных анализаторах суспензий ¹. В случае, если для суспендирования частиц и поддержания их во взвешенном состоянии применяется периодическая ультразвуковая обработка наносуспензии, ее состояние должно исследоваться указанным выше методом в тех временных точках, которые соответствуют взятию ее порций для осуществления воздействия суспензией НЧ на животного.

------------------------------

¹_{Например, на анализаторе размера НЧ АРН-2 или с аналогичными или лучшими характеристиками.}

------------------------------

3.2. Для уменьшения степени агрегации, помимо сокращения времени хранения суспензии и ускорения всех манипуляций с нею, следует снижать концентрацию ионов в дисперсионной среде до уровня, допускаемого свойствами биологического объекта воздействия (вплоть до использования деионизированной воды). Возможно применение нетоксичных стабилизаторов суспензий.

3.3. В экспериментальном исследовании необходим контроль на реакцию, вызываемую дисперсионной средой ("носителем"), свободной от частиц [2].

3.4. Эксперимент in vivo по сравнительной токсикологической оценке опасности элементных/элементнооксидных НЧ и МЧ с использованием клеточных систем альвеолярных макрофагов необходимо планировать так, чтобы минимальная численность крыс в каждой подопытной и контрольной группе составляла 6 животных, желательная - 10 - 12. Использовать большее число животных нецелесообразно, поскольку сравниваемые частицы, не дающие статистически значимых различий реакции фагоцитоза в группах указанной численности, рассматриваются как обладающие одинаковой цитотоксичностью.

3.5. В эксперименте in vitro перитонеальные макрофаги получают у крыс через 48 часов после внутрибрюшинного введения 10 - 15 мл стерильного вазелинового масла путем промывания брюшной полости стерильным физиологическим раствором.

3.6. При подборе доз для проведения исследования рекомендуется использовать имеющиеся литературные данные о токсичности изучаемых НЧ (обращая внимание на характер зависимости "доза-эффект"), данные о механизмах токсического действия ранее изученных их аналогов, но в ионной форме (или частиц в микрометровом диапазоне). Если таких данных нет, то необходимо провести пилотный эксперимент, доза для которого подбирается эмпирически. Выбранная доза НЧ должна быть такой, при которой возможно проведение подсчета общего числа клеток в камере Горяева.

3.7. Сравнительное действие изучаемых суспензий НЧ и МЧ следует оценивать на одном уровне доз. Рекомендуется дозировать частицы по массе. Во-первых, такое выравнивание сравниваемых суспензий по суммарной поверхности вводимой дозы частиц неизбежно ведет к количественному сближению эффектов воздействия на организм. Во-вторых, одной из задач экспериментов в этой области является получение данных к составлению шкалы предельно допустимых концентраций наноматериалов, а нормирование аэрозолей даже при минимальных размерах частиц в микрометровом диапазоне ведется в преимущественно величинах массо-объемной концентрации (мг или мкг на куб. метр воздуха) [3, 5].

IV. Методика изучения реакции альвеолярного фагоцитоза

4.1. Метод основан на однократном промывании дыхательных путей и подсчете общего числа клеток в полученных промывных водах. Подсчитанное в промывных водах число клеток далее пересчитывается на их тотальное число и количество отдельных клеточных элементов исходя из "клеточной формулы", подсчитанной при цитологическом изучении осадка промывных вод, при котором определяются также некоторые показатели фагоцитарной активности клеток и их повреждения.

4.2. Интратрахеальная инстилляция осуществляется крысе под эфирным рауш-наркозом под контролем зрения (с помощью специальной воронки и лобного рефлектора или налобного фонарика) в объеме 0,5 - 1 мл суспензий изучаемых частиц. Контрольным крысам вводят в том же объеме соответствующую среду без частиц [3].

4.3. Через 24 часа после интратрахеального введения НЧ и МЧ в легкие у крыс под гексеналовым наркозом (50 мг на 100 г веса тела) через отпрепарированную трахею вводится стеклянная канюля (конической формы, суживающаяся по наружному диаметру от 6 мм до 2 мм, с небольшим расширением на тонком конце - до 3 мм) и фиксируется лигатурой, после чего трахея перерезается на месте наложения канюли [3].

4.4. Шприц Люэра, содержащий 10 мл стерильного физиологического раствора, с помощью полиэтиленовой трубки или металлического переходника соединяется со свободным (широким) концом введенной в трахею канюли [3].

4.5. Крысу удерживают в вертикальном положении головой кверху, а шприц переводят в вертикальное положение канюлей книзу. Под давлением собственного веса поршня раствор перетекает в дыхательные пути. Затем крысу и шприц поворачивают на 180°. Большая часть жидкости перетекает обратно без приложения дополнительных усилий на поршень (чтобы не вызвать повреждения структурных элементов легких). Поскольку система герметична, поршень при этом не выпадает из шприца.

4.6. Извлеченные описанным способом 7 - 9 мл промывных вод легких переносятся в силиконированную центрифужную пробирку, предварительно охлажденную снаружи льдом для того, чтобы избежать адгезии макрофагов и их разрушения.

V. Оценка цитологических показателей БАЛЖ

5.1. В меланжер для белых кровяных телец до метки 1,0 набирается 3 %-я уксусная кислота, подкрашенная метиленовым синим до ярко-голубого цвета, а до метки 2 добирается жидкость, извлеченная из легких. После тщательного перемешивания меланжер оставляют на 10 мин для подкрашивания клеток. Подсчет клеток ведется в камере Горяева объемом 0,9 мм ³ в 100 больших (неразделенных) квадратах [3].

5.2. Перемножение подсчитанного числа на постоянный множитель 2,75 х 10 ⁴ дает показатель общего числа "свободных" (т.е. вымываемых) клеток в дыхательных путях в расчете на полный объем введенной жидкости. Зная на основании цитологического исследования процентное соотношение между отдельными клеточными элементами: макрофагами, полиморфоядерными лейкоцитами, лимфоцитами, эпителиальными клетками, - этот показатель можно перевести в соответствующие показатели абсолютного числа клеток интересующего вида в дыхательных путях [3].

5.3. Для цитологического исследования извлеченные из легких промывные воды центрифугируются в течение 4 мин при 1000 об./мин (200 g), жидкость декантируется, а из осадка готовятся 2 мазка на обезжиренных предметных стеклах. Мазки сушатся на воздухе, фиксируются метиловым спиртом в течение 1 мин и окрашиваются азур-эозином в течение 20 мин [3]. В каждом мазке, микроскопируемом с иммерсионной системой при увеличении х 900, дифференцированному подсчету подвергается не менее 100 клеток [3].

5.4. Если мазки не исследуются в течение недели после приготовления, цитологическое исследование затрудняется последующим выпадением кристаллами хлористого натрия. Этого можно избежать, добавив в промывные воды 10 капель 5 %-го желатинового раствора либо заменив физиологический раствор средой Хенкса. Второй способ предпочтительней, т.к. образующаяся желатиновая пленка создает некоторую "вуаль", затрудняющую микроскопирование [3].

5.5. При подсчете клеточной популяции промывных вод дыхательных путей наибольшее значение имеют следующие количественные показатели [3, 5]:

- абсолютное число всех клеточных элементов, вместе взятых;

- абсолютное число альвеолярных макрофагов (далее - AM) и процент AM, содержащих видимые (при световой микроскопии с иммерсионным объективом, увеличение х 900) агломераты частиц внутри клетки или в фазе аттракции на ее поверхности ²;

------------------------------

²_{Данный показатель считается для НЧ, образующих агломераты, например магнетит.}

------------------------------

- аналогично для нейтрофильных лейкоцитов (далее - НЛ);

- отношение числа НЛ к числу AM в качестве опосредованного показателя цитотоксичности. Основным эффектором фагоцитарного механизма клиренса являются AM, а вспомогательным - НЛ, относительный вклад которых в клиренс тем выше, чем более выражено повреждающее действие фагоцитируемых частиц на AM (цитотоксичность). Мобилизация как AM, так и в особенности НЛ, а также миграционная и фагоцитарная активность этих клеток дозозависимо контролируются количеством образующихся продуктов разрушения макрофагов. В связи с этим численное отношение НЛ/АМ в свободной клеточной популяции глубоких дыхательных путей, получаемой при их промывании (бронхоальвеолярном лаваже - БАЛ), служит ценным, хотя и косвенным, критерием цитотоксичности частиц in vivo;

- среднее число фагоцитированных агломератов частиц, приходящихся на один активный AM и НЛ ³. В случае, если оно не поддается определению из-за значительной пылевой нагрузки отдельных AM, эта нагрузка характеризуется процентным соотношением между AM, содержащими разное число фагоцитированных агломератов частиц (например, 30 % AM, содержащих до 5 агломератов, 35 % AM, содержащих не поддающееся подсчету число агломератов частиц);

------------------------------

³_{Данный показатель считается для НЧ, образующих агломераты, например магнетит.}

------------------------------

- процент AM с явными признаками дегенерации (такие как нарушение целостности клеточной мембраны, изменение формы и размера клетки);

- средний диаметр AM.

Необходимые показатели для оценки: абсолютное число всех клеточных элементов, абсолютное число AM и НЛ, отношение НЛ/АМ.

Перечисленные показатели определяются у каждой подопытной и контрольной групп крыс путем дифференциального подсчета не менее 100 клеток мазка, и для соответствующих групп вычисляются средние величины.

VI. Оценка цитотоксичности пылей по снижению жизнеспособности культуры макрофагов

6.1. Метод основан на способности красителя трипанового синего проникать внутрь клеток, потерявших жизнеспособность. При инкубации культуры макрофагов с пылью процент таких нежизнеспособных клеток повышается по сравнению с контролем в большей или меньшей степени в зависимости от уровня цитотоксичности пылевых частиц (при фиксированном времени инкубации и фиксированном соотношении между дозой пыли и числом макрофагов в культуре).

6.2. В эксперименте in vitro (методика получения перитонеальных макрофагов описана выше путем промывания брюшной полости) полученную промывную жидкость из брюшной полости центрифугируют при 500 g в течение 5 мин; клеточный осадок дважды промывают физиологическим раствором с повторным центрифугированием; отмытый осадок ресуспендируют в среде Хенкса, объединяя макрофаги от нескольких крыс. Все процедуры проводятся асептически. При окраске по Романовскому мазка такой клеточной суспензии содержание в ней макрофагов обычно составляет приблизительно 90 % всех клеток. Тест на цитотоксичность пылей может осуществляться в двух модификациях: на монослое макрофагов и в суспензии.

1-я модификация. Макрофаги ресуспендируют в среде 199, среде Игла или среде Хенкса с добавлением пенициллина (100 единиц на 1 мл) и стрептомицина (100 мкг на 1 мл) до концентрации 1,5 х 10 ⁶ клеток в мл. Суспензия заливается в стерильные пластиковые чашки Петри разового использования диаметром 35 мм по 2 мл на чашку. На каждый испытываемый образец пыли и на контрольную культуру берется по 5 чашек. Чашки закрывают крышками и помещают на 2 часа в термостат при плюс 37 °C, за этот период инкубации происходит адгезия жизнеспособных макрофагов ко дну чашки. После этого среда с неприкрепившимися клетками сливается, чашка 2 - 3 раза промывается свежими порциями среды и вновь заливается свежей средой в объеме 1 мл. В контрольные чашки добавляют до 1 мл фосфат-буферного физиологического раствора (далее - ФБФР), а в остальные - по 1 мл пылевой взвеси в ФБФР, содержащей 1 мг пыли. Далее чашки инкубируют при плюс 37 °C в течение 1,5 часа, после чего среда инкубации сливается и производится осторожное отмывание клеток от осевших пылевых частиц слабой струей ФБФР или инкубационной среды (с тем, чтобы не смыть клетки). Затем в каждую чашку вносят по 1 мл 0,5 %-го раствора трипанового синего, который через 3 мин смывается физиологическим раствором. При увеличении 10 х 40 подсчитывается 100 - 200 клеток и определяется процент окрасившихся в синий цвет (т.е. нежизнеспособных).

Преимуществом данного варианта является то, что им отчасти имитируется то функциональное состояние макрофага, в котором происходит фагоцитоз пылевых частиц на поверхности альвеол. Недостатком может оказаться то, что поврежденные пылью клетки теряют адгезивную способность, а поэтому могут оказаться смытыми при удалении пыли, а затем красителя. Такая избирательная потеря нежизнеспособных кле