Приложение В (обязательное). Определение массовой доли лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Приложение В
(обязательное)

Определение массовой доли лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Диапазон измерения массовой доли лактозы в продукте - от 0,005 % до 100,0 %.

В.1 Сущность метода

Метод основан на определении лактозы в фильтрате, полученном после удаления из пробы жира и белка, методом ВЭЖХ при разделении на аминофазной колонке. Полученные результаты измерения сравнивают со значениями массовой доли лактозы в стандартном образце, используя градуировочный график.

В.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Хроматограф жидкостный высокоэффективный, включающий следующие элементы:

- колонку с привитой аминопропильной фазой длиной 250 мм, диаметром 4,6 мм, размер частиц 5 микрон;

- детектор высокочувствительный рефрактометрический с порогом шума не более 5 x 10 ^-9 единиц рефракции;

- мешалку магнитную;

- насос, способный пропускать раствор со скоростью 1 см ³/мин, с пульсацией не более 1 % при давлении на колонку от 1,5 МПа до 4,0 МПа;

- термостат для хроматографических колонок, обеспечивающий поддержание температуры элюента (40 2) °С;

- устройство петлевое для ввода пробы рабочим объемом петли 0,020 см ³;

- программное обеспечение для обработки результатов измерений.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания  0,003 г.

Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования в диапазоне 0,040-1,000 см ³ с относительной погрешностью дозирования  1 %.

Микрошприц для ВЭЖХ вместимостью 0,100 см ³.

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Баня ультразвуковая лабораторная.

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения не менее 10000 об/мин.

Колбы мерные 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры вместимостью 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1-1-2-5 по ГОСТ 29227.

Пипетки с одной отметкой 1(2)-2-5, 1(2)-2-10, 2-2-20, 2-2-25, 2-2-50 по ГОСТ 29169.

Колбы П-1-50-19/26, П-1-250-29/32 ТС по ГОСТ 25336.

Воронки В-56-80, В-75-80 ХС по ГОСТ 25336.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Пробирки типа Эппендорф вместимостью 1,5-2 см ³.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026, фильтры с размером диаметра 12,5 см.

Фильтры мембранные с размером пор 0,22 мкм.

Калий железосинеродистый по ГОСТ 4206, х. ч.

Лактоза, массовая доля основного вещества не менее 99,0 %.

Цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174, х. ч.

Вода для лабораторного анализа первой степени чистоты (бидистиллированная) по действующей нормативной документации.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

В.3 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 26809.1.

В.4 Подготовка к проведению измерений

В.4.1 Приготовление основного раствора лактозы

В мерную колбу вместимостью 100 см ³ помещают 1 г лактозы с записью результата до четвертого знака после запятой и растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора при температуре от 4 °С до 6 °С - не более 7 сут.

В.4.2 Приготовление градуировочных растворов лактозы

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных растворов в количестве не менее пяти путем разбавления основного раствора лактозы, приготовленного по В.4.1.

В четыре мерные колбы вместимостью 100 см ³ помещают 50 см ³, 25 см ³, 15 см ³, 10 см ³ основного раствора лактозы (см. В.4.1). Объем растворов доводят бидистиллированной водой до метки.

Все растворы готовят перед определением.

В.4.3 Приготовление подвижной фазы

Смешивают отмеренные по объему ацетонитрил и бидистилированную воду в соотношении 75:25.

Подвижную фазу готовят в день определения.

В.4.4 Приготовление раствора Кареза I

В мерную колбу вместимостью 100 см ³ помещают (3,600 0,001) г калия железосинеродистого, 70-80 см ³ дистиллированной воды и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

В.4.5 Приготовление раствора Кареза II

В мерную колбу вместимостью 100 см ³ помещают (7,200 0,001) г цинка сернокислого 7-водного, 70-80 см ³ дистиллированной воды и аккуратно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

В.4.6 Подготовка анализируемой пробы продукта

В.4.6.1 Сыворотка сухая

В мерную колбу вместимостью 100 см ³ помещают 1-2 г анализируемой пробы сухого продукта, взятого с отчетом показаний до 0,001 г. Мерным цилиндром приливают 20 см ³ бидистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют по 3 см ³ растворов Кареза I и Кареза II. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Полученный фильтрат центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

В.4.6.2 Сыворотка жидкая и сгущенная

В мерную колбу вместимостью 100 см ³ помещают (10,000 0,001) г анализируемой пробы. Мерным цилиндром приливают 20 см ³ бидистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют по 3 см ³ растворов Кареза I и Кареза II. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Полученный фильтрат центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

В.4.7 Подготовка хроматографа

Установку, включение и подготовку хроматографа к работе выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

В.4.7.1 Условия хроматографирования:

- скорость потока - 1 см ³/мин;

- температура - 40,0 °С;

- подвижная фаза: ацетонитрил/бидистиллированная вода в соотношении 75:25 (V/V);

- детектор: рефрактометрический.

В.4.7.2 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика измеряют площади пиков, соответствующие массовым долям лактозы в градуировочных растворах. Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее трех раз. Измерения выполняют последовательно, начиная с растворов с наименьшей массовой концентрацией лактозы.

Полученные при хроматографировании значения не должны отклоняться от стандартных более чем на 5 %.

По полученным данным, используя программное обеспечение к хроматографу, рассчитывают коэффициенты регрессии а и b.

Градуировочный график строят с учетом вычисленных значений уравнения

,

(В.1)

где Y - площадь пика углевода;

а и b - коэффициенты регрессии;

X - массовая доля лактозы в градуировочном растворе, %.

В.4.7.3 Градуировку проводят не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок или ремонте хроматографа.

В.5 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

температура окружающего воздуха	от 15 °С до 30 °С;
относительная влажность воздуха	менее 90 %;
атмосферное давление	(95 10) кПа.

Для проведения измерений применяют бидистиллированную воду, которую можно приготовить следующим образом: дистиллированную воду фильтруют через мембранный фильтр (размер диаметра пор не более 0,5 мкм), затем кипятят для удаления растворенного воздуха и охлаждают в закрытой посуде до комнатной температуры.

В.6 Проведение измерений

В инжектор хроматографа вводят 0,02 см ³ фильтрата, полученного по В.4.6.

В.7 Обработка результатов измерений

В.7.1 Массовую долю лактозы в пробе С, %, вычисляют по формуле

,

(В.2)

где V - объем анализируемой пробы после разбавления по В.4.6, см ³; V = 100 см ³;

с - массовая доля лактозы, рассчитанная по градуировочному графику, г/100 см ³;

m - масса навески пробы, взятой для анализа (см. В.4.6), г.

В.7.2 Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости по разделу В.8.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

В.8 Контроль точности результатов измерений

В.8.1 Метрологические характеристики метода определения массовой доли лактозы

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения массовой доли лактозы при Р = 0,95 приведены в таблице В.1.

Таблица В.1

В процентах

Диапазон измерений массовой доли лактозы	Предел повторяемости r отн.	Предел воспроизводимости R отн.	Границы относительной погрешности
0,05-100,00	9	17	12

В.8.2 Проверка приемлемости результатов измерения, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов измерения массовой доли лактозы, полученных в условиях повторяемости (два параллельных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 5.2.2). Результаты измерения считаются приемлемыми при условии

,

(В.3)

где Х ₁, Х ₂ - значения двух параллельных измерений, полученных в условиях повторяемости, %;

Х _ср - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, %;

r _отн. - предел повторяемости (сходимости), значение которого приведено в таблице В.1, %.

Если данное условие не выполняется, то проводят повторное измерение и проверку приемлемости результатов измерений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 5.2.2).

В.8.3 Проверка приемлемости результатов измерения, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов измерения массовой доли лактозы, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 5.3.2.1).

Результаты измерения, выполненные в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии

,

(В.4)

где , - значения результатов двух измерений, полученные в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, %;

R _отн. - предел воспроизводимости, значение которого приведено в таблице В.1, %;

- среднеарифметическое значение результатов измерений, выполненных в условиях воспроизводимости, %.

Если данное условие не выполняется, то процедуры повторяют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (пункт 5.3.3).

В.9 Оформление результатов измерения

Результат измерений массовой доли лактозы в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде

,

(В.5)

где - границы относительной погрешности измерений, % (таблица В.1);

Х _ср - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, %.

В.10 Требования, обеспечивающие безопасность

При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005;

- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.007;

- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.019;

- помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.009.

В.11 Пример хроматограммы определения массовой доли лактозы в сыворотке

Пример хроматограммы определения массовой доли лактозы в сыворотке методом ВЭЖХ приведен на рисунке В.1.

Рисунок В.1 - Хроматограмма определения массовой доли лактозы