Приложение С (справочное). Исследование на цитотоксичность с применением МТТ-теста

Приложение С
(справочное)

Исследование на цитотоксичность с применением МТТ-теста

С.1 Общие положения

Метод исследования основан на измерении жизнеспособности клеток через их метаболическую активность [9]. Желтый водорастворимый МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида] в процессе метаболизма в жизнеспособных клетках превращается в сине-фиолетовый формазан. Количество жизнеспособных клеток соответствует интенсивности цвета, определяемой фотометрическими измерениями после растворения формазана в спирте.

С.2 Проведение исследований

С.2.1 Основная процедура

Клетки L929 высевают в 96-луночные планшеты и поддерживают в культуре 24 ч ( 1 период удвоения) для формирования полуконфлуэнтного монослоя (см. ссылку [5] для дополнительной информации по процедуре культивирования). Затем в каждую лунку вносят исследуемое соединение в нескольких концентрациях. После 24 ч инкубации количество формазана определяют для каждой концентрации исследуемого вещества и сравнивают с контрольными культурами. Для каждой концентрации вычисляют степень ингибирования роста в процентах.

С.2.2 Материалы

С.2.2.1 Линия клеток

Клетки L-929 [NCTC клон 929: CCL 1, Американская коллекция типовых культур (АТСС), Манассас, Вирджиния, США; ЕСАСС No. 88102702, Европейская коллекция клеточных культур, Солсбери, Уилтшир SP4 0JG, Великобритания]. Клеточные культуры должны быть свободными от микоплазмы.

С.2.2.2 Техническое оборудование

С.2.2.2.1 Инкубатор, температура 37 °С, с увлажнением, 5 % СO ₂/воздух.

С.2.2.2.2 Шкаф с ламинарным потоком воздуха, стандарт: "биологическая опасность".

С.2.2.2.3 Водяная баня, температура 37 °С.

С.2.2.2.4 Инверсионный фазово-контрастный микроскоп.

С.2.2.2.5 Лабораторная горелка.

С.2.2.2.6 Центрифуга, снабженная микропланшетным ротором.

С.2.2.2.7 Лабораторные весы.

С.2.2.2.8 96-луночный планшетный фотометр, оснащенный фильтром 570 нм (основная длина волны 650 нм).

С.2.2.2.9 Встряхиватель для микротитрационных планшетов.

С.2.2.2.10 Счетчик клеток или гемоцитометр.

С.2.2.2.11 Устройство для пипетирования.

С.2.2.2.12 Пипетки, 8-канальные пипетки, блок разбавителя.

С.2.2.2.13 Криопробирки.

С.2.2.2.14 Флаконы для тканевых культур или чашки Петри для тканевых культур.

С.2.2.2.15 96-луночные микротитрационные планшеты для тканевых культур.

С.2.2.3 Химические реагенты, среды и сыворотки

С.2.2.3.1 Минимальная эссенциальная среда "Игла" (MEM) без фенолового красного, без глутамина и без NaHCO ₃.

С.2.2.3.2 Фетальная сыворотка теленка (FCS).

С.2.2.3.3 Раствор трипсин/EDTA.

С.2.2.3.4 Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).

С.2.2.3.5 МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида].

С.2.2.3.6 Изопропанол аналитической чистоты.

С.2.2.4 Стадия подготовки

С.2.2.4.1 Общая часть

Все растворы, стеклянная посуда и т.д. должны быть стерильными, и все процедуры следует проводить в условиях асептики и в стерильных условиях шкафа с ламинарным потоком воздуха (стандарта биологической опасности).

С.2.2.4.2 Среды

MEM (забуференная бикарбонатом натрия), дополненная (приводят финальные концентрации в MEM):

a) для замораживания:

- 20 % FCS,

- 7 % до 10 % DMSO;

b) для обычного культивирования:

- 10 % FCS,

- 4 мМ глутамина или глутамакса,

- 100 IU/мл пенициллина,

- 100 мg/мл стрептомицина.

Готовые среды следует хранить при температуре 4 °С не более 2 нед.

С.2.2.4.3 Раствор МТТ

МТТ растворяют в свежем виде в MEM без добавок и без фенолового красного при концентрации 1 мг/мл.

Раствор стерилизуют, используя шприцевые фильтры (размер пор 0,22 мкм). Раствор должен быть использован в тот же день.

С.2.2.4.4 Приготовление экстракта из исследуемой пробы

Исследуемые пробы экстрагируют в соответствии с ISO 10993-12.

С.2.3 Методы исследований

С.2.3.1 Общие положения

Информация о стандартных методах культивирования клеток приведена в [1].

С.2.3.2 Проверка качества пробы (I); положительный контроль и отрицательный контроль.

Положительный и отрицательный контроли должны быть включены в каждое исследование цитотоксичности. В качестве положительных и отрицательных стандартных образцов рекомендуется использовать, например, ZDEC и ZDBC (см. 3.2, примечание).

С.2.3.3 Проверка качества пробы (II); контрольный экстрагент

Абсолютная величина оптической плотности OD ₅₇₀, полученная в контроле, показывает, выросли ли экспоненциально клетки в количестве 1·10 ⁴, посеянные на лунку, с нормальным временем удвоения пробы в течение двух дней.

Исследование отвечает критерию приемлемости, если среднее значение OD ₅₇₀ контролей 0,2.

Для проверки систематических ошибок при высевании клеток контроли помещают на левую (ряд 2) и на правую (ряд 11) стороны 96-луночного планшета (ряд 1 и ряд 12 не следует использовать; для схемы планшета см. [1]).

Исследование отвечает критерию приемлемости, если левое и правое средние значения контролей не отличаются более чем на 15 % от среднего значения всех контролей.

Проверка на ошибки при посеве клеток также может быть выполнена путем осмотра каждого планшета под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в постоянстве количества клеток. Микроскопическая оценка устраняет необходимость в двух дублях контролей.

С.2.3.4 Проведение исследований

ВАЖНО - После размораживания начальной культуры клеток следует провести два или три пассажа клеток перед их использованием в исследовании.

В таблице С.1 приведен порядок проведения исследований.

Первые сутки после выращивания клеток из замороженного сырья:

- культуры клеток удаляют из флаконов для культур путем ферментативного отслаивания (трипсин/ЭДТА) и центрифугируют клеточную суспензию (200 g, 3 мин). Клетки затем ресуспендируют в культуральной среде и клеточную суспензию устанавливают при плотности в 1·10 ⁵ клеток/мл. Используя мультиканальную пипетку, помещают 100 мкл только культуральной среды (контроль) в периферийные лунки 96-луночного микротитрационного планшета для тканевых культур (= контроли, см. [1]). В оставшиеся лунки помещают 100 мкл клеточной суспензии из 1·10 ⁵ клеток/мл (= 1·10 ⁴ клеток/лунку);

- инкубируют клетки 24 ч (5 % СO ₂, 37 °С, > 90 % влажности), чтобы клетки сформировали полуконфлюэнтный монослой. Этот период инкубации обеспечивает восстановление клеток, адгезию и переход к фазе экспоненциального роста;

- осматривают каждый планшет под фазово-контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в том, что рост клеток относительно равномерен по всему микротитрационному планшету. Данную проверку проводят для выявления ошибок.

Вторые сутки:

- после 24 ч инкубации удаляют культуральную среду из лунок;

- в лунку добавляют 100 мкл среды, содержащей либо соответствующую концентрацию экстракта образца, либо отрицательный контроль, либо положительный контроль, либо исключительно среду (контроль). Необходимо исследовать по меньшей мере четыре разные концентрации экстракта исследуемого образца или экстракта положительного контроля. Наибольшей концентрацией должен быть 100 %-ный экстракт, а другие концентрации должны быть разумно размещены в пределах одного логарифмического диапазона. Для отрицательного контроля исследуют только 100 %-ный экстракт. Культуральную среду используют как контроль;

- инкубируют клетки в течение 24 ч (5 % СO ₂, 37 °С, > 90 % влажности).

Третьи сутки:

- после 24 ч инкубации осматривают каждый планшет под фазово-контрастным микроскопом для определения систематических ошибок высевания клеток и характеристик роста клеток в присутствии экстракта и клеток контроля. Регистрируют изменения в морфологии клеток, связанные с цитотоксичностью экстракта исследуемого образца, но не используют эти записи для вычисления какого-либо количественного измерения цитотоксичности. Нежелательные характеристики роста контрольных клеток могут означать ошибку эксперимента и могут быть причиной отказа от продолжения исследования.

После осмотра планшетов осторожно удаляют из них культуральную среду, что существенно с учетом того, что химические восстановители в экстракте также могут снизить действие МТТ, приводя к ложным отрицательным результатам. 50 мкл раствора МТТ (см. С.2.2.4.3) добавляют к каждой тестовой лунке и планшеты инкубируют еще 2 ч в инкубаторе при температуре 37 °С. Раствор МТТ удаляют и добавляют 100 мкл изопропанола к каждой лунке. Покачивают планшет и затем переносят его на ридер микротитрационных планшетов, оснащенный фильтром 570 нм для считывания абсорбции (опорная длина волны 650 нм).

Таблица С.1 - Порядок проведения исследования на цитотоксичность с применением МТТ-теста

Время, ч	Действие
00:00	Засеивают 96-луночные планшеты: 1 x 10 4 клеток/100 мкл культуральной среды MEM на лунку Инкубируют (37 °С/5 % СO 2/от 22 до 26 ч)
24:00	Удаляют культуральную среду
24:00	Обрабатывают 4 концентрациями экстракта исследуемой пробе в среде обработки (100 мкл) (необработанный контроль = среда обработки). Инкубируют (37 °С/5 % СO 2/24 ч)
48:00	Микроскопическая оценка морфологических изменений Удаляют культуральную среду. Добавляют 50 мкл раствора МТТ. Инкубируйте (37 °С/5 % СO 2/2 ч)
51:00	Удаляют раствор МТТ. Добавляют 100 мл изопропанола в каждую лунку. Покачивают планшет
51:30	Определяют абсорбцию при длине волны 570 нм (опорная длина волны 650 нм)

С.2.4 Представление результатов

Полученные данные сохраняют в файл необработанных данных. Результаты представляют в табличной форме, включая экспериментальные группы с предметом исследования, отрицательным и положительным контролями и с контролем экстрактанта.

С.2.5 Обработка результатов

Уменьшение количества жизнеспособных клеток приводит к снижению их метаболической активности в присутствии образца. Это снижение напрямую коррелирует с количеством образовавшегося сине-фиолетового формазана при регистрации оптической плотности раствора при длине волны 570 нм. Снижения жизнеспособности клеток по сравнению с контролем экстрактанта вычисляют по формуле

,

(С.1)

где OD _570e - среднее значение измеренной оптической плотности 100 % экстрактов исследуемой пробы;

OD _570b - среднее значение измеренной оптической плотности контролей.

Чем ниже значение жизнеспособности в процентах, тем выше цитотоксический потенциал объекта исследования.

Если жизнеспособность снижается до < 70 % от контрольного экстракта, объект исследования обладает цитотоксичностью. 50 %-ный экстракт исследуемой пробы должен обладать так же или более высокой жизнеспособностью, чем 100 %-ный экстракт. В противном случае исследование следует повторить.