Приложение В (справочное). Метод приготовления экстрактов из полимерных исследуемых образцов

Приложение В
(справочное)

Метод приготовления экстрактов из полимерных исследуемых образцов

В.1 Общие положения

В настоящем приложении приведено руководство по приготовлению экстрактов из полимерных исследуемых образцов для использования в методе максимизации на морских свинках (GPMT). Приготовление экстракта первоначально описано в [3], а дополнительная информация предоставлена в D.2 ISO 10993-12:2021.

В.2 Метод приготовления

В.2.1 Предварительная экстракция

Процедуру предварительной экстракции проводят на исследуемом образце для определения наиболее подходящего процесса экстракции для использования в GPMT.

Метанол и ацетон являются рекомендуемыми растворителями для экстракции. Исследуемый образец режут на маленькие кусочки (если возможно) и помещают в две отдельные емкости. От 10- до 20-кратного объема каждого растворителя (т.е. от 10 до 20 мл растворителя на каждый грамм исследуемого образца) добавляют в каждую емкость, емкости встряхивают при комнатной температуре для экстракции. Растворитель меняют три раза после каждой экстракции встряхиванием, например: после (4 1) ч, (8 1) ч или (24 2) ч в течение периода от 24 до 72 ч, используя тот же объем свежего растворителя. Экстракт собирают после каждого периода экстракции в одну емкость. Растворитель удаляют выпариванием для получения осадка.

Наиболее подходящий растворитель для исследования определяют на основании массы полученного осадка. Необходимо определить процентный выход осадка. Растворитель, дающий наибольшее количество осадка, выбирают как растворитель экстракции для исследования кожной сенсибилизации.

Определяют растворимость осадка добавлением оливкового масла, ацетона, метанола или диметилсульфоксида (DMSO). Жидкость, растворяющую большую часть осадка, используют как экстрагент в методе максимизации на морских свинках (GPMT).

Примечание - Если исследуемый образец растворяется или разлагается в ацетоне или метаноле или если невозможно получить адекватное количество осадка, то в качестве растворителя экстракции можно применить n-гексан или 1:1 смесь циклогексана и пропанол-2.

В.2.2 Финальная экстракция

В.2.2.1 Общие положения

Существует два метода приготовления исследуемого раствора из экстракта в органическом растворителе.

Метод 1 применим, когда количество осадка, полученного экстракцией растворителем из исследуемого образца, и масса исследуемого образца относительно велики, что позволило получить достаточные количества осадка. Дополнительно метод 1 особо рекомендуется для оценки риска МИ, используемых повторно [14].

Метод 2 применим, когда количество осадка, полученного экстракцией растворителем из исследуемого образца, или масса исследуемого образца относительно малы. Примерами последнего являются контактные линзы или внутриглазные линзы.

Для методов 1 и 2, параллельно с экстракцией веществ из исследуемого образца, объем растворителя, равный общему объему, использованному во время экстракции исследуемого образца, подвергается той же процедуре концентрации, что и исследуемые экстракты. Этот контроль используется как отрицательный контроль для каждой фазы исследования.

В.2.2.2 Приготовление исследуемой пробы по методу 1

Для экстракции по методу 1 исследуемую пробу помещают в 10-20-кратный объем соответствующего экстрагента (выбранного во время предварительной экстракции) и перемешивают встряхиванием при комнатной температуре. Экстракцию проводят трижды, заменяя экстрагент и помещая его в отдельную емкость. Например, заменяют через (4 1) ч, (8 1) ч и (24 2) ч и продолжают взбалтывать при комнатной температуре в течение периода от 24 до 72 ч в зависимости от выщелачивания и стабильности веществ, экстрагируемых из исследуемого материала.

Осадок получают выпариванием собранного растворителя. Применяют ротационный испаритель при наиболее низкой температуре, при которой возможно контролируемое выпаривание под сниженным давлением.

Осадок растворяют в соответствующем растворителе (оливковое масло/ацетон/этанол/ДМСО), выбранном при исследовании растворимости во время предварительной экстракции. Приготавливают 10 %-ный (в/в) исследуемого раствора для внутрикожной фазы индукции и 20 %-ный (в/в) для внутрикожной фазы индукции и для местной фазы индукции методом GPMT. Для провокационной фазы GPMT 10 %-ный (в/в) раствор приготовляют в растворителе. 10 %-ный раствор далее разбавляют растворителем для получения 1 %-, 0,1 %-, 0,01 %- и 0,001 %-ных исследуемых растворов.

В.2.2.3 Приготовление исследуемой пробы по методу 2

Для экстракции по методу 2 исследуемый образец помещают в 10-20-кратный объем соответствующего растворителя (выбранного во время предварительной экстракции) и встряхивают при комнатной температуре в течение (24 2) ч. Растворитель собирают в одной емкости. Процедуру экстракции повторяют три раза в течение периода от 24 до 72 ч, каждый раз используя тот же объем свежего растворителя. Экстракты собирают в одной емкости и растворитель выпаривают.

Для внутрикожной индукционной фазы полученные экстракты выпаривают до тех пор, пока остаточное количество миллилитров экстракта не равняется, или слегка ниже половины первоначального количества граммов примененного образца (т.е. если экстрагированы 10 г исследуемого образца, то комбинированный экстракт растворителя выпаривают примерно до 5 мл), или полностью для получения осадка. После получения осадка его растворяют в соответствующем растворителе (выбранном во время предварительной экстракции) до 5 мл. Этот раствор считают 200 %-ным исследуемым раствором.

Дополнительно готовят 100 %-ный исследуемый раствор путем разбавления 200 %-ного исследуемого раствора растворителем.

Для местной индукционной фазы применяют 100 %-ный исследуемый раствор. Для внутрикожной и местной индукционной фазы растворитель в 200 %-ных и 100 %-ных исследуемых растворах заменяют оливковым маслом, комбинируя исследуемый раствор с равным объемом оливкового масла и выпаривая растворитель под потоком газообразного азота.

Для провокационной фазы применяют 100 %-, 50 %-, 25 %-, 12,5 %- и 6,25 %-ный исследуемые растворы. 100 %-ный исследуемый раствор разбавляют растворителем для получения 50 %-, 25 %-, 12,5 %- и 6,25 %-ного исследуемых растворов. Растворитель в исследуемых растворах не заменяют оливковым маслом для провокационной фазы.

В.3 Метод максимизации на морских свинках

В.3.1 Общие положения

Метод GPMT выполняют, как описано в 6.5, за исключением провокационной фазы, которая описана ниже. Провокационная фаза с использованием метода экстракции растворителем должна быть выполнена без окклюзионной повязки.

В.3.2 Провокационная фаза

Через 2 нед после нанесения закрытой аппликации все подопытные и контрольные животные провоцируются исследуемым образцом.

При экстракции по методу 1 0,1 мл аликвоты 10 %-ного (в/в), 1 %-ного и 0,1 %-ного исследуемых растворов наносят местно на правый бок каждого подопытного животного и животного отрицательного контроля. Дополнительно 0,1 мл аликвот 0,01 %-ного и 0,001 %-ного исследуемых растворов и растворителя положительного контроля наносят местно на левый бок каждого опытного животного и животного отрицательного контроля.

При экстракции по методу 2 0,1 мл аликвоты 100 %-ного, 50 %-ного и 25 %-ного исследуемых растворов наносят местно на правый бок каждого опытного животного и животного отрицательного контроля. Дополнительно 0,1 мл аликвоты 12,5 %-ного и 6,25 %-ного исследуемых растворов и растворителя негативного контроля наносят местно на левый бок каждого опытного животного и животного отрицательного контроля.

При экстракции по методу 1 и методу 2 животных положительного контроля обрабатывают 0,1 мл аликвоты 0,1 % DNCB (динитрохлорбензол, ДНХБ) в этаноле на правом боку и этаноле на левом боку.

Примечание - Аналогичным образом можно поступить с применением окклюзионной повязки.