Приложение В (справочное). Исследование на цитотоксичность по колониеобразованию

Приложение В
(справочное)

Исследование на цитотоксичность по колониеобразованию

В.1 Общие положения

Методы исследований основаны на части I исследования на цитотоксичность руководства по основным биологическим исследованиям медицинских материалов и изделий (см. [2]).

Примечание - В данном приложении приведены только сведения из разделов Части I, относящиеся к исследованию цитотоксичности.

В.2 Проведение исследований

В.2.1 Основная процедура

Клетки V79 высевают в шестилуночные планшеты и поддерживают в культуре 24 ч до начала роста в логарифмической фазе. Затем в каждую лунку вносят исследуемое соединение с разверткой по концентрации. Планшеты инкубируют шесть дней для создания достаточно крупных для подсчета колоний. Колонии фиксируют метанолом, окрашивают раствором Гимза и подсчитывают. Если экстракт оказывает цитотоксический эффект, вычисляют IС ₅₀ (концентрация с ингибирующей эффективностью культуры клеток до 50 %) и выражают как процент экстракта.

В.2.2 Материал

В.2.2.1 Линия клеток

Клетки V79 (JCRB 0603, Банк научно-исследовательских ресурсов, Осака, Япония, доступны из других банков клеток в США и ЕС).

Примечание - Рекомендуются клетки V79, так как они формируют большие и четкие колонии.

В.2.2.2 Техническое оборудование

В.2.2.2.1 Инкубатор, температура 37 °С, увлажненный, 5 % СO ₂/воздух.

В.2.2.2.2 Шкаф с ламинарным потоком воздуха, стандарт: "биологическая опасность".

В.2.2.2.3 Водяная баня, температура 37 °С.

В.2.2.2.4 Инверсионный фазово-контрастный микроскоп.

В.2.2.2.5 Стереомикроскоп.

В.2.2.2.6 Лабораторная горелка.

В.2.2.2.7 Лабораторные весы.

В.2.2.2.8 Счетчик клеток или гемоцитометр.

В.2.2.2.9 Устройство для пипетирования.

В.2.2.2.10 Пипетки.

В.2.2.2.11 Флаконы для тканевых культур, 75; 25 см ² или чашка для тканевых культур диаметром 100 мм.

В.2.2.2.12 Шестилуночные микротитрационные планшеты для тканевых культур.

В.2.2.3 Химические вещества, среды и сыворотки

В.2.2.3.1 Минимальная эссенциальная среда "Игла" (MEM), содержащая сбалансированный солевой раствор "Игла".

В.2.2.3.2 Фетальная сыворотка теленка (FCS).

Примечание - Из-за вариаций между партиями FCS необходимо сначала проверить партию на свойства стимуляции роста с клетками V79 и затем оставить достаточное количество FCS.

В.2.2.3.3 Раствор трипсин/EDTA.

В.2.2.3.4 Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), без Са ²⁺ и Mg ²⁺ (для трипсинизации).

В.2.2.3.5 Раствор пенициллин/стрептомицин.

В.2.2.3.6 Диметилсульфоксид (DMSO) аналитического класса.

В.2.2.3.7 Метанол аналитического класса.

В.2.2.3.8 Раствор Гимза.

В.2.2.3.9 Фосфатно-буферный раствор.

В.2.2.3.10 Дистиллированная вода или любая очищенная вода, пригодная для клеточного культивирования.

В.2.2.3.11 Бикарбонат натрия.

В.2.2.3.12 L-глутамин.

В.2.2.3.13 MEM раствор неосновных аминокислот.

В.2.2.3.14 Пируват натрия, 100 mМ.

В.2.2.4 Стадия подготовки

В.2.2.4.1 Общая часть

Все растворы (кроме раствора Гимза), стеклянная посуда и т.д. должны быть стерильными, и все процедуры следует проводить в условиях асептики и в стерильных условиях вытяжного шкафа с ламинарным потоком воздуха (стандарт биологической опасности).

В.2.2.4.2 Среды

1000 мл MEM "Игла" дополняют следующим образом:

a) для замораживания и обычного культивирования используют среду с 10 % FCS (MEM 10):

- 111 мл FCS,

- 2,2 г бикарбоната натрия,

- 0,292 г L-глутамина;

b) для экстракции и обработки используют среду с 5 % FCS (MEM 05):

- 53,5 мл FCS,

- 5 мл MEM раствор неосновных аминокислот,

- 10 мл пирувата натрия, 100 мМ,

- 0,292 г L-глутамина,

- 2,2 г бикарбоната натрия.

Готовые среды следует хранить при температуре 4 °С не более 1 мес.

Концентрация сыворотки в среде обработки сокращена до 5 %, так как белки сыворотки могут скрыть токсичность исследуемого вещества. Сыворотку не исключают полностью, так как рост клеток заметно сокращается при ее отсутствии. Подходящее количество антибиотиков может быть добавлено в описанную выше среду, если они не оказывают неблагоприятного воздействия на пробу.

В.2.2.4.3 5 %-ный раствор Гимза:

- 5 мл раствора Гимза;

- 95 мл любой фосфатно-буферного раствор с рН от 6,5 до 7,5.

Раствор следует приготовить непосредственно перед использованием.

В.2.2.4.4 Приготовление экстракта из исследуемой пробы

Исследуемую пробу экстрагируют в соответствии с ISO 10993-12, но рекомендуется, чтобы соотношение площади поверхности экстрагируемого образца к объему экстрактанта было 6 см ²/мл, а массы к объему экстрактанта - 0,1 г/мл (см. [6], [7], [11]).

Экстракт отделяется декантацией, является 100 %-ым экстрактом, который разбавляют средой МЕМ05 для получения различных процентных соотношений разбавленного экстракта.

В.2.3 Методы исследований

В.2.3.1 Общие положения

Информация об установленных методах клеточных культур приведена в приложении С и [1].

В.2.3.2 Проверка качества пробы (I); положительный контроль и отрицательный контроль

Положительный и отрицательный контрольные образцы должны быть включены в каждое исследование цитотоксичности. В качестве положительных и отрицательных контрольных образцов рекомендуется использовать, например, ZDEC и ZDBC (см. 3.2, примечание).

Следующий критерий приемлемости следует использовать для ZDEC и ZDBC:

a) IС ₅₀ для ZDEC не должен превышать 7 %;

b) IС ₅₀ для ZDBC не должен превышать 80 %.

В.2.3.3 Проверка качества пробы (II); контрольный экстрагент

Исследование отвечает критерию приемлемости, если среднее число колоний в контроле составляет по меньшей мере 70 % от числа клеток, высеянных на лунку.

В.2.3.4 Проверка зависимости "концентрация - отклик"

IС ₅₀, полученный по кривой "концентрации - отклик", должен быть подтвержден, по меньшей мере, значениями двух или, если возможно, трех реакций в диапазоне от 10 % до 90 % ингибирования контроля. Если этого не происходит и коэффициент прогрессирования концентрации можно уменьшить, то исследование прекращают и проводят его повторно с меньшим коэффициентом прогрессирования.

В.2.3.5 Концентрации экстрактов из испытуемой пробы

В.2.3.5.1 Определение диапазона концентраций

Исследуют четыре концентрации экстракта пробы путем разведения исходного раствора постоянным фактором, покрывая широкий диапазон, например 1  1/10 1/100 1/1000. Если снижение жизнеспособности клеточной культуры при наивысшей концентрации экстракта образца составляет 30 % или менее, то материал должен быть признан нецитотоксичным и дальнейшие исследования не нужны.

В.2.3.5.2 Проведение исследования

В зависимости от угла наклона кривой "концентрация-отклик", вычисленной при нахождении диапазона, фактор растворения/концентрации в сериях концентрации основного исследования должен быть меньше. По возможности покрывают соответствующий диапазон концентрации (между 10 % и 90 % эффекта) по меньшей мере тремя точками измеренного отклика, избегая слишком многих нецитотоксичных и/или 100 %-ных цитотоксичных концентраций.

В.2.3.6 Проведение исследования

ВАЖНО - После размораживания начальной культуры клеток следует провести два или три пассажа клеток перед их использованием в исследовании.

Первые сутки:

- готовят клеточную суспензию из 33,3 клеток/мл в среде МЕМ05. Помещают 3 мл суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета.

Вторые сутки:

- после 24 ч инкубации удаляют культуральную среду из каждой лунки. Добавляют 2 мл 100 %-ного или разведенного экстракта, приготовленного со средой МЕМ05. Исследуют каждую концентрацию три раза. Инкубируют в инкубаторе еще шесть дней.

Восьмые сутки:

- удаляют среду обработки из каждой лунки, тщательно промывают лунки ФБ, фиксируют колонии метанолом, окрашивают их 5 %-ным раствором Гимза и определяют число колоний в каждой лунке.

В.2.3.7 Обработка результатов

Обработка результатов:

- осматривают лунки при помощи стереомикроскопа и определяют число колоний, состоящих из 50 или более клеток в каждой лунке;

- регистрируют число колоний в лунке;

- определяют среднее число колоний для каждой концентрации экстракта;

- делят это число на число, полученное от контрольной группы, и выражают коэффициент (эффективность культивирования, ЭК РЕ) в процентах;

- если эффективность культивирования для наивысшей концентрации экстракта образца (100 %-ный экстракт) менее чем 70 % контрольной группы, то материал признают потенциально цитотоксичным и цитотоксичность исследуемых образцов выражают со значением IС ₅₀ как процентное соотношение;

- IС ₅₀ (концентрация, ингибирующая ЭК РЕ до 50 %) вычисляют как дозу с 50 %-ной относительной степенью выживания, определяемую от линии, которая проходит через дозу с более высоким выживанием, и дозу с выживанием менее 50 %;

- если эффективность культивирования  70 % контрольной группы, то материал признают нецитотоксичным.

Примечание - Если эффективность культивирования при наивысшей концентрации находится между 50 % и 70 %, то допускается не вычислять значение IС ₅₀ при наивысшей концентрации.

В.2.4 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен содержать сведения в соответствии с разделом 9, в который дополнительно включают следующее:

a) контроль ЭК РЕ в заданных условиях;

b) все данные исследования, включая число колоний, кривые ингибирования формирования колоний, и, по возможности, значения IС ₅₀, полученные для исследуемых проб.