Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-5-2023 "Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность методами in vitro" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2023 г. N 1089-ст)

Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Part 5. Cytotoxicity studies by in vitro methods

УДК 615.46:002:006.354
МКС 11.100.20

Дата введения - 1 июня 2024 г.
Взамен ГОСТ ISO 10993-5-2011

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Автономной некоммерческой организацией "Институт медико-биологических исследований и технологий" (АНО "ИМБИИТ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 сентября 2023 г. N 165-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2023 г. N 1089-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-5-2023 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2024 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 10993-5:2009 "Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность методами in vitro" (Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity, IDT).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Взамен ГОСТ ISO 10993-5-2011

Введение

ISO (Международная организация по стандартизации) является федерацией национальных органов по стандартизации (органов - членов ISO). Работу по подготовке международных стандартов проводят путем привлечения технических комитетов ISO. Каждая организация - член, заинтересованная в области деятельности, для которой создан технический комитет, имеет право быть представленной в данном комитете. Международные правительственные и неправительственные организации также принимают участие в работе ISO. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической комиссией (IEC) по вопросам стандартизации электротехнической продукции.

Настоящий стандарт подготовлен в соответствии с редакционными правилами Директив ISO/IEC, часть 2.

Некоторые элементы настоящего стандарта могут быть объектом патентных прав. ISO снимает с себя ответственность за обозначение патентных прав.

Настоящий стандарт разработан Техническим комитетом ISO/TC 194 "Биологическая и клиническая оценка медицинских изделий".

Настоящий стандарт представляет собой третье пересмотренное издание и заменяет второе издание ISO 10993-5:1999, которое технически пересмотрено.

Перечень стандартов серии ISO 10993 приведен на официальном сайте ISO.

В связи с широким признанием и применением исследований на цитотоксичность методами in vitro при оценке обширного круга медицинских изделий и материалов, целью настоящего стандарта ISO 10993 является не установление одного исследования, а определение схемы испытаний, которая требует принятия решений посредством серии шагов. Такой подход должен привести к выбору наиболее подходящего исследования.

В настоящем стандарте рассмотрены три вида исследований: исследование экстрактов, исследование методом прямого контакта и исследование методом непрямого контакта.

Выбор вида исследований зависит от природы исследуемого образца, потенциальной области применения и характера использования.

Этот выбор определяет детали приготовления исследуемых образцов, приготовление клеточных культур, а также способ, при помощи которого клетки подвергаются воздействию образцов или их экстрактов.

В конце периода воздействия выявляют наличие цитотоксичности и проводят оценку степени цитотоксичности. Настоящий стандарт намеренно не ограничивает выбор типа оценки. Такая стратегия позволяет делать доступным целый ряд методов исследований и отражает подход многих исследовательских групп, поддерживающих биологические исследования методами in vitro.

Многочисленные используемые методы и конечные точки, измеряемые при определении цитотоксичности, могут быть объединены в категории по типу оценки:

- оценка повреждения клеток морфологическими методами;

- измерение повреждения клеток;

- измерение клеточного роста;

- измерение специфических аспектов клеточного метаболизма.

Следовательно, существует несколько альтернативных способов получения результатов в каждой из этих четырех категорий. Исследователь должен быть осведомлен о методах исследований, а также знать, к какому из них относится определенная методика, для того чтобы проводить сравнения с другими результатами на схожих медицинских изделиях или материалах и межлабораторные исследования. Примеры протоколов количественных исследований приведены в приложениях.

В настоящем стандарте представлено также руководство по интерпретации результатов.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на медицинские изделия (МИ) и материалы, применяемые для их изготовления, и устанавливает требования к проведению исследований цитотоксичности методами in vitro.

В методах, установленных в настоящем стандарте, предусмотрено проведение инкубации клеточных культур в контакте с МИ и/или экстрактами из материалов МИ либо непосредственно, либо путем диффузии.

Данные методы предназначены для обнаружения в условиях in vitro ответной биологической реакции клеток млекопитающих по заданным показателям.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices - Part 1: Evaluation and testing within a risk management process ^* (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования в рамках процесса менеджмента риска)

-----------------------------

^*_{Исправлена ошибка оригинала.}

-----------------------------

ISO 10993-12, Biological evaluation of medical devices - Part 12: Sample preparation and reference materials (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 12. Приготовление проб и стандартные образцы)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ISO 10993-1, а также следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 культуральная посуда (culture vessels): Посуда, приемлемая для культуры клеток, включая стеклянные чашки Петри, пластмассовые культуральные чашки, пластмассовые многолуночные планшеты и планшеты для микротитрования.

Примечание - Она может быть взаимозаменяемой при условии, что соответствует требованиям по виду ткани и подходит для использования с клетками млекопитающих.

3.2 положительный контроль (positive control material): Материал и/или вещество с достаточно изученными характеристиками, которые при применении в конкретном методе подтверждают воспроизводимость этого метода и соответствие положительного или реактивного биологического ответа в тест-системе установленным требованиям.

Примечание - Назначение положительного контроля - продемонстрировать соответствующую ответную реакцию тест-системы. Например, стабилизированный органотином полиуретан ¹⁾ используют в качестве положительного контроля для твердых материалов и экстрактов, при разведении фенола - в качестве положительного контроля для экстрактов. В дополнение к материалу можно также применять чистые химические вещества для демонстрации эффективности тест-системы.

-----------------------------

¹⁾_{Полиуретаны ZDEC и ZDBC предоставляет FDA, Исследовательский институт Хатано (Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japan). Эта информация приведена для удобства пользователя настоящим стандартом и не является рекламой данной продукции со стороны ISO. Можно использовать эквивалентные продукты, если их применение позволяет получить аналогичные результаты.}

-----------------------------

3.3 отрицательный контроль (negative control material): Материал и/или вещество с достаточно изученными характеристиками, которые при применении в конкретном методе исследования подтверждают воспроизводимость этого метода и соответствие отрицательного, нереактивного или минимального биологического ответов в тест-системе установленным требованиям.

Примечание - Назначение отрицательного контрольного образца - продемонстрировать фоновую реакцию клеток. Например, в качестве отрицательного контрольного образца использовались полиэтилен высокой плотности ²⁾ для синтетических полимеров, стержни из окиси алюминия и керамики для стоматологических материалов.

-----------------------------

²⁾_{Полиэтилен высокой плотности может быть приобретен в Фармакопее США (Rockville, Maryland, USA) и в FDA, Исследовательском институте Хатано (Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257, Japan). Эта информация приведена для удобства пользователя настоящим стандартом и не является рекламой данной продукции со стороны ISO. Можно использовать эквивалентные продукты, если их применение позволяет получить аналогичные результаты.}

-----------------------------

3.4 исследуемая проба (test sample): Материал, МИ, часть МИ, компонент, экстракт или его часть, которые подвергаются биологическим или химическим исследованиям или оценке.

3.5 субконфлюэнтность (subconfluency): Примерно 80 % конфлюэнтности, т.е. завершение логарифмической фазы роста.

4 Подготовка проб и контролей

4.1 Общие положения

Исследование проводят:

a) на экстракте из исследуемой пробы;

и/или

b) исследуемой пробе.

Подготовку проб проводят в соответствии с ISO 10993-12.

Отрицательные и положительные контроли должны быть включены в каждое исследование.

4.2 Приготовление экстрактов из образцов

4.2.1 Общие требования

Условия экстракции должны моделировать или преувеличивать условия клинического применения, чтобы определить потенциальную токсическую опасность, не вызывая при этом значительных изменений в исследуемой пробе, таких как сплавление, плавление или растворение, или изменение химической структуры, кроме тех случаев, когда это ожидается при клиническом использовании МИ. При этом ввиду природы отдельных материалов (например, биодеградируемые материалы) во время процедуры экстракции может произойти изменение в химической структуре.

Примечание - Концентрация любых эндогенных или посторонних веществ в экстракте, а следовательно, количество подвергающихся воздействию исследуемых клеток зависит от площади контакта, объема модельной среды, рН, химической растворимости, скорости диффузии, осмоляльности, встряхивания, температуры, времени и других факторов.

Конечные МИ, которые получают путем смешивания двух или более компонентов в организме пациента для создания конечного МИ (например, костный цемент), не следует отмывать перед экстракцией. Эта процедура может снизить или удалить остаточные продукты, присутствующие на МИ.

Если исследуемая проба предназначена для применения в стерильных условиях, то для экстракции химических компонентов необходимо использовать стерильную исследуемую пробу.

4.2.2 Экстрагирующая жидкость

Выбор экстрагирующей жидкости (экстрагента) с учетом химических характеристик исследуемой пробы должен быть обоснован и задокументирован.

Для исследования клеток млекопитающих необходимо использовать следующие экстрагенты:

a) культуральную среду с сывороткой;

b) физиологический раствор;

c) другую подходящую модельную среду.

Выбор экстрагента должен отражать цель экстракции, причем необходимо рассмотреть использование и полярной, и неполярной жидкостей. Предпочтительной является культуральная среда с сывороткой. Использование культуральной среды с сывороткой более подходит для экстракции, так как она способна поддерживать клеточный рост, а также экстрагировать как полярные, так и неполярные вещества. В дополнение к культуральной среде с сывороткой необходимо рассмотреть применение культуральной среды без сыворотки для конкретной экстракции полярных веществ (например, ионных соединений). К другим подходящим экстрагентам относят очищенную воду и диметилсульфоксид (DMSO). DMSO является цитотоксическим в выбранных тест-системах при концентрации, превышающей 0,5 % (объемная доля). Действие на клетки концентрации экстрагируемых веществ в DMSO будет ниже из-за большего разбавления по сравнению с экстракцией в культуральной среде с сывороткой.

Примечание 1 - Могут быть применены различные типы сыворотки (например, эмбриональная, бычья/телячья сыворотка, сыворотка новорожденного теленка), а выбор сыворотки обусловлен типом клеток.

Примечание 2 - Следует помнить, что сыворотка/белок может в определенной степени связывать экстрагируемые вещества.

4.2.3 Условия проведения экстракции

4.2.3.1 Экстракцию следует проводить в стерильных, химически инертных, закрытых емкостях с соблюдением правил асептики в соответствии с ISO 10993-12.

4.2.3.2 Рекомендуемыми условиями экстракции являются:

a) (24 2) ч при температуре (37 1) °С;

b) (72 2) ч при температуре (50 2) °С;

c) (24 2) ч при температуре (70 2) °С;

d) (1,0 0,2) ч при температуре (121 2) °С.

Описанные выше условия экстракции, которые использовались для определения потенциальной опасности в оценке риска МИ или материала, основаны на историческом прецеденте. Другие условия, например: продленные или укороченные сроки экстракции при температуре 37 °С, имитирующие экстракцию, происходящую при клиническом применении, или позволяющие адекватно оценить потенциальную опасность, могут быть использованы, но должны быть обоснованы и зафиксированы документально. Для неимплантируемых МИ, находящихся в кратковременном контакте (не более чем 4 ч общей длительности контакта) с неповрежденной кожей или слизистой, продолжительность экстракции может быть менее чем 24 ч, но не менее чем 4 ч, при температурах, рекомендуемых в перечислениях а) и с).

Клеточную культуральную среду с сывороткой следует использовать только в соответствии с перечислением а), потому что температура экстракции выше (37 1) °С может негативно повлиять на химический состав и/или стабильность сыворотки и других составляющих культуральной среды.

Для исследуемых проб из полимеров температура экстракции не должна превышать температуру стеклования, так как более высокая температура может изменить состав экстрагента.

4.2.3.3 Если экстракт фильтруют, центрифугируют или обрабатывают другим способом, то это необходимо внести в окончательный отчет вместе с обоснованием в соответствии с разделом 9. Любое изменение рН экстракта фиксируют в отчете. Манипуляции с экстрактом, например подбор значения рН, необходимо избегать, так как они могут повлиять на результат.

4.3 Подготовка пробы для исследования методом прямого контакта

4.3.1 Форма исследуемой пробы

Образцы различных форм, размеров или физических состояний (например, жидкое или твердое) в исследованиях на цитотоксичность изучают без изменений.

Предпочтительно, чтобы хотя бы одна из сторон исследуемой пробы была плоской. При отсутствии такой возможности требуется внести изменения для получения плоских поверхностей.

4.3.2 Стерильность исследуемой пробы

4.3.2.1 Необходимо принимать во внимание стерильность исследуемой пробы.

4.3.2.2 С исследуемыми пробами стерильных МИ обращаются с соблюдением правил асептики в течение всего процесса исследования.

4.3.2.3 Исследуемые пробы МИ, которые выпускают нестерильными, но подвергают стерилизации перед применением, стерилизуют способом, рекомендованным изготовителем, и применяют с соблюдением правил асептики в течение всего процесса исследования.

Воздействие способа стерилизации или стерилизующих агентов на МИ принимают во внимание при выборе приготовления пробы до ее использования в тест-системе.

4.3.2.4 Исследуемые пробы МИ, которые можно применять нестерильными, используют в таком виде, в каком они выпускаются, процесс приготовления экстрактов проводят с соблюдением правил асептики в течение всего процесса исследования. Стерилизация исследуемой пробы может быть обоснована только во избежание микробного загрязнения культуры клеток; тем не менее процесс стерилизации не должен изменять свойства исследуемой пробы.

Нестерильные исследуемые пробы необходимо проверить на предмет микробного (бактериального) загрязнения, так как оно может привести к ложной оценке цитотоксичности.

4.3.3 Жидкие исследуемые пробы

Жидкие исследуемые пробы исследуют:

a) прямым нанесением

или

b) нанесением на биологически инертную абсорбирующую матрицу.

Для этой цели подходят фильтровальные диски.

4.3.4 Абсорбирующие исследуемые пробы

При необходимости исследуемые пробы, которые являются абсорбирующими, должны быть пропитаны культуральной средой перед исследованием, чтобы избежать адсорбцию культуральной средой в испытательной посуде.

4.4 Подготовка контролей

Контроли подготавливают, следуя такой же процедуре, как и при подготовке исследуемой пробы.

5 Линии клеток

Предпочтение отдается линиям клеток, полученным из официальных источников ¹⁾.

-----------------------------

¹⁾_{Например, рекомендуемыми линиями клеток являются American Type Culture Collection CCL 1 (NCTC клон 929), CCL 163 (Balb/3Т3 клон A31), CCL 171 (MRC-5) и CCL 75 (WI-38), CCL 81 (Vero) и CCL 10 [(BHK-21 (C-13)] и V-79 379A. Данная информация приведена для удобства пользования настоящим стандартом и не является рекламой этой продукции со стороны ISO. Возможно использование других линий клеток, если доказано, что они приводят к таким же или более релевантным результатам.}

-----------------------------

Если требуется специфическая чувствительность, то первичные клеточные культуры, линии клеток и органотипические культуры, полученные непосредственно из живых тканей, следует использовать только в том случае, если можно продемонстрировать воспроизводимость и точность ответной реакции.

Маточная культура линии клеток сохраняется при температуре минус 80 °С или ниже в соответствующей культуральной среде, содержащей вещество, защищающее от воздействия низких температур (криопротектор), например диметилсульфоксид или глицерин. Длительное хранение (от нескольких месяцев до многих лет) возможно только при температуре минус 130 °С или ниже.

Для исследования используют клетки, не содержащие микоплазму. Перед использованием маточные культуры должны быть проверены на отсутствие микоплазмы.

Важно регулярно проверять клетки (например, морфологию, время удвоения, модальное число хромосом), так как чувствительность исследований может варьироваться в зависимости от количества пассажей.

Необходимо использовать надлежащие методы работы с клеточными культурами [5].

6 Культуральная среда

Культуральная среда должна быть стерильной.

Культуральная среда с сывороткой или без нее должна соответствовать условиям, требованиям роста или поддержания жизнеспособности определенной линии клеток.

Можно включить в состав среды антибиотики, убедившись в том, что они не оказывают неблагоприятного воздействия на пробы.

Необходимо обосновать условия хранения.

Примечание - Стабильность культуральной среды может различаться в зависимости от ее состава и условий хранения.

рН культуральных сред поддерживают на уровнях от 7,2 до 7,4.

7 Подготовка начальной культуры клеток

Используя выбранную линию клеток и культуральную среду, готовят достаточное количество клеток для проведения исследования. Если клетки должны быть выращены из культур, взятых из хранилища, то необходимо удалить криопротектор при его наличии. Перед использованием клеточную культуру пересевают как минимум один раз.

Клетки снимают и ресуспендируют путем ферментативной и/или механической дезагрегации, используя наиболее подходящий метод для своей линии клеток.

8 Проведение исследований

8.1 Число дублей

Для исследуемых проб и контроля используют не менее трех дублей.

8.2 Исследование экстрактов

8.2.1 Данное исследование позволяет оценить цитотоксичность как качественно, так и количественно.

8.2.2 Определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии капают в каждый сосуд для экспонирования с экстрактом. Равномерно распределяют клетки по поверхности каждого сосуда легким вращением.

8.2.3 Культуры инкубируют при температуре (37 1) °С в воздушной среде с 5 %-ной (доля объема) двуокисью углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой.

Исследования следует проводить на субконфлюэнтном монослое или на только что суспендированных клетках.

В исследовании на колониеобразование следует использовать соответствующую низкую плотность клеток.

8.2.4 Перед началом исследования субконфлюэнтность и морфологию культур клеток проверяют с помощью микроскопа.

В исключительных случаях экспоненциально растущие клетки (например, зародышевые клетки, активно пролиферирующие клетки) могут высеваться в начальной точке исследования.

8.2.5 Исследование проводят:

a) на исходном экстракте и

b) на серии разведений экстрактов, используя в качестве разбавителя культуральную среду.

Как альтернатива, если известно или предполагается наличие материалов с ограниченной растворимостью, то растворение достигается изменением первоначального соотношения экстракта из исследуемой пробы к культуральной среде.

Если в исследовании используют монослой клеток, то культуральную среду следует удалить и добавить кратное количество экстракта или его разведения в каждый из сосудов.

Если в исследовании используют клеточную суспензию, то добавляют экстракт или его разведение в каждый из дублирующих сосудов непосредственно после приготовления клеточной суспензии.

8.2.6 Если используют неизотонический экстракт, например воду, то исследуют экстракт при наиболее физиологически совместимой концентрации после разведения в культуральной среде.

Примечание - Рекомендуется использовать концентрированную культуральную среду, например 2x, 5х, для разведения водных экстрактов.

8.2.7 Добавляют определенное количество исходного реактива, отрицательного и положительного контролей в дополнительные дублирующие сосуды.

Примечание - При необходимости исследуют контрольную свежую культуральную среду.

8.2.8 Сосуды инкубируют, используя условия, описанные в 8.2.3, в течение периода времени, соответствующего специфическим условиям исследуемой пробы.

8.2.9 После периода инкубации длительностью по меньшей мере 24 ч определяют эффект цитотоксичности в соответствии с 8.5.

8.3 Исследование методом прямого контакта

8.3.1 Данное исследование позволяет оценить цитотоксичность как качественно, так и количественно.

8.3.2 Определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии капают в каждый из необходимого количества сосудов, предназначенных для прямого контакта клеток с исследуемой пробой. Клетки равномерно распределяют по поверхности каждого сосуда, осторожно его вращая в горизонтальной плоскости.

8.3.3 Культуру клеток инкубируют при температуре (37 1) °С в воздушной среде с 5 %-ной (доля объема) двуокисью углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой до тех пор, пока культуры не вырастут до субконфлюэнтности.

8.3.4 Перед началом исследования субконфлюэнтность и морфологию культур проверяют с помощью микроскопа.

8.3.5 Удаляют культуральную среду. Затем в каждый сосуд доливают свежую культуральную среду.

8.3.6 Осторожно помещают отдельный образец исследуемой пробы на клеточный слой в центре каждого дублирующего сосуда и убеждаются в том, что образец исследуемой пробы покрывает приблизительно 1/10 поверхности клеточного слоя. При доказательном обосновании можно использовать другие соотношения поверхности образца исследуемой пробы и поверхности клеточного слоя.

Проявляют осторожность для предотвращения нежелательного перемещения образцов исследуемой пробы, поскольку это может привести к физическому повреждению клеток, например их смещению.

Примечание - При необходимости, образцы исследуемой пробы помещают в культуральный сосуд перед добавлением клеток.

8.3.7 Готовят дублирующие сосуды для отрицательного и положительного контролей.

8.3.8 Сосуды инкубируют в условиях, описанных в 8.3.3, в течение необходимого периода времени (не менее 24 ч), соответствующего специфическим условиям конкретной пробы.

8.3.9 Надосадочную культуральную среду сливают и определяют цитотоксический эффект в соответствии с 8.5.

8.4 Исследование методом непрямого контакта

8.4.1 Исследование методом диффузии на агаре

8.4.1.1 Данное исследование используют только для качественной оценки цитотоксичности. Исследование непригодно для вымываемых веществ, которые не могут диффундировать через слой агара или которые вступают в реакцию с агаром. Применение метода диффузии на агаре для определения цитотоксичности должно быть обосновано.

8.4.1.2 Для исследования капают определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии в каждый из достаточного числа дублирующих сосудов. Клетки равномерно распределяют по поверхности каждого сосуда, осторожно вращая сосуды в горизонтальном направлении.

8.4.1.3 Культуру клеток инкубируют при температуре (37 1) °С в воздушной среде с 5 %-ной (доля объема) двуокисью углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой до тех пор, пока культуры не вырастут приблизительно до конфлюэнтности в конце логарифмической фазы кривой роста.

8.4.1.4 Перед началом исследования субконфлюэнтность и морфологию клеточной культуры проверяют с помощью микроскопа.

8.4.1.5 Удаляют из сосуда культуральную среду. Затем смешивают свежую культуральную среду, содержащую сыворотку с растопленным агаром, чтобы окончательная концентрация агара составляла от 0,5 % до 2 %, и вносят соответствующий объем в каждый сосуд. Используют исключительно агар, который подходит для выращивания клеток млекопитающих в культуре. Смесь культуральной среды с агаром должна находиться в жидком состоянии при температуре, совместимой с температурой клеток млекопитающих.

Примечание - Агар доступен в различных диапазонах молекулярной массы и чистоты.

8.4.1.6 Осторожно помещают несколько образцов исследуемой пробы на отвердевший слой агара в каждый сосуд. Следует убедиться в том, что образец покрывает приблизительно 1/10 поверхности клеточного слоя.

При должном обосновании можно использовать другие соотношения поверхности исследуемого образца и поверхности клеточного слоя.

Все абсорбирующие материалы до помещения на агар следует предварительно поместить в культуральную среду во избежание дегидратации агара.

8.4.1.7 Готовят дублирующие сосуды как с отрицательным контрольным образцом, так и с положительным контрольным образцом.

8.4.1.8 Сосуды инкубируют в условиях, описанных в 8.4.1.3, от 24 до 72 ч.

8.4.1.9 Осматривают клетки для определения цитотоксичности до и после осторожного удаления образцов с поверхности агара. Использование витальной окраски, например нейтрального красного, может способствовать обнаружению цитотоксичности. Витальный краситель можно добавлять до или после инкубации с образцом. Если краситель добавлен перед инкубацией, то культуры защищают от воздействия света во избежание повреждения клеток вследствие фотоактивации витального красителя.

8.4.2 Исследование методом диффузии на фильтр

8.4.2.1 Данное исследование используют только для качественной оценки цитотоксичности.

8.4.2.2 Свободный от поверхностно-активных веществ фильтр с размером пор 0,45 мкм помещают в каждый сосуд и добавляют определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии в каждый из достаточного числа дублирующих сосудов для испытания. Осторожным вращением клетки равномерно распределяют по поверхности каждого фильтра.

8.4.2.3 Культуры инкубируют при температуре (37 1) °С в воздушной среде с 5 %-ной (доля объема) двуокисью углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой до тех пор, пока культуры не вырастут приблизительно до конфлюэнтности в конце логарифмической фазы кривой роста.

8.4.2.4 Удаляют из сосудов культуральную среду. Затем фильтр стороной, на которой находятся клетки, помещают на слой застывшего агара (см. 8.4.1.5).

8.4.2.5 Осторожно помещают дублирующие исследуемые образцы на верхнюю (без клеток) сторону фильтра. Экстракты и свежеприготовленные смеси помещают на фильтр в удерживающих инертных кольцах.

8.4.2.6 Готовят дублирующие фильтры как с отрицательным, так и с положительным контрольным образцами.

8.4.2.7 Сосуды инкубируют в условиях, описанных в 8.4.2.3, в течение 2 ч 10 мин.

8.4.2.8 Осторожно удаляют образцы с фильтра и отделяют фильтр от поверхности агара.

8.4.2.9 Выявляют цитотоксические эффекты, используя соответствующую методику окрашивания.

8.5 Определение цитотоксичности

8.5.1 Выявляют цитотоксические эффекты качественным или количественным методами. Количественная оценка цитотоксичности предпочтительнее. Качественные методы подходят для скрининговых целей.

При качественной оценке исследуют клетки через микроскоп, при необходимости используя цитохимическую окраску, чтобы оценить изменения, например: изменение общей морфологии, вакуолизацию, расщепление, лизис клеток и целостность мембран. Отклонение от нормальной морфологии регистрируют в отчете об исследовании описательно или в цифровом выражении. В таблицах 1 и 2 приведен удобный способ оценки испытуемых материалов.

Таблица 1 - Качественная морфологическая шкала цитотоксичности экстрактов

Уровень, баллы	Реакция	Состояние клеточной культуры
0	Отсутствует	Дискретные интрацитоплазматические гранулы, лизис клеток отсутствуют, снижения роста клеток не наблюдается
1	Незначительная	Не более чем 20 % клеток круглые, свободно прикреплены и без интрацитоплазматических гранул или показывают изменения в морфологии; в наличии отдельные лизированные клетки, заметна только незначительная задержка роста
2	Слабая	Не более чем 50 % клеток закруглены, свободны от интрацитоплазматических гранул, отсутствует обширный лизис клеток; наблюдается не более чем 50 % задержка роста
3	Умеренная	Не более чем 70 % слоев клеток содержат круглые или лизированные клетки, клеточные слои не полностью разрушены, но наблюдается более чем 50 % задержка роста
4	Резкая	Почти полное или полное разрушение клеточных слоев

Таблица 2 - Шкала реактивности для испытания методом диффузии на агаре, на фильтре и прямым контактом

Уровень, баллы	Реактивность	Описание зоны реактивности
0	Отсутствует	Наблюдаемая зона вокруг образца или под ним отсутствует
1	Незначительная	Отдельные плохо сформировавшиеся или дегенерировавшие клетки под образцом
2	Слабая	Зона ограничивается областью под образцом пробы
3	Умеренная	Зона превышает размер образца до 1,0 см
4	Резкая	Зона распространяется более чем на 1,0 см от образца

Метод оценки описывают в отчете. Метод и результаты оценки должны быть включены в отчет об исследовании.

Исходя из данных таблиц 1 и 2 достижение количества баллов по шкале выше чем 2 считают цитотоксическим эффектом.

При количественной оценке измеряют число погибших клеток, замедление роста клеток, пролиферацию клеток или образование колоний. Число клеток, количество белка, высвобождение ферментов, высвобождение или сокращение витальной окраски или другой измеримый параметр могут быть количественно оценены с помощью объективных средств. Объективные средства и результат регистрируют в отчете об исследовании.

Снижение жизнеспособности клеток более чем на 30 % считают цитотоксическим эффектом. Другие критерии, включая отличные от стандартных точки отсечения или приемлемое соотношение результата опыт/контроль, должны быть обоснованы для альтернативных линий клеток или многослойных тканевых конструкций. Критерий должен быть обоснован и отражен документально.

Протоколы, приведенные в приложениях А-D, могут быть использованы для количественного определения цитотоксичности экстрактов.

Примечание - Протоколы А и В приемлемы для химических веществ, что доказано в ходе валидационных международных исследований, и для медицинских устройств, что подтверждено в ходе международных циклических испытаний. Для цитотоксических материалов они позволяют ранжировать цитотоксический эффект путем вычисления значения IC50 (ингибирующая концентрация, примерно на 50 % влияющая на рассматриваемую конечную точку).

В приложениях С и D приведены другие протоколы, широко используемые для количественного определения цитотоксичности.

Для отдельных методов определения цитотоксичности может потребоваться контроль нулевого времени или базовая линия культуры клеток.

8.5.2 Необходимо убедиться в тщательности выбора методов исследования, так как результаты исследования могут оказаться недействительными, если исследуемая проба выделяет вещества, создающие помехи в тест-системе или в измерении.

Материалы, которые могут выделять формальдегид, можно достоверно исследовать только при оценке жизнеспособности клеток.

8.5.3 При наличии очевидных различий в результатах исследований между дублирующими сосудами с культурой клеток исследование следует считать неприемлемым или неудовлетворительным. В таком случае исследование необходимо повторить или использовать альтернативную методику.

8.5.4 Если отрицательный, положительный контрольные образцы или любой другой контроль (стандарта, среды, экстрагента, реагента и т.д.) не вызывают ожидаемого ответа в тест-системе, то исследование повторяют.

9 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен содержать, по крайней мере, следующие сведения:

a) название и адрес исследовательского центра;

b) ФИО лиц(а), проводивших(его) исследование;

c) даты начала и конца исследования:

d) описание образца;

e) линии клеток, их источник и обоснование выбора;

f) наименование компании и партии культуральной среды, сыворотки и антибиотиков, если добавлялись;

g) метод исследования и его обоснование;

h) процедура экстракции по применимости и, при возможности, характер и концентрация вымываемых веществ;

i) отрицательный, положительный контрольные образцы и контроли других видов;

j) клеточный ответ и другие наблюдения;

k) любые другие соответствующие данные, необходимые для оценки результатов.

10 Оценка результатов

Общие результаты исследования должны оцениваться лицами, способными принимать обоснованные решения на основе данных исследования. Сведения о цитотоксичности оценивают во взаимосвязи с другими данными по биосовместимости и предназначенным применением МИ.

Интерпретация результатов исследования цитотоксичности должна учитывать классификацию МИ согласно ISO 10993-1.

При цитотоксическом эффекте возможно провести дальнейшую оценку, например:

a) дополнительные исследования (наличие/отсутствие сыворотки, изменение уровня сыворотки в культуральной среде);

b) анализ экстракта (например, остаточные количества стерилизующих агентов и других производственных процессов), если применимо;

c) анализ зависимости ответной реакции от концентрации;

d) химические характеристики вымываемых компонентов;

е) другие процедуры исследования.

Любой цитотоксический эффект является предметом пристального внимания. Это, в первую очередь, указывает на потенциальную токсичность in vivo, тем не менее МИ не обязательно признается непригодным для конкретного клинического применения исключительно на основании данных цитотоксичности.

Библиография

[1]	Guidance Document on Using In Vitro Data to Estimate In Vivo Starting Doses for Acute Toxicity, 2001. NIH Publication No. 01-4500 available under (http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/acutetox_docs/guidance0801/iv_guide.pdf)
[2]	Guidelines for preclinical biological evaluation of medical materials and devices. MHLW (Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan) memorandum, JIMURENRAKU Iryokiki-Shinsa, 36, 2003
[3]	BORENFREUND E. and PUERNER J.A. Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicological Letters, 24, pp. 119-124, 1985
[4]	United States Pharmacopeia
[5]	COECKE S., BALLS M., BOWE G., DAVIS J., CSTRAUNTHALER G., HARTUNG Т., HAY R., MERTEN O., PRICE A., SCHECTMAN L., STACEY G. and STOKES W. Guidance on Good Cell Culture Practice, A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, pp. 261-287, 2005
[6]	ISAMA K., MATSUOKA A., HAISHIMA Y. and TSUCHIYA T. Proliferation and differentiation of normal human osteoblasts on dental Au-Ag-Pd casting alloy: Comparison with cytotoxicity using fibroblast L929 and V79 cells. Mater. Trans., 43, pp. 3155-3159, 2002
[7]	TSUCHIYA T. Studies on the standardization of cytotoxicity tests and new standard reference materials useful for evaluating the safety of biomaterials. J. Biomaterials Applications, 5, pp. 139-157, 1994
[8]	MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immun. Methods, 65, pp. 55-63, 1983
[9]	SCUDIERO D.A., SHOEMAKER R.H., PAULL K.D., MONKS A., TIERNEY S., NOFZIGER Т.Н., CURRENS M.J., SENIFF, D. and BOYD, M.R. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res., 48, pp. 4827-4833, 1988
[10]	SPIELMANN H. et al. Interlaboratory assessment of alternatives to the Draize eye irritation test in Germany, Toxicol. In Vitro, 5, pp. 539-542, 1991
[11]	HEXIG В., NAKAOKA R. and TSUCHIYA T. Safety evaluation of surgical materials by cytotoxicity testing. J. Artif. Organs, 11, pp. 204-211, 2008

Ключевые слова: медицинские изделия, оценка биологического действия, цитотоксичность, исследования, субконфлюэнтность, методы in vitro.