Приложение А (справочное). Исследование на цитотоксичность методами с нейтральным красным (NRU)

Приложение А
(справочное)

Исследование на цитотоксичность методами с нейтральным красным (NRU)

А.1 Общие положения

Методы исследований основаны и описывают только те части приложения С [1], которые относятся к данному исследованию.

А.2 Проведение исследований

А.2.1 Общие положения

Клетки BALB/c 3Т3 высевают в 96-луночные планшеты и содержат в культуре 24 ч ( 1 период удвоения) для формирования полуконфлюэнтного монослоя (см. [5] для дополнительной информации по обеспечению жизнеспособности клеток и процедуры культивирования). Затем в лунки с клетками вносят исследуемое вещество в нескольких концентрациях. После инкубации клеток с исследуемым веществом (время воздействия) в течение 24 ч определяют концентрацию нейтрального красного в клетках для каждой концентрации исследуемого вещества и сравнивают с результатом, определенным в контрольных культурах. Для каждой концентрации исследуемого вещества вычисляется процент задержки роста (процент жизнеспособных клеток), если экстракт оказывает цитотоксический эффект на клетки. Значение IC ₅₀ (т.е. концентрация, снижающая содержание нейтрального красного на 50 %) рассчитывается по зависимости концентрации и выражается в процентах разбавления экстракта. Исходный экстракт обозначается как 100 % экстракт.

А.2.2 Материалы

А.2.2.1 Линия клеток

Клетки линии BALB/c 3Т3, клон 31 [например, ЕСАСС86110401, Европейская коллекция клеточных культур, Солсбери, Уилтшир SP4 0JG, Великобритания; CCL-163, Американская коллекция типовых культур (АТСС), Манассас, Вирджиния, США] и JCRB 9005, приготовленные из CCL-163 (АТСС), Банк научно-исследовательских ресурсов, Осака, Япония.

А.2.2.2 Оборудование

А.2.2.2.1 Инкубатор, температура 37 °С, с увлажнением, 5 % СO ₂/воздух [альтернативно, при отсутствии подходящего буфера в клеточной культуральной среде можно применить 7,5 % СO ₂/воздух, потому что клетки крайне чувствительны к изменениям в рН; тем не менее в большинстве лабораторий чаще используют 5 %, a HEPES (кислоту) добавляют для качественной буферизации].

А.2.2.2.2 Шкаф с ламинарным потоком воздуха, стандарт: "биологическая опасность".

А.2.2.2.3 Водяная баня, температура 37 °С.

А.2.2.2.4 Инверсионный фазово-контрастный микроскоп.

А.2.2.2.5 Лабораторная горелка.

А.2.2.2.6 Центрифуга, как вариант, снабженная микропланшетным ротором.

А.2.2.2.7 Лабораторные весы.

А.2.2.2.8 Фотометр для 96-луночных планшетов, оснащенный фильтром 540 нм.

А.2.2.2.9 Встряхиватель для микротитрационных планшетов.

А.2.2.2.10 Счетчик клеток или гемоцитометр.

А.2.2.2.11 Устройство для пипетирования.

А.2.2.2.12 Пипетки, 8-канальные пипетки, блок разбавления.

А.2.2.2.13 Криопробирки.

А.2.2.2.14 Колбы для тканевых культур, 80 см ², 25 см ².

А.2.2.2.15 96-луночные микротитрационные планшеты для тканевых культур.

А.2.2.3 Химические реагенты, среды и сыворотки

А.2.2.3.1 Модифицированная по Дульбекко среда "Игла" (DMEM), без L-глутамина.

А.2.2.3.2 L-глутамин, 200 мМ или глутамакс.

А.2.2.3.3 Сыворотка новорожденного теленка (NBCS).

ВАЖНО - Запрещено использовать фетальную (эмбриональную) сыворотку теленка (FCS). FCS вызывает сильное снижение OD из-за образования вакуолей в клетках.

Из-за вариаций партий NBCS необходимо сначала проверить партию на свойства стимулировать рост клеток 3Т3 (период удвоения 20 до 25 ч) и затем оставить достаточное количество NBCS.

А.2.2.3.4 Раствор трипсин/EDTA.

А.2.2.3.5 Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), без Са ²⁺ и Mg ²⁺ (для трипсинизации).

А.2.2.3.6 HEPES (см. А.2.2.2.1).

А.2.2.3.7 PBS с Са ²⁺ и Mg ²⁺ (для промывания).

А.2.2.3.8 Раствор пенициллин/стрептомицин.

А.2.2.3.9 Нейтральный красный (NR).

А.2.2.3.10 Диметилсульфоксид (DMSO), аналитической чистоты.

А.2.2.3.11 Этанол (EtOH), аналитической чистоты.

А.2.2.3.12 Ледяная уксусная кислота, аналитической чистоты.

А.2.2.3.13 Дистиллированная вода или любая очищенная вода, пригодная для клеточного культивирования.

А.2.2.4 Стадия подготовки

А.2.2.4.1 Общие требования

Все растворы (кроме исходного раствора NR, среды NR и десорбирующего NR раствора), стеклянная посуда и т.д. должны быть стерильными. Все процедуры следует проводить в условиях асептики и в стерильных условиях шкафа с ламинарным потоком воздуха (стандарта биологической опасности).

А.2.2.4.2 Среды

DMEM (забуференная бикарбонатом натрия), дополненная (приводят рабочие концентрации DMEM).

a) Для замораживания:

- 20 % NBCS;

- от 7 % до 10 % DMSO.

b) Для обычного культивирования:

- 10 % NBCS;

- 4 мМ L-глутамина или глутамакса;

- 100 IU/мл пенициллина;

- 100 мг/мл стрептомицина;

- 20 мМ HEPES.

c) Для обработки исследуемыми образцами:

- 5 % NBCS;

- 4 мМ глутамина или глутамакса;

- 100 IU/мл пенициллина;

- 100 мг/мл стрептомицина;

- 20 мМ HEPES.

Готовые среды следует хранить при температуре 4 °С не более 2 нед.

Концентрация сыворотки в среде обработки сокращена до 5 %, так как белки сыворотки могут скрыть токсичность исследуемого вещества. Сыворотку полностью не исключают, так как рост клеток заметно сокращается при ее отсутствии.

А.2.2.4.3 Исходный раствор нейтрального красного (NR):

- 0,4 г красителя NR;

- 100 мл Н ₂O.

Раствор следует приготовить предварительно перед использованием и хранить в темноте при комнатной температуре не более 2 мес. Коммерчески приготовленные исходные растворы нейтрального красного могут быть использованы до истечения их срока годности при хранении согласно этикетке.

А.2.2.4.4 Среда с нейтральным красным (NR):

- 1 мл исходного раствора NR;

- 79 мл DMEM.

Среда с NR должна быть инкубирована за ночь при температуре 37 °С и центрифугирована при 600 g на 10 мин (для удаления кристаллов NR) перед добавлением к клеткам. Альтернативные процедуры (например, миллипоровое фильтрование) могут быть применены при условии гарантии, что среда NR не содержит кристаллов. Аликвоты среды с NR следует поддерживать при температуре 37 °С (например, на водяной бане) перед добавлением к клеткам. Они должны быть использованы в течение 30 мин после приготовления и в течение 15 мин после удаления из хранения при температуре 37 °С.

А.2.2.4.5 Раствор этанол/уксусная кислота (десорб NR):

- 1 % раствора ледяной уксусной кислоты;

- 50 % этанола;

- 49 % Н ₂O.

Раствор следует готовить непосредственно перед использованием и хранить не более 1 ч.

А.2.2.4.6 Приготовление экстракта из пробы

Исследуемые пробы экстрагируют в соответствии с требованиями ISO 10993-12.

А.2.3 Методы исследований

А.2.3.1 Общие положения

Информация о стандартных методах культивирования клеток приведена в приложении С [1].

А.2.3.2 Проверка качества пробы (I); положительный контроль (PC)

Положительный контроль должен быть включен в каждое исследование цитотоксичности.

Как показал многолетний опыт внутри- и межлабораторных повторных исследований, из многих химических веществ лаурилсульфат натрия (SLS, CAS # 151-21-3) является одним из наиболее часто применяемых в качестве PC. Рекомендуется испытывать SLS в диапазоне четырех концентраций: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 мг/мл.

Справочное среднее значение SLS (IС ₅₀) (Spielmann et. al., 1991 [10]) равно 0,093 мг/мл, с доверительным интервалом при 95 % от 0,070 до 0,116 мг/мл.

Исследование отвечает критерию приемлемости, если IС ₅₀ для SLS находится в рамках 95 % надежности.

В качестве положительных и отрицательных стандартных образцов рекомендуется использовать, например, ZDEC и ZDBC (см. сноску 1) на с. 2 и 3.2 и 3.4)].

А.2.3.3 Проверка качества пробы (II); контрольный экстрагент

Абсолютная величина (без относительно контроля) оптической плотности [OD ₅₄₀ для исследования на цитотоксичность с нейтральном красным (NRU)], полученная в контроле (клетки, не взаимодействующие с исследуемым веществом), показывает, выросли ли экспоненциально клетки в количестве 1·10 ⁴, посеянные на лунку, с нормальным временем удвоения в течение двух дней пробы.

Исследование отвечает критерию приемлемости, если среднее значение OD ₅₄₀ контролей 0,3.

Для проверки систематических ошибок высевания клеток контроли обрабатывают при условиях экстракции (см. А.2.2.4.6) и помещают на левую (ряд 2) и на правую (ряд 11) стороны 96-луночного планшета (ряд 1 и ряд 12 не следует использовать; для схемы планшета, см. приложение Е [1]).

Исследование отвечает критерию приемлемости, если левое и правое средние значения контролей не отличаются более чем на 15 % от среднего значения всех контролей.

Проверки на ошибки высевания клеток также можно проводить путем осмотра каждого планшета под фазовым контрастным микроскопом для того, чтобы убедиться в постоянстве количества клеток. Микроскопическая оценка устраняет необходимость в двух рядах контролей.

А.2.3.4 Проверка зависимости "концентрация-реакция"

IС ₅₀, полученный из кривой "концентрация-реакция", должен быть обоснован по меньшей мере двумя или, если возможно, тремя реакциями между 10 % и 90 % ингибирования NRU. Если этого не происходит и коэффициент прогрессирования концентрации можно уменьшить, то следует прекратить исследование и повторить его с меньшим коэффициентом прогрессирования.

А.2.3.5 Концентрации экстрактов из исследуемой пробы

А.2.3.5.1 Определение диапазона концентраций

Исследуют восемь концентраций экстракта из исследуемой пробы путем разведения исходного раствора в достаточно широком диапазоне. Если уменьшение жизнеспособности клеточной культуры при наивысшей концентрации экстракта образца составляет 30 % или менее, то образец должен быть признан нецитотоксичным и дальнейшие исследования не нужны.

А.2.3.5.2 Проведение исследования

Зависящий от угла наклона кривой "концентрация - ответ", вычисленного для найденного диапазона концентраций, фактор растворения в сериях концентрации основного исследования должен быть еще меньше (например,  = 1,47). Разделяют соответствующий диапазон концентраций (между 10 % и 90 % эффекта) по меньшей мере тремя точками отмеченного эффекта, избегая слишком многих нецитотоксичных и/или 100 %-ных цитотоксичных концентраций.

А.2.3.6 Проведение исследования

ВАЖНО - После размораживания начальной культуры клеток проводят два или три пассажа клеток перед их использованием в исследовании.

В таблице А.1 приведен порядок проведения исследования 3Т3-клетками на цитотоксичность с NRU.

Первые сутки:

- готовят клеточную суспензию из 1·10 ⁵ клеток/мл в культуральной среде. Используя многоканальную пипетку, распределяют 100 мкл культуральной среды только в периферийные лунки 96-луночного микротитрационного планшета для тканевых культур (тоже делают для контрольных планшет, см. [1]). В оставшиеся лунки помещают 100 мкл клеточной суспензии из 1·10 ⁵ клеток/мл (или 1·10 ⁴ клеток/лунку). Готовят один планшет для исследуемого экстракта, один планшет для PC и один планшет для отрицательного контрольного образца, при их использовании;

- инкубируют клетки 24 ч (5 % СO ₂, 37 °С, > 90 % влажности), чтобы клетки сформировали полуконфлюэнтный монослой. Этот период инкубации обеспечивает нормализацию состояния клеток, адгезию и переход к фазе экспоненциального роста;

- осматривают каждый планшет под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться в том, что рост клеток относительно равномерен по всему микротитрационному планшету. Данную проверку проводят для выявления ошибок.

Вторые сутки:

- после 24 ч инкубации удаляют культуральную среду из лунок;

- в каждую лунку добавляют 100 мкл среды, содержащей либо соответствующую концентрацию экстракта из испытуемой пробы, либо отрицательный контроль, либо PC, либо исключительно среду (контроль);

- инкубируют клетку 24 ч (5 % СO ₂, 37 °С, > 90 % влажности).

Третьи сутки:

- после 24 ч инкубации осматривают каждый планшет под фазовым контрастным микроскопом для определения систематических ошибок высевания клеток и характеристик роста клеток, обработанных экстрактом, и клеток контроля. Регистрируют изменения в морфологии клеток из-за цитотоксических эффектов экстракта исследуемого образца, но не используют эти записи для вычисления наивысшей переносимой дозы (HTD) или другого количественного измерения цитотоксичности. Нежелательные характеристики роста клеток в контроле могут указывать на ошибку и быть причиной прекращения исследования.

Исследование на цитотоксичность с нейтральным красным (NRU) базируется на методе Эллен Боренфройнд (см. [3]). Поглощение нейтрального красного NR лизосомами/эндосомами и вакуолями живых клеток используется как количественное показание количества и жизнеспособности клеток;

- промывают клетки 150 мкл подогретого PBS, удаляют промывочный раствор легким постукиванием и добавляют 100 мкл среды нейтрального красного NR, затем инкубируют при температуре 37 °С в увлажненной атмосфере 5 % СO ₂ в течение 3 ч;

- после инкубации удаляют среду NR и промывают клетки 150 мкл PBS;

- полностью удаляют PBS (например, центрифугируют перевернутый планшет);

- добавляют 150 мкл раствора для десорбции NR (этанол/уксусная кислота) во все лунки, включая контроли;

- быстро встряхивают микротитрационный планшет на встряхивателе для микротитрационных планшетов в течение 10 мин до тех пор, пока NR не экстрагируется из клеток и не сформирует гомогенный раствор;

- измеряют абсорбцию полученного окрашенного раствора при длине волны 540 нм на ридере для микротитрационных планшетов, используя контрольный экстрактант в качестве стандарта для сравнения. Сохраняют необработанные данные в компьютерном формате (например, ASCII, TXT, XLS), подходящем для дальнейшего анализа кривой "концентрация-отклик" и вычисления IС ₅₀.

А.2.4 Анализ данных

Расчет жизнеспособности клеток, обозначаемой NRU, проводят для каждой концентрации экстракта из пробы путем использования среднего значения NRU шести повторных значений на исследуемую концентрацию экстракта. Это значение сравнивают со средним NRU всех контрольных значений (если контроли отвечают критерию приемлемости). Относительную жизнеспособность клеток затем выражают как процент от значений выживаемости клеток в контроле. При возможности, восемь концентраций каждого исследуемого экстракта должны быть в диапазоне значений от отсутствия эффекта до полного ингибирования жизнеспособности клеток.

Таблица А.1 - Порядок проведения исследования с 3Т3-клетками на цитотоксичность NRU

Время, ч	Действие
00:00	Засеивают 96-луночные планшеты: 1·10 4 клеток/100 мл культуральной среды DMEM на лунку. Инкубируют (37 °С/5 % СO 2/22 до 24 ч)
24:00	Удаляют культуральную среду
24:00	Обрабатывают восемь концентраций экстракта исследуемого образца в среде обработки (100 мкл) (контроль = среда обработки). Инкубируют (37 °С/5 % СO 2/24 ч)
48:00	Микроскопическая оценка морфологических изменений Удаляют среду обработки. Промывают один раз 150 мкл PBS. Добавляют 100 мкл среды NR. Инкубируют (37 °С/5 % СO 2/3 ч)
51:00	Удаляют среду NR. Промывают один раз с 150 мкл PBS. Добавляют 150 мкл десорбирующего фиксатора NR (этанол/раствор уксусной кислоты)
51:40	Встряхивают планшет в течение 10 мин
51:50	Определяют NR при длине волны 540 нм (т.е. жизнеспособность клеток)

Если относительная жизнеспособность клеток для наивысшей концентрации экстракта образца (100 %-ный экстракт) меньше, чем 70 % от контрольной группы, то концентрацию исследуемого химического вещества, отражающую 50 %-ное ингибирование жизнеспособности клеток (т.е. IС ₅₀), определяют по кривой "концентрация - отклик".

Это можно сделать, применив:

- либо ручной графический метод подбора кривой.

Рекомендуется применение вероятностной сетки со шкалами "Х = лог" и "Y = пробит", так как во многих случаях функция "концентрация - отклик" становится почти линейной в соответствующем диапазоне. Для этого метода также подходит полулогарифмическая бумага;

- либо любую подходящую нелинейную процедуру регрессии (предпочтительно функция Хилла ¹⁾ или логистическая регрессия) к данным "концентрация - отклик".

-----------------------------

¹⁾_{Функции Хилла монотонны и сигмоидальной формы и представляют приемлемую модель для многих кривых "доза - отклик".}

-----------------------------

Перед использованием IС ₅₀ для дальнейших вычислений качество соответствия следует должным образом проверить.

Если относительная жизнеспособность клеток для наивысшей концентрации экстракта образца (100 %-ный экстракт) 70 % от контрольной группы, то материал признают нецитотоксичным.