Приложение D (справочное). Справочная информация о методах кожной сенсибилизации

Приложение D
(справочное)

Справочная информация о методах кожной сенсибилизации

Сенсибилизация у человека наступает после однократного или многократного накожного воздействия, инициируется и запускается компонентами иммунной системы. Сначала гаптен (химическое вещество) должен проникнуть сквозь кожу. Затем он вступает в реакцию с белками кожи для формирования иммуногенных комплексов. Клетки Лангерганса на эпидермальной/дермальной границе вырабатывают антиген на специфические лимфоциты, которые затем активируются для инициации иммунных ответов. Небольшой процент этих лимфоцитов является клетками долгосрочной памяти, которые служат основными активаторами в провокационной фазе. Таким образом, последующие повторные воздействия могут привести к негативным реакциям, которые сопровождаются выбросом лимфокинов активированными лимфоцитами и другими воспалительными клетками, привлеченными в область поражения.

В 1895 г. Ядассон, используя метод аппликаций, обнаружил у клинического пациента контактную аллергию на ртуть. Этот новаторский подход предоставил научную базу для последующих исследований, направленных на диагноз и прогноз контактной аллергии у человека и животных. Развитие перспективных/прогнозирующих исследований для оценки сенсибилизирующего потенциала химикатов последовало за новаторской работой Лэндстайнера и Чейза [11], которые обосновали использование морских свинок для изучения сенсибилизации кожи.

В 1969 г. Магнуссон - Клигман [12] опробовали множество вариантов исследований на морских свинках и предложили процедуру максимизации на морских свинках (GPMT), основанную на внутрикожных инъекциях (с полным адъювантом Фрейнда [FCA] или без него) и на последующих местных аппликациях исследуемого материала на тот же участок. Данный метод исследования требует предварительной обработки исследуемого участка, если исследуемый материал не является раздражителем. Как правило, он достоверно обнаруживает слабые сенсибилизаторы, так как понятие "слабый" включает нулевую вероятность положительных реакций. Этот чувствительный метод широко используется. Применение полного адъюванта Фрейнда повышает чувствительность метода исследования и в некоторых случаях может переоценить сенсибилизирующий потенциал испытуемого соединения.

В 1965 г. Бюлер (Buehler) [7] предложил использование закрытых аппликаций для обеспечения окклюзии как метод оптимизации воздействия и приближения к условиям процедур, используемых на человеке (Human Repeat Insult Patch Test, HRIPT). Высказывалось предположение, что методика окклюзионной аппликации является чувствительной и точно прогнозирует средние и сильные сенсибилизаторы, таким образом предотвращая вероятность негативных реакций у человеческих моделей при повторной накожной пробе (Human Repeat Insult Patch Test, HRIPT). Представленные данные показали преимущества окклюзии по сравнению с внутрикожными инъекциями и местным применением открытого типа. Стимуляция иммунной системы адъювантами не использовалась. Данный метод признан достаточно чувствительной процедурой для определения наиболее слабых сенсибилизаторов и доказан как достаточно гибкий для использования в процедуре оценки риска. Тем не менее исследование закрытой аппликацией [исследование Бюлера (Buehler)] менее чувствительно по сравнению с методом GPMT [9].

Эти два исследования, метод закрытой аппликации в Соединенных Штатах Америки и метод максимизации в Европе, наиболее часто использовались для оценки безопасности. Результаты сенсибилизирующих проб на морских свинках зависят от многих факторов, связанных с животными и с техническими аспектами, что объясняет различия в результатах исследований разных лабораторий, например: линия животных, их пол, возраст, окружающие условия исследования, исследуемый участок на животном, метод удаления шерсти (стрижка/бритье или химическая депиляция), тип конфигурации аппликации, количество исследуемого материала, качество окклюзии, время воздействия и считывание тканевого ответа. Использованы и изучены многочисленные исследования, и у каждого из них появились сторонники. В настоящий момент существует несколько методик, признанных приемлемыми в нормативных целях при условии, что методика отражена документально надлежащим образом и обоснована исследователем. Во всех случаях процедуры следует проводить в соответствии с первоисточником. Список других исследований приведен ниже.

В монографии [8] приведена актуальная информация по исследованию кожной сенсибилизации:

1) метод с использованием полного адъюванта Фрейнда;

2) метод с использованием разделенного адъюванта;

3) метод открытых накожных аппликаций;

4) метод оптимизации Мауера;

5) тест на подушечках стопы морских свинок;

6) кумулятивный метод с увеличением степени контакта;

7) скарификационный метод (с адъювантом и аппликациями);

8) метод исследования на ушах мыши.

Местная проба на лимфатическом узле мыши (LLNA) предпочтительнее, чем GPMT и исследование закрытой аппликацией Бюлера для идентификации опасности химических веществ. LLNA принята OECD в 2010 г. как самостоятельная альтернатива существующим исследованиям на морских свинках и как метод улучшения обращения с животными [33]. Проба LLNA апробирована для определения сенсибилизирующего действия химических веществ [39], [40].

Научной базой для исследования является измерение введенного 3Н-метил-тимидина в лимфоциты дренирующих лимфатических узлов мыши под местным воздействием испытуемой пробы как показатель сенсибилизации. Это исследование не включает провокационную фазу. Конечная точка - индекс стимуляции (ИС), означающий соотношение введенного тимидина в лимфатические узлы животных, получивших дозу воздействия, с количеством тимидина, введенного в лимфатические узлы контрольной группы. Исследование является положительным, когда индекс стимуляции превышает 3 (SI > 3). Внутри- и межлабораторная оценки LLNA показали воспроизводимое соотношение "доза-ответ" внутри и между лабораториями [16], [17], [21], [25], [26], [28] и [32]. Тем не менее сообщалось о трудностях в различии между раздражающими и аллергенными веществами при использовании LLNA [18], [25] и [28]. Таким образом, LLNA может давать ложноположительные результаты с раздражителями и завышать аллергенность веществ, имеющих и раздражающие, и аллергенные свойства [16]. Однако у LLNA есть преимущества по сравнению с пробами на морских свинках из-за более короткой продолжительности исследования, более объективной конечной точки, меньшего объема требуемого испытуемого вещества, а также это исследование не включает инъекции полного адъюванта Фрейнда. Возможны усовершенствования методики исследования путем использования анализа маркеров активации клеток и цитометрии потока [23], [24]. Не установлено, могут ли они быть внедрены на практике в стандартные протоколы LLNA для обычной токсикологии. С другой стороны, LLNA ограничивает выбор испытуемых экстрактов; в большинстве исследований использовалась смесь ацетона и оливкового масла. Недавнее исследование демонстрирует вариабельность результатов с применением разных испытуемых экстрактов [27]. Кроме того, при использовании LLNA невозможно изучать провокационную фазу или конфигурации перекрестной реактивности, так как животных умерщвляют после индукции до забора лимфатических узлов.

Проба подколенного лимфатического узла (PLNA), использующая подкожное введение в подушечку стопы [19], [22], [31], является альтернативой пробе на лимфатическом узле. В данной пробе кроме прямого измерения активации лимфатического узла возможно применение антигенов-репортеров для дальнейшего прояснения иммуномодуляции, вызванной иссл