Приложение D (справочное). Исследование на цитотоксичность с применением ХТТ-теста

Приложение D
(справочное)

Исследование на цитотоксичность с применением ХТТ-теста

D.1 Общие положения

Метод исследования основан на измерении жизнеспособности клеток посредством митохондриальных дегидрогеназ [9].

ХТТ [2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-[(фениламино)карбонил] -2Н-гидроксид тетразолия] в процессе метаболизма жизнеспособных клеток превращается в водорастворимый оранжевый формазан. Число жизнеспособных клеток коррелирует с интенсивностью цвета, определяемой фотометрическими измерениями.

D.2 Проведение исследований

D.2.1 Основная процедура

Клетки L929 высевают в 96-луночные планшеты и поддерживают в культуре 24 ч ( 1 период удвоения) для формирования полуконфлюэнтного монослоя (см. ссылку [5] для дополнительной информации по процедуре культивирования). Затем в каждую лунку вносят испытуемое соединение в нескольких концентрациях. После 24 ч инкубации количество формазана определяют для каждой концентрации пробы и сравнивается с контрольными культурами. Для каждой концентрации вычисляют ингибирование роста в процентах.

D.2.2 Материалы

D.2.2.1 Линия клеток

Клетки линии L-929 (NCTC клон 929: CCL 1, Американская коллекция типовых культур [АТСС], Манассас, Вирджиния, США; ЕСАСС No. 88102702, Европейская коллекция клеточных культур, Солсбери, Уилтшир SP4 0JG, Великобритания). Клеточные культуры должны быть свободными от микоплазмы.

D.2.2.2 Техническое оборудование

D.2.2.2.1 Инкубатор температура 37 °С, с увлажнением, 5 % СO ₂/воздух.

D.2.2.2.2 Шкаф с ламинарным потоком воздуха, стандарт: "биологическая опасность".

D.2.2.2.3 Водяная баня, температура 37 °С.

D.2.2.2.4 Инверсионный фазово-контрастный микроскоп.

D.2.2.2.5 Лабораторная горелка.

D.2.2.2.6 Центрифуга, снабженная микропланшетным ротором.

D.2.2.2.7 Лабораторные весы.

D.2.2.2.8 Фотометр для 96-луночных планшетов, оснащенный фильтром 450 нм (опорная длина волны 60 нм).

D.2.2.2.9 Встряхиватель для микротитрационных планшетов.

D.2.2.2.10 Счетчик клеток или гемоцитометр.

D.2.2.2.11 Устройство для пипетирования.

D.2.2.2.12 Пипетки, 8-канальные пипетки, блок разбавления.

D.2.2.2.13 Криопробирки.

D.2.2.2.14 Флаконы для тканевых культур или чашки Петри для тканевых культур.

D.2.2.2.15 96-луночные микротитрационные планшеты для тканевых культур.

D.2.2.3 Химические реагенты, среды и сыворотки

D.2.2.3.1 Минимальная эссенциальная среда "Игла" (MEM) без фенолового красного, без глутамина и без NaHCO ₃.

D.2.2.3.2 Фетальная сыворотка теленка (FCS).

D.2.2.3.3 Раствор трипсин/ЭДТА.

D.2.2.3.4 Фосфатно-буферный соляной раствор (ФБ).

D.2.2.3.5 ХТТ (2,3-бис[2-метокси-4-нитро-5-сульфофеник]-2Н-тетразолий-5-карбоксианилидная внутренняя соль).

D.2.2.3.6 МСФ (метосульфат феназина).

D.2.2.4 Стадия подготовки

D.2.2.4.1 Общая часть

Все растворы, стеклянная посуда и т.д. должны быть стерильными. Все процедуры следует проводить в условиях асептики и в стерильных условиях шкафа с ламинарным потоком воздуха (стандарта биологической опасности).

D.2.2.4.2 Среды

MEM (забуференная бикарбонатом натрия), дополненная (приводят конечные концентрации в MEM):

а) для замораживания:

- 20 % FCS,

- 7 % до 10 % DMSO;

b) для обычного культивирования:

- 10 % FCS,

- 4 мМ глутамина или глутамакса,

- 100 IU/мл пенициллина,

- 100 мг/мл стрептомицина.

Готовые среды следует хранить при температуре 4 °С не более 2 нед.

D.2.2.4.3 Раствор XTT/PMS

ХТТ растворяют в свежем виде при температуре от 56 °С до 60 °С MEM без фенолового красного при концентрации 1 мг/мл с помощью встряхивателя. Раствор стерилизуют фильтрацией через шприцевые фильтры (размер пор - 0,22 мкм). Раствор PMS добавляют к раствору ХТТ, готовят как раствор 5 мМ в ФБ и стерильно фильтруют через стерильный фильтр 0,22 мкм.

Раствор PMS добавляют к раствору ХТТ незадолго до использования в концентрации 25 мкм (5 мкл 5 мМ PMS/мл раствора ХТТ). Раствор XTT/PMS затем немедленно вводят в лунки с пробой.

D.2.2.4.4 Приготовление экстракта из пробы

Пробы экстрагируют в соответствии с ISO 10993-12, используя MEM без фенолового красного и с FBS.

D.2.3 Методы исследований

D.2.3.1 Общие положения

Информация о стандартных методах культивирования клеток приведены в [1].

D.2.3.2 Проверка качества пробы (I); положительный контроль (PC) и отрицательный контроль (NC)

Положительный и отрицательный контроли должны быть включены в каждое исследование цитотоксичности. В качестве положительных и отрицательных стандартных образцов рекомендуется использовать, например, ZDEC и ZDBC (см. примечания к 3.2 и 3.4).

D.2.3.3 Проверка качества пробы (II); контроль

Абсолютное значение оптической плотности OD ₄₅₀, полученное в контроле, показывает, выросли ли экспоненциально клетки в количестве 1·10 ⁴, посеянные на лунку, с нормальным временем удвоения в течение двух дней анализа.

Исследование отвечает критерию приемлемости, если средняя OD ₄₅₀ контролей 0,2.

Для проверки систематических ошибок при высевании клеток контроли помещают на левую (ряд 2) и на правую (ряд 11) стороны 96-луночного планшета (ряд 1 и ряд 12 не следует использовать; для схемы планшета - см. [1]).

Исследование отвечает критерию приемлемости, если левое и правое средние значения контролей не отличаются более чем на 15 % от среднего значения всех контролей.

Проверка на ошибки при посеве клеток также может быть выполнена путем осмотра каждого планшета под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в постоянстве количества клеток. Микроскопическая оценка устраняет необходимость в двух дублях контролей.

D.2.3.4 Проведение исследований

ВАЖНО - После размораживания начальной культуры клеток следует провести два или три пассажа клеток перед их использованием в исследовании.

В таблице D.1 приведен порядок проведения исследования на цитотоксичность с применением ХТТ-теста.

Первые сутки после выращивания клеток из замороженного сырья:

- культуры клеток удаляют из флаконов для культур путем ферментативного отслаивания (трипсин/ДТА) и центрифугируют клеточную суспензию (200 g, 3 мин). Затем клетки ресуспендируют в культуральной среде и клеточную суспензию устанавливают при плотности в 1·10 ⁵ клеток/мл. Используя мультиканальную пипетку, помещают 100 мкл только культуральной среды (контроль) в периферийные лунки 96-луночного микротитрационного планшета для тканевых культур (= контроли, см. [1]). В оставшиеся лунки помещают 100 мкл клеточной суспензии из расчета 1·10 ⁵ клеток/мл (= 1·10 ⁴ клеток/лунка);

- инкубируют клетки 24 ч (5 % СO ₂, 37 °С, > 90 % влажности), чтобы клетки сформировали полуконфлюэнтный монослой. Этот период инкубации обеспечивает восстановление клеток, адгезию и переход к фазе экспоненциального роста;

- осматривают каждый планшет под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в том, что рост клеток относительно равномерен по всему микротитрационному планшету. Данную проверку проводят для выявления ошибок.

Вторые сутки:

- после 24 ч инкубации удаляют культуральную среду из лунок;

- в лунку добавляют 100 мкл среды, содержащей либо соответствующую концентрацию экстракта пробы, либо отрицательный контроль, либо PC, либо исключительно контрольный экстрагент. Необходимо испытать по меньшей мере четыре разные концентрации экстракта исследуемой пробы или экстракта положительного контроля. Наибольшей концентрацией должен быть 100 %-ный экстракт, а другие концентрации должны быть размещены в пределах одного логарифмического диапазона. Для отрицательного контроля испытывают только 100 %-ный экстракт. Культуральную среду используют как контроль;

- инкубируют клетки 24 ч (5 % СO ₂, 37 °С, > 90 % влажности).

Третьи сутки:

- после 24 ч инкубации осматривают каждый планшет под фазово-контрастным микроскопом для определения систематических ошибок высевания клеток и характеристик роста клеток в присутствии экстракта и клеток контроля. Регистрируют изменения в морфологии клеток, связанные с цитотоксичностью экстракта исследуемой пробы, но не используют эти записи для вычисления какого-либо количественного измерения цитотоксичности. Нежелательные характеристики роста контрольных клеток могут означать ошибку эксперимента и могут быть причиной отказа от продолжения исследования.

После осмотра планшетов к каждой лунке добавляют 50 мкл раствора XTT/PMS. Затем планшеты инкубируют еще от 3 до 5 ч в инкубаторе при температуре 37 °С. Планшеты должны содержаться в темноте. Планшеты осторожно покачивают и аликвоту в 100 мкл переносят из каждой лунки в соответствующую лунку нового планшета. Затем этот планшет переносят на ридер микротитрационных планшетов, оснащенный фильтром 450 нм для считывания абсорбции (опорная длина волны 630 нм).

Таблица D.1 - Порядок проведения исследований на цитотоксичность с применением ХТТ-теста

Время, ч	Действие
00:00	Засеивают 96-луночные планшеты: 1·10 4 клеток/100 мкл культуральной среды MEM на лунку. Инкубируют (37 °С/5 % СO 2/22 до 26 ч)
24:00	Удаляют культуральную среду
24:00	Обрабатывают 4 концентрациями экстракта исследуемого образца в среде обработки (100 мкл) (необработанный контроль = среда обработки). Инкубируют (37 °С/5 % СO 2/24 ч)
48:00	Микроскопическая оценка морфологических изменений Добавляют 50 мкл раствора XTT/PMS. Инкубируют (37 °С/5 % СO 2/3 ч до 5 ч)
51:00	Покачивают планшет. Переносят 100 мкл из каждой лунки на новый планшет
51:30	Определяют абсорбцию при длине волны 450 нм (опорная длина волны - 630 нм)

D.2.4 Представление результатов

Полученные необработанные данные сохраняют в файл. Результаты представляют в форме таблицы, включая экспериментальные группы с предметом исследования, контролем и отрицательным и положительным контролями.

D.2.5 Обработка результатов

Уменьшение числа жизнеспособных клеток приводит к снижению общей деятельности митохондриальных дегидрогеназ в присутствии образца. Это снижение напрямую коррелирует с количеством образовавшегося оранжевого формазана регистрации оптической плотности раствора при длине волны 450 нм. Снижение жизнеспособности по сравнению с контролем вычисляют по формуле

,

(D.1)

где OD _450e - среднее значение измеренной оптической плотности 100 %-ного экстракта исследуемой пробы;

OD _450b - среднее значение измеренной оптической плотности контрольного экстрактанта.

Чем ниже значение жизнеспособности в процентах, тем выше цитотоксический потенциал объекта исследования.

Если жизнеспособность снижается до < 70 % от контрольного экстрактанта, объект исследования обладает цитотоксичностью. 50 %-ный экстракт исследуемой пробы должен обладать, по меньшей мере, такой же или более высокой жизнеспособностью, чем 100 %-ный экстракт. В противном случае исследование следует повторить.