Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-23-2023 "Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 23. Исследования раздражающего действия" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2023 г. N 1092-ст)

Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-23-2023
"Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 23. Исследования раздражающего действия"
(введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2023 г. N 1092-ст)

Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Part 23. Irritant studies

УДК 615.46:002:006.354
МКС 11.100.20
IDT

Дата введения - 1 июня 2024 г.
Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Автономной некоммерческой организацией "Институт медико-биологических исследований и технологий" (АНО "ИМБИИТ") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 сентября 2023 г. N 165-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 октября 2023 г. N 1092-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 10993-23-2023 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2024 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 10993-23:2021 "Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 23. Исследования на раздражение" ("Biological evaluation of medical devices - Part 23: Tests for irritation", IDT).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Введен впервые

Введение

ISO (Международная организация стандартизации) является федерацией национальных органов по стандартизации (органов - членов ISO). Работу по подготовке международных стандартов проводят под руководством технических комитетов ISO. Каждая организация-член, заинтересованная в области деятельности, для которой создан технический комитет, имеет право быть представленной в данном комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, также принимают участие в работе ISO. ISO тесно сотрудничает с Международной электротехнической комиссией (IEC) по вопросам стандартизации электротехнической продукции.

Процедуры, примененные при разработке настоящего стандарта, а также процедуры, предназначенные для его дальнейшей поддержки, приведены в Директиве ISO/IEC, часть 1. В частности, нужно отметить необходимость различных критериев утверждения для различных типов документов ISO. Настоящий стандарт составлен в соответствии с редакционными правилами Директив ISO/IEC, часть 2 (www.iso.org/directives). Необходимо обратить внимание на возможность того, что некоторые элементы настоящего стандарта могут быть объектом патентных прав.

ISO снимает с себя ответственность за обозначение каких-либо таковых патентных прав. Детали каких-либо патентных прав, обозначенных при разработке документа, будут содержаться во введении и/или в списке полученных патентных деклараций ISO (см. www.iso.org/patents).

Любая торговая марка, упомянутая в настоящем стандарте, является информацией, приведенной для удобства пользователей, и не является рекламой.

Для разъяснения добровольного характера стандартов, значений конкретных терминов ISO и выражений, связанных с оценкой соответствия, а также информации о приверженности ISO принципам ВТО по техническим барьерам в торговле (ТВТ), см. следующий URL: www.iso.org/iso/foreword.html.

Настоящий стандарт разработан Техническим комитетом ISO/TC 194, Биологическая и клиническая оценка медицинских изделий, в сотрудничестве с Техническим Комитетом CEN/TC 206, Оценка биологического и клинического действия медицинских изделий, Европейского Комитета по стандартизации (CEN), в соответствии с Соглашением о техническом сотрудничестве между ISO и CEN (Венское соглашение).

Список всех частей серии ISO 10993 находится на сайте ISO.

Все отзывы и вопросы по данному стандарту должны быть направлены в национальные органы по стандартизации пользователя. Полный список данных органов приводится по адресу: www.iso.org/members.html.

Настоящий стандарт оценивает возможные контактные опасности медицинских изделий, которые могут вызвать раздражение.

Некоторые составляющие материалы медицинских изделий были исследованы с продемонстрированным потенциалом к раздражению кожи или слизистой. Другие материалы и их химические компоненты не были исследованы и могут индуцировать нежелательные реакции при контакте с тканью человека. Таким образом, изготовитель обязан оценивать каждое изделие на предмет потенциального нежелательного воздействия до выхода изделия на рынок.

Раздражающий потенциал медицинского изделия или его компонентов может быть спрогнозирован либо исследованием на животных in vivo, либо исследованием раздражения in vitro пригодным методом.

ISO 10993-2 устанавливает требования к обращению с животными для оценки биологического действия медицинских изделий и выделяет три принципа: замещения, сокращения и улучшения исследований на животных. Настоящий стандарт описывает методы для определения раздражающих свойств медицинских изделий, материалов или их экстрактов с помощью исследований in vitro или in vivo. Исследования in vitro предпочтительнее исследований in vivo при надлежащей валидации и предоставлении соответствующей информации равнозначной той, которая получена при исследованиях in vivo (см. ISO 10993-1 и ISO 10993-2).

Традиционно исследования на мелких лабораторных животных проводились до испытаний на людях, чтобы позволить предположить реакцию человека.

Совсем недавно в качестве дополнения или альтернативы исследования на людях были добавлены методы in vitro.

Для исследования кожного раздражения индивидуальными химическими веществами были разработаны исследования in vitro с применением моделей реконструированного эпидермиса человека (RHE) (см. [31]). Метод был адаптирован для обнаружения раздражающих химических веществ в экстрактах из медицинского изделия. Результаты широкого круга исследований, в которых были применены две модели RHE, показали, что эти модели также могут использоваться для обнаружения раздражающих химических веществ, экстрагированных из полимерных материалов [поливинилхлорид (ПВХ) и силикон], как правило применяемых при производстве медицинских изделий (см. [6]). Данный метод оказался таким же чувствительным при обнаружении низких концентраций отдельных сильно раздражающих соединений, как и кожная проба на человеке и внутрикожное исследование на кроликах (см. [14]). Таким образом, поэтапный подход к исследованию раздражителя может начинаться с модели RHE in vitro.

Разработанные и валидированные модели RHE пригодны для прогнозирования ответа тканей кожи человека на раздражение. Рекомендуется ознакомиться с другими альтернативными моделями in vitro для оценки раздражающего потенциала при применении на слизистой или эпителии роговицы.

Предполагается, что для предоставления в нормативные органы данные исследования должны проводиться с применением надлежащих лабораторных практик (GLP) или ISO/IEC 17025 по применимости в соответствующей стране и соответствовать нормативным требованиям, связанным с обращением с животными. При необходимости рекомендуется проводить статистический анализ данных.

Настоящий стандарт предназначен для использования профессионалами с надлежащей квалификацией и опытом, способными интерпретировать его требования и оценить результаты оценки каждого медицинского изделия с учетом всех факторов, относящихся к изделию, его предполагаемого применения и существующих данных о медицинском изделии, полученных из обзора научной литературы и предшествующего клинического опыта.

Исследования, включенные в настоящий стандарт, являются важными инструментами для разработки безопасных продуктов, если они проводятся и интерпретируются подготовленными сотрудниками.

Настоящий стандарт основывается на многочисленных стандартах и руководствах, включая Руководство по исследованиям OECD [TG], Фармакопею США (см. [40]) и Европейскую Фармакопею (см. [39]). Он предназначен служить основным документом для выбора и проведения исследований, позволяющих оценить реакцию на раздражение, относящихся к безопасности медицинских материалов и изделий.

Инструкции для подготовки материалов конкретно в связи с вышеупомянутыми исследованиями приводятся в обязательном приложении A. В обязательном приложении D описаны несколько специальных исследований на раздражение in vivo для медицинских изделий, не контактирующих с кожей. Дополнительно обязательное приложение E предоставляет информацию для проведения исследования раздражения кожи человека.

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на медицинские изделия (МИ) и материалы, применяемые для их изготовления, и устанавливает требования к проведению исследований на раздражающее действие. Исследования предназначены для прогнозирования и классификации раздражающего действия МИ/материалов в соответствии с ISO 10993-1 и ISO 10993-2.

Настоящий стандарт устанавливает требования:

- к проведению предварительных исследований раздражающего действия, включая методы in silico и in vitro при воздействии на кожу;

- проведению исследований методами in vitro и in vivo;

- обработке и интерпретации результатов исследований.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты [для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения)]:

ISO 10993-1, Biological evaluation of medical devices - Part 1: Evaluation and testing within a risk management process. (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования в процессе менеджмента рисков)

ISO 10993-2, Biological evaluation of medical devices - Part 2: Animal welfare requirements (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к обращению с животными)

ISO 10993-9, Biological evaluation of medical devices - Part 9: Framework for identification and quantification of potential degradation products (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 9. Основные принципы идентификации и количественного определения потенциальных продуктов деградации)

ISO 10993-12, Biological evaluation of medical devices - Part 12: Sample preparation and reference materials (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 12. Приготовление проб и контрольные образцы)

ISO 10993-13, Biological evaluation of medical devices - Part 13: Identification and quantification of degradation products from polymeric medical devices (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 13. Идентификация и количественное определение продуктов деградации полимерных медицинских изделий)

ISO 10993-14, Biological evaluation of medical devices - Part 14: Identification and quantification of degradation products from ceramics (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 14. Идентификация и количественное определение продуктов деградации изделий из керамики)

ISO 10993-15, Biological evaluation of medical devices - Part 15: Identification and quantification of degradation products from metals and alloys (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 15. Идентификация и количественное определение продуктов деградации изделий из металлов и сплавов)

ISO 10993-18, Biological evaluation of medical devices - Part 18: Chemical characterization of materials (Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 18. Исследование химических свойств материалов)

ISO 14155, Clinical investigation of medical devices for human subjects Good clinical practice (Клинические исследования медицинских изделий для людей. Надлежащая клиническая практика)

OECD 404, Acute Dermal Irritation/Corrosion (Острое раздражение/Коррозия кожи)

OECD 439, In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method (Раздражение кожи in vitro: метод испытания реконструированного эпидермиса человека)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями.

ISO и IEC поддерживают терминологическую базу данных, используемую в целях стандартизации по следующим адресам:

- Электропедия IEC: доступна по адресу http://www.electropedia.org/;

- платформа онлайн-просмотра ISO: доступна по адресу http://www.iso.org/obp.

3.1 контрольный экстрагент (blank): Экстрагент, не содержащий исследуемую пробу, и подвергающийся тому же воздействию в идентичной емкости, в тех же условиях, что и экстрагент с исследуемой пробой во время экстракции.

[ISO 10136-1:1993, 3.8, уточнен - термин изменился с "раствора контрольного экстрагента" на "контрольный экстрагент"]

3.2 доза; дозировка (dose, dosage): Количество вводимого исследуемого образца (см. 3.14) (например, масса, объем), выраженного на единицу массы тела или площади поверхности.

Примечание - Термины часто взаимозаменяемы (дозировка является более распространенной).

3.3 эритема (erythema): Покраснение кожи или слизистой мембраны.

3.4 струп (eschar): Корка или обесцвеченный отшелушивающийся участок кожи.

3.5 экстракт (extract): Жидкость или суспензия, полученные в результате воздействия экстрагента (см. 3.16) на исследуемый или контрольный образец при контролируемых условиях.

3.6 раздражитель (irritant): Агент, производящий раздражение (см. 3.7).

3.7 раздражающее действие (irritation): Локализованный неспецифичный воспалительный ответ на однократное, многократное или непрерывное применение вещества/материала.

Примечание - Раздражение кожи является обратимой реакцией и, как правило, характеризуется местной эритемой (см. 3.3) и эдемой (см. 3.10) кожи.

3.8 некроз (necrosis): Гибель клеток в результате необратимых изменений, вызванных травмой или заболеванием.

Примечание - Восстановление тканей будет происходить либо в результате полного функционального восстановления, либо в результате образования рубца.

3.9 отрицательный контроль (negative control): Материал и/или вещество с достаточно изученными характеристиками, которые при применении в конкретном методе исследования подтверждают воспроизводимость этого метода и соответствие отрицательного, нереактивного или минимального биологического ответа в тест-системе установленным требованиям.

Примечание - На практике отрицательные контроли (NC) включают контрольный экстрагент (см. 3.1), экстрагенты (см. 3.16)/растворители и стандартные образцы.

3.10 отек (oedema): Увеличение объема ткани вследствие анормальной инфильтрации жидкости.

Примечание - В качестве синонима термина "отек" допускается использовать термин "эдема".

3.11 положительный контроль (positive control): Материал и/или вещество с достаточно изученными характеристиками, которые при применении в конкретном методе подтверждают воспроизводимость этого метода и соответствие положительного или реактивного биологического ответа в тест-системе установленным требованиям.

3.12 разъедание [коррозия] кожи (skin corrosion): Необратимое повреждение кожи после применения испытуемом пробы (см. 3.14), проявляющееся некрозом (3.8), затрагивающим эпидермис и дерму.

Пример - Действие соединения, химического вещества или исследуемой пробы, приводящее к изъязвлению кожи (см. 3.15).

3.13 исследуемый образец (test material): Материал, изделие, часть изделия или его компонент, которые отбираются для биологического или химического исследования.

3.14 исследуемая проба (test sample): Материал, изделие, часть изделия, компонент, экстракт (см. 3.5) или его часть, подвергаемые биологическим или химическим исследованиям или оценке.

3.15 изъязвление (ulceration): Открытая рана с потерей поверхностных слоев ткани.

3.16 экстрагент (vehicle): Жидкость, используемая для увлажнения, разбавления, суспендирования, экстракции (см. 3.5) или для растворения исследуемого вещества/материала.

3.17 контроль экстрагента (vehicle control): Экстрагент (см. 3.16), не содержащий исследуемый образец (см. 3.13), сохраняется в сосуде, идентичном сосуду с исследуемым образцом, и подвергается условиям, идентичным тем, которым исследуемый образец подвергается экстракции.

Примечание - Контрольный экстрагент предназначен для оценки возможных побочных эффектов, связанных с емкостью для экстракции, экстрагирующей жидкостью и процессом экстракции.

4 Основные принципы - поэтапный подход

Существующие методы исследования раздражения были разработаны для обнаружения возможного раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки. Другие виды нежелательного воздействия, такие как сенсибилизация, данными исследованиями, как правило, не выявляются. Исторически исследование на раздражение проводилось на кроликах. Для обнаружения раздражающего действия имплантатов или изделий, присоединяемых извне, внутрикожная реакция более приемлема (см. 7.2).

Следует отдавать предпочтение исследованиям in vitro вместо in vivo в соответствии с ISO 10993-2, так как новые исследования in vitro являются научно обоснованными и пригодными для использования с МИ и становятся все более доступными. Результаты широкого круга исследований, в которых были применены две модели RHE, показали, что эти модели также могут использоваться для обнаружения раздражающих химических веществ, экстрагированных из полимерных материалов [поливинилхлорид (ПВХ) и силикон], как правило, применяемых при производстве МИ (см. [6]). Было показано, что этот метод одинаково чувствителен к обнаружению низких концентраций некоторых сильнораздражающих соединений по сравнению с кожной пробой на человеке и внутрикожном исследовании на кроликах (см. [14]). Таким образом, исследование на раздражение в условиях in vitro должно быть проведено перед исследованием на животных или человеке.

Примечание - Доступная детальная информация по применимости моделей RHE для конкретного исследуемого МИ должна быть рассмотрена.

Настоящий стандарт описывает поэтапный подход, который должен включать один или несколько следующих пунктов:

a) химическая характеристика, дополненная при необходимости химическими исследованиями образцов в соответствии с общими принципами, указанными в ISO 10993-9, ISO 10993-13, ISO 10993-14, ISO 10993-15 и ISO 10993-18;

b) обзор литературы, как указано в ISO 10993-1, включая оценку химических и физических свойств и информацию по раздражающему потенциалу любого составляющего продукта, а также структурно связанных химических веществ и материалов;

Примечание - Методы in silico (связь активность-структура, QSAR, метод аналогий) могут указать на потенциальную раздражающую активность.

c) альтернативное исследование in vitro с применением валидированной модели RHE согласно методам 6.2-6.12;

Примечание - Для специальных исследований на раздражающее действие МИ, контактирующих со слизистыми оболочками или эпителием глаза (приложение D), модели RHE не адаптированы, и рекомендуется изучить использование других моделей in vitro с соответствующими клетками или тканями, если они подходят для использования с МИ.

d) исследования на животных in vivo;

Примечание - Исследования на животных in vivo применимы, когда материалы не могут быть охарактеризованы и оценка риска не может быть проведена с использованием информации, полученной методами, описанными в a), b) и c).

e) клинические исследования согласно ISO 14155 и этическим принципам, регулирующим клинические исследования, не должны проводиться, пока раздражающий потенциал изделия не будет установлен посредством одного или более методов оценки, описанных с a) по d).

5 Оценка данных перед исследованием

5.1 Общие положения

Рассмотрение химических данных перед исследованием может привести к заключению, что исследование на раздражение необязательно. Например, если pH исследуемого образца  2,0 или  11,5, материал должен быть признан раздражающим и дальнейшего исследования на раздражение не требуется согласно OECD 404.

Применяются требования, изложенные в ISO 10993-1:2018 (раздел 5) о классификации МИ, а также следующее.

Нестерильные образцы должны быть изучены in vivo только с неповрежденной кожей, так как вероятность микробного загрязнения исследуемого образца может затруднить интерпретацию заключительной пробы. В случаях, когда стерильность исследуемого образца не может быть гарантирована, но образец считается незагрязненным, необходимо обосновать интрадермальное введение.

5.2 Типы материалов

5.2.1 Предварительная оценка

Необходимо учитывать, что при изготовлении и сборке МИ в качестве вспомогательных средств для обработки могут использоваться дополнительные химические компоненты, например, смазочные материалы или средства для удаления плесени. Дополнительно к химическим компонентам изначального материала и производственных технологических добавок и примесей в готовом изделии могут присутствовать остатки адгезива/растворителя при сборке, остатки стерилизующих агентов или продукты реакции, возникающие в результате процесса стерилизации. Представляют ли эти компоненты риск или опасность для здоровья, зависит от характеристик выщелачивания или деградации готовых изделий. Потенциальная раздражающая активность таких компонентов должна быть принята во внимание (учтена). Следующие типы материалов часто применяются в МИ и могут нести риски раздражения.

5.2.2 Керамика, металлы и сплавы

Данные материалы, как правило, являются менее сложными, чем полимеры и материалы биологического происхождения, с точки зрения количества химических составляющих.

5.2.3 Полимеры

Данные материалы с точки зрения состава более сложны химически, чем керамика, металлы и сплавы. В них может находиться некоторое количество продуктов реакции, загрязнений и добавок, а завершенность полимеризации может различаться.

5.2.4 Материалы биологического происхождения

Состав этих материалов изначально сложен. Они часто содержат технологические добавки и примеси, например перекрестносшивающие и антимикробные агенты. Образцы биологических материалов могут отличаться от образца к образцу.

5.3 Информация о химическом составе

5.3.1 Общие положения

Описание химических компонентов МИ должно соответствовать ISO 10993-18. В соответствии с ISO 10993-1 степень требуемой физической и/или химической характеристики зависит от степени знаний о составе материала и от характера и длительности контакта МИ с организмом. Как минимум, характеристика должна включать составляющие химические вещества МИ и возможные остаточные технологические средства или добавки, применяемые при его производстве. Тщательность, необходимая при характеристике химических составляющих, в основном определяется характером, степенью, частотой и длительностью воздействия и опасностями, идентифицированными для МИ или материала. Необходимо получить количественные данные, если они имеют отношение к биологической безопасности. Если количественные данные не получены, то причина должна быть обоснована и задокументирована.

5.3.2 Существующие источники данных

По возможности, качественная и количественная информация по составу материала должна быть получена от поставщика. Для полимеров это часто требует доступа к внутренней информации; необходимо ввести положения для передачи и использования таковой конфиденциальной информации.

Качественная информация о каких-либо дополнительных добавках обработки (например, смазках для форм) также должна быть получена от соответствующих участников производственной цепочки, включая преобразователей и производителей компонентов.

При отсутствии каких-либо данных о составе рекомендуется поиск литературы для установления вероятной природы изначального материала или материалов, а также любых добавок для помощи в выборе наиболее подходящих методов анализа данного материала.

Химическая характеристика МИ должна быть получена в соответствии с ISO 10993-18.

Примечание - Состав керамик, металлов и сплавов может быть указан в соответствии со стандартами ISO или Американского общества по испытанию материалов (ASTM) или он может быть указан пользователем, или и то, и другое. Тем не менее, чтобы получить полную качественную и количественную информацию о составе, может потребоваться запросить их у поставщика или изготовителя исходного материала, а также у изготовителей компонентов, чтобы убедиться, что вспомогательные средства для обработки также идентифицированы. Мастер-файл (досье) на материал, хранящийся в контролирующих органах, является еще одним источником данных, если таковой доступен.

6 Исследования раздражения in vitro

6.1 Общие положения

Метод in vitro на моделях RHE для исследования раздражения был разработан конкретно для определения способности чистых веществ к раздражению кожи (см. [3], [12]) (см. OECD 439). Метод был адаптирован и валидирован двумя моделями RHE для обнаружения раздражающих химических веществ в экстрактах МИ (см. [5], [6], [12], [13], [17]-[19]). Данный метод оказался таким же чувствительным для обнаружения низких концентраций отдельных сильных раздражителей в экстрактах из полимерных медицинских материалов [ПВХ и силикон] при сравнении с кожной пробой на человеке и внутрикожном исследовании на кроликах (см. [20]). Таким образом, исследование RHE, как описывается в данном документе, может заменить исследование раздражения на кроликах in vivo путем воздействия на кожу и интракутанным (интрадермальным) введением.

Примечание - При возможности приводят детальную информацию по применимости модели RHE для конкретного исследуемого МИ.

6.2 Модель реконструированного эпидермиса человека in vitro

6.2.1 Тест-система - модель реконструированного эпидермиса человека

Модель RHE должна состоять из нормальных эпидермальных кератиноцитов человеческого происхождения, которые были культивированы для формирования многослойной высокодифференцированной модели эпидермиса человека. Она должна состоять из организованных базального, шиповатого и гранулярного слоев, а также многослойного рогового слоя, содержащего межклеточные ламеллярные липидные слои, расположенные по типу, аналогичному схеме in vivo. Нормальные кератиноциты человека, полученные от здоровых добровольцев, должны культивироваться несколько дней на мембране или фильтре воздухо-водного раздела для формирования трехмерной эпидермальной модели, состоящей из основного базального, супра-базального, шиповатого и гранулярного слоев, а также функционирующего рогового слоя. Модельная система должна обеспечивать возможность непосредственного добавления как полярных (например, физиологического раствора), так и неполярных (например, кунжутного масла) экстрактов на апикальную поверхность RHE конструкции.

Материалы, непригодные для экстракции (например, жидкости, гели, пасты и взвешенные частицы) могут быть приемлемыми для тест-системы. При их использовании необходимо предоставить данные валидации для демонстрации способности тест-системы обнаруживать раздражающую активность данных форм материалов до исследования.

6.2.2 Принцип метода

Конечные точки: определение жизнеспособности клеток основывается на клеточном восстановлении МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-бромид дифенилтетразолиума) и последующем преобразованием его в пурпурную соль формазана, которую количественно измеряют после извлечения из ткани (см. [9], [16]). Жизнеспособность клеток в обработанных тканях выражается в процентах от отрицательного контроля. Сокращение жизнеспособности клеток в процентном выражении применяется для прогнозирования раздражающей способности.

Примечание 1 - Снижение жизнеспособности тканей может сопровождаться высвобождением IL-1 (см. [13], [17], [19]). Среды для культивирования тканей после воздействия могут быть собраны и заморожены при температуре  -20 °C для дальнейшего анализа цитокинов.

Процедура коротко: исследования, проведенные с полимерными биоматериалами, специально произведенными для поглощения раздражающих веществ при низких концентрациях, показали, что необходимо продленное воздействие по сравнению с протоколом OECD 439 для неразбавленных химических веществ. Инкубационный период воздействием от 18 до 24 ч при температуре 37 °C для воздействия потенциально низких концентраций раздражителей в экстрактах из биоматериалов является достаточным для прогнозирования раздражения in vitro по снижению жизнеспособности ткани на 50 % (см. [4], [6], [13], [17], [19]). Как воздействие в течение 18 ч, так и воздействие в течение 24 ч показали сходные результаты в обеих моделях RHE, оцененных при анализе по круговой системе с использованием экстрактов МИ (см. [13], [17], [19]).

Ткани после добавления исследуемого и контрольного экстрактов инкубируют при температуре 37 °C, 5 % CO ₂ во влажной атмосфере инкубатора.

Воздействие экстракта из исследуемой пробы прекращают промыванием в фосфатно-буферном солевом растворе Дюльбекко (DPBS) или фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) без Ca ²⁺ и Mg ²⁺. После промывания ткани высушивают вручную. Жизнеспособность оценивают инкубированием тканей на 3 ч с раствором в 24-луночном планшете (1 мг/мл; 300 млк на лунку). Формазановые кристаллы экстрагируются при использовании надлежащего количества (в зависимости от используемой модели RHE) изопропанола по меньшей мере 2 ч при комнатной температуре. Отбирают две или три аликвоты на ткань (в зависимости от инструкций поставщика) экстрагированного формазана, затем добавляют в 96-луночный планшет (200 млк/лунка) и измеряют спектрофотометрически при 570 нм.

При прямом внесении в пробу, раствор с 1 %-фракцией объема додецилсульфата натрия (SDS, см. 6.4.4) в физрастворе NaCl 0,9 % может применяться в качестве положительного контроля, соответственно, а также DPBS и PBS без эпидермиса, обработанного Ca ²⁺ и Mg ²⁺, соответственно применяется как отрицательный контроль. Для экстрагированных проб в качестве положительных контролей можно использовать утвержденный контроль, инфицированный раздражителем, экстрагированный в кунжутном масле и в 0,9 % физрастворах NaCl.

Примечание 2 - Аликвоты культуральной среды, собранные после 18 ч или 24 ч воздействия, могут храниться в замороженном виде (при минимуме минус 20 °C) для потенциальных цитокинных (IL-1) измерений в качестве дополнительной конечной точки для жизнеспособности клеток. Измерение IL-1 определяет компонент воспаления для оценки кожного раздражения в дополнение к компоненту повреждения клеток, косвенно определяемому исследованием МТТ на жизнеспособность клеток.

Контроли экстрагентов должны включать физиологический раствор (NaCl 0,9 %) и кунжутное масло, прошедшие процедуру экстракции МИ ISO 10993-12. Для каждой обработанной ткани жизнеспособность выражается как относительный процент к отрицательным контрольным тканям, обработанным DPBS или PBS (среднее значение).

Ограничения метода: метод неприменим к газам и аэрозолям. Он неприменим для оценки раздражения при прямом контакте с твердыми материалами, так как плотный контакт по всей исследуемой поверхности не может быть гарантирован.

Известные случаи исследуемых соединений, требующих конкретные контроли: некоторые химические вещества могут напрямую сократить реагент МТТ (например, электрофилы, предметы исследования с высоким pH), в то время как другие химические вещества могут напрямую окрасить ткань или клетки. Такие свойства исследуемого образца могут только помешать, если достаточные количества химического вещества присутствуют на ткани под конец периода воздействия. В таких случаях необходимо применить особую процедуру, позволяющую количественное исчисление "истинной" редукции МТТ. Протокол для определения возможного взаимодействия с МТТ приведен в ссылках [20] и [21]. Применение специфичных и адаптированных контролей позволяет вычислить истинную жизнеспособность ткани после вычитания неспецифичных оптических плотностей (ОП) из-за прямой химической редукции МТТ или химического остаточного цвета, выделенного из тканей, или и того, и другого.

6.2.3 Прогностическая модель

Прогностическая модель основана на модели прогнозирования OECD 439 и данных, полученных позже при оптимизации протокола МИ (см. [4], [6], [14], [17], [19]).

Если жизнеспособность клеток после воздействия составляет  50 %, то исследуемая проба классифицируется как раздражитель (I).

Если жизнеспособность клеток после воздействия составляет > 50 %, то исследуемая проба классифицируется как не раздражитель (NI).

Исследование на жизнеспособность клеток должно проводиться как с полярными (например, физиологический раствор), так и с неполярными (например, кунжутное масло) испытуемыми экстрактами. Если по меньшей мере один из экстрактов показывает положительный эффект (жизнеспособность  50 %), то будет считаться, что исследуемый образец МИ имеет раздражающий потенциал. Таким образом, будет считаться, что изделие или компонент изделия может вызвать раздражающее действие. Исследование in vivo может быть рассмотрено для оценки дальнейшей характеристики раздражающей активности при необходимости. Если исследуемая проба не является раздражителем (жизнеспособность > 50 %) с двумя экстрагентами, то изделие или компонент изделия не будет считаться раздражителем.

6.3 Материалы

6.3.1 Модели реконструированного эпидермиса человека - описание продукта

Эпидермальные клетки забирают у здоровых добровольцев с отрицательными результатами анализов на ВИЧ 1 и 2, а также на антитела гепатита C и антигены гепатита B с соблюдением правил обращения с биологическими материалами.

Для проб, представляющих собой экстракты из МИ, применение двух моделей RHE, описанных и признанных в OECD 439, было оценено в обширном международном циклическом исследовании (см. [6]). В данном исследовании использовались ткани EpiDerm _ модели EPI-200 ¹⁾ и SkinEthic _ модели RHE ²⁾. Конкретные протоколы данных моделей доступны в качестве дополнительного материала (см. [6], [20], [21]).

------------------------------

¹⁾_{EpiDerm _ является торговой маркой, поставляемой MatTek In Vitro Life Science Laboratories (Братислава, Словакия) и корпорацией MatTek (Эшлэнд, Мэриленд, США). Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта. Можно использовать эквивалентные продукты, если показано, что они приводят к тем же результатам.}

²⁾_{SkinEthic _ является торговой маркой, поставляемой компаниями EpiSkin SA (Лион, Франция), EpiSkin Brazil (Рио, Бразилия) и Shanghai EPISKIN Biotechnology (Шанхай, Китай). Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта. Можно использовать эквивалентные продукты, если показано, что они приводят к тем же результатам.}

------------------------------

Обе модели были оценены референтной лабораторией ЕС Европейского Центра Валидации Альтернативных Методов (EURL ECVAM) для определения кожного раздражения химическими веществами и включены в OECD 439 и Руководство ЕС В.46 (см. [41]). Эти модели были валидированы с неразбавленными промышленными химическими веществами в целях классификации и маркировки. Другие модели, описанные и признанные в OECD 439, могут использоваться для кожного раздражения МИ при их валидации для исследований экстрактов МИ на предмет раздражения кожи и ткани. Валидация нового метода, основанного на RHE, сходного с референтным методом, называется наверстывающей валидацией (catch-up validation) (см. [3], [37]).

Валидация новой модели RHE, приведенной в OECD 439 для определения кожного раздражения in vitro, должна продемонстрировать такие же показатели с точки зрения прогностических возможностей и внутрилабораторной вариабельности, как и в первоначальном циклическом исследовании (см. [6]). Межлабораторное исследование (как минимум в трех лабораториях) должно проводиться слепым методом с тремя повторами (три производственные партии модели RHE) (см. [37]) на наборе раздражающих и нераздражающих материалов, эквивалентных набору исходных материалов в циклическом исследовании.

6.3.2 Приготовление экстрактов из МИ

Приготовление экстрактов МИ и/или биоматериалов должно производиться в соответствии с ISO 10993-12.

- Полярные экстракты должны быть приготовлены в 0,9 %-ном физиологическом растворе (900 мг на 100 мл сверхчистой или деионизованной воды).

- Неполярные экстракты должны быть приготовлены в кунжутном масле из sesamum indicum (примеры приемлемого качества: сверхрафинированное и фармацевтической степени чистоты).

Примечание 1 - В циклическом исследовании [6] было показано, что 0,9 %-ный физиологический раствор и кунжутное масло подходят в качестве экстрагентов для раздражающих веществ, присутствующих как в ПВХ (PVC), так и в силиконовых полимерах, для применения в модели RHE in vitro. Таким образом, данные жидкости рекомендуются как экстрагенты.

Если для экстракции применяются другие экстрагенты, то необходимо предоставить данные валидации для подтверждения, что замена экстрагентов не повлияет на способность тест-системы дифференцировать отрицательные, слабые, умеренные и сильные раздражители.

Время и температура экстракции должны быть обоснованы согласно ISO 10993-12.

Примечание 2 - В циклическом исследовании раздражение МИ на модели RHE применялись экстракты обогащенных полимеров (PVC и силикон), а экстракция проводилась при (37  1) °C в течение (72  2) ч с непрерывной ажитацией/встряхиванием.

Материалы, не предназначенные для экстракции (например, жидкости, гели, пасты и взвешенные частицы) могут быть приемлемыми для тест-системы. При использовании таких материалов необходимо предоставить данные валидации для демонстрации способности тест-системы обнаруживать раздражающую способность материалов до исследования.

6.4 Методы

6.4.1 Общие положения

ВНИМАНИЕ - Процедура, описанная в настоящем стандарте, требует применения опасных реагентов. Настоящий стандарт не охватывает все сопряженные вопросы безопасности. Ответственностью пользователя настоящего стандарта являются принятие профилактических мер, а также мер по охране труда и безопасности, и обеспечение соответствия нормативным требованиям.

МТТ представляет следующие опасности:

- Н302: вреден при проглатывании;

- Н315: вызывает кожное раздражение;

- Н319: вызывает серьезное раздражение глаз;

- Н330: смертелен при вдыхании;

- Н335: может вызвать респираторное раздражение;

- Н341: может быть причиной генетических дефектов (указать путь воздействия, если достоверно доказано, что никакие другие пути воздействия не могли вызвать риск).

Изопропанол представляет следующие риски:

- Н225: легко воспламеняющиеся жидкость и пар;

- Н319: вызывает серьезное раздражение глаз;

- Н336: может вызвать сонливость или головокружение.

6.4.2 Процедура исследования

В приложении B приведен перечень для исследования раздражения in vitro с использованием моделей RHE.

Все процедуры, проведенные при исследовании раздражения на модели RHE, следует отразить документально. Пример списка документации метода (MDS) приводится в приложении C. Описание различных шагов, связанных с проведением исследования раздражения кожи in vitro, приводится ниже. Необходимо следовать следующим шагам, обосновывая любые отклонения, сопровождая их данными валидации.

- Подготавливают исследуемые и контрольные пробы в виде экстрактов из изделия/биоматериала на полярном (солевом) и неполярном (кунжутное масло) экстрагентах. Время начала экстракции должно основываться на времени, выбранном для экстракции согласно ISO 10993-12 и времени готовности ткани к обработке (в зависимости от времени получения и необходимых предварительных инкубаций тканей RHE). Экстракт исследуемого материала/МИ должен быть использован в течение срока, допустимого ISO 10993-12 для применения в экстрактах для исследования биосовместимости. Во время периода экстракции применяют непрерывную ажитацию/встряхивание.

- Затем переносят ткань RHE из среды транспортировочных планшетов в среду культуральных планшетов в соответствии с инструкцией изготовителя. Если того требуют инструкции изготовителя тканей, то предварительно инкубируют ткани, поместив их в культуральные планшеты подходящего размера со средой для анализа (см. 6.5.1).

- Если экстракты из материала положительного контроля не включены, то в день эксперимента добавляют положительный контроль (SDS) в полярный (солевой) экстрагент в указанной концентрации. Можно применять более низкие концентрации SDS (например, от 0,25 % до 0,5 %) в качестве положительного контроля после демонстрации применимости и положительных результатов (см. [17], [19]).

- Наносят отрицательный контроль, положительный контроль, контроли экстрагентов и исследуемую пробу в объеме 100 мкл на поверхность ткани RHE.

- Инкубируют при температуре (37  1) °C, (5  1) % CO ₂ во влажной среде инкубатора в течение (18  1) ч или (24  2) ч.

Примечание - В анализе по круговой системе время инкубации составило 18 ч для тканей EpiDerm _ модели EPI-200 и 24 ч - для модели RHE производства SkinEthic _. Обе модели показали схожие результаты при 18-часовом и 24-часовом воздействии (см. [13], [19], [17]).

- Останавливают воздействие промыванием тканей RHE посредством DPBS или PBS без Ca ²⁺ и Mg ²⁺, а также высушиванием тканей RHE согласно инструкциям изготовителя.

- Переносят образцы ткани в раствор МТТ (необязательно: проба среды для измерений параметров выпуска медиаторов интерлейкина). Хранят образцы в морозильной камере при температуре  -20 °C.

- Инкубируют ткани на 3 ч  5 мин в МТТ [(37  1) °C, (5  1) % CO ₂, во влажной среде инкубатора].

- Переносят и погружают в экстракт формазана изопропанол.

- Экстракция формазаном: не менее 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи (в герметичной емкости, при комнатной температуре).

- Встряхивают и гомогенизируют.

- Переносят экстракт на формазане в 96-луночный планшет.

- Измеряют оптическую плотность (OD), используя спектрофотометр для планшетов.

6.4.3 Среда и растворы для конечной точки

6.4.3.1 Раствор МТТ

Раствор МТТ чувствителен к свету. Следует защищать его от света фольгой или подходящим материалом.

Растворяют порошок МТТ в концентрации 5 мг/мл в PBS (базовая концентрация). Фильтруют через фильтр 0,22 мкм. Подготавливают готовые к использованию растворы (например, аликвотами в 1 мл) в стерильных темных микропробирках емкостью 1,5 мл. Хранят реагенты в морозильной камере при минус 20 °C. Срок хранения: 1 год при минус 20 °C.

В качестве альтернативы можно использовать препарат МТТ, предоставленный изготовителем тканей RHE.

Разводят базовый раствор МТТ предварительно подогретой средой до концентрации в 1 мг/мл.

Раствор следует беречь от света и хранить не более 2 ч после приготовления.

6.4.3.2 Раствор изопропанола

Применяют неразбавленный 2-пропанол (CAS N 67-63-0).

6.4.4 Приготовление исследуемой пробы и контроля

Документируют основную информацию о контроле экстрагента и экстракте, включая коды или номера, физическое состояние, объем или массу, срок годности и условия хранения. Записывают детали приготовления и метода. Пример записей представлен в приложении C.

Особая процедура для отрицательного контроля (DPBS или PBS): отрицательным контролем является стерильный DPBS или PBS без Ca ²⁺ и Mg ²⁺. Необходимо использовать стерильные, готовые к использованию DPBS или PBS. К трем отдельным образцам ткани следует добавлять по 100 мкл отрицательного контроля.

Особая процедура для положительного контроля (1 % об/об SDS): 500 мкл водного 20 %-ного SDS необходимо смешать с 9,5 мл экстрагента (солевого) и тщательно перемешать. Из данного раствора отбирают 100 мкл, которые добавляют к образцам ткани.

В качестве положительного контроля могут применяться более низкие концентрации SDS (например, от 0,25 % до 0,5 %) после демонстрации приемлемости и положительных результатов (см. [17], [19]).

Положительный контроль в носителе полярной экстракции должен быть приготовлен перед применением в каждый день эксперимента.

Необходимо использовать 20 %-ный раствор SDS от коммерческого поставщика (например, Fluka/Sigma, Cat # 05030 ¹⁾).

------------------------------

¹⁾_{Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO указанного продукта. Можно использовать эквивалентные продукты, если показано, что они приводят к тем же результатам.}

------------------------------

Особая процедура для экстрагентов: контроли экстрагентов (0,9 %-ный физиологический раствор и кунжутное масло) должны быть помещены в сосуд для экстракции (например, флакон из желтого стекла) и подвержены идентичной процедуре экстракции, например (72  2) ч при температуре (37  1) °C как с исследуемыми образцами. Если пробы должны быть испытаны прямым контактом с образцами ткани, то вышеописанный этап можно опустить.

Количество материалов для положительного контроля ограничено. В качестве положительного контроля для моделей RHE in vitro можно использовать полимер Y-4 (см. [22]), предоставленный Исследовательским институтом Хатано Центра продовольственной и лекарственной безопасности (Япония), или другие подтвержденные контроли при валидации, предоставленной соответствующими поставщиками. Силиконовый SDS может быть использован в качестве положительного контроля при экстракции физиологическим раствором, если это подтверждено.

6.5 Оценка эффективности испытания

6.5.1 Получение тканей реконструированного эпидермиса человека

Состав набора и процедуры пробы должны быть отражены документально (например, в MDS).

6.5.2 Подготовка и преинкубация

- Если инструкции изготовителя ткани того требуют, то преинкубируют ткань, поместив ее в культуральные планшеты надлежащего размера со средой согласно инструкциям изготовителя ткани.

- Наполняют соответствующее количество лунок свежей среды согласно инструкции изготовителя.

- В стерильных условиях открывают планшеты, содержащие ткани RHE. Под стерильным воздушным потоком убирают крышку и аккуратно (используя стерильный пинцет) извлекают каждую вкладку, содержащую эпидермальную ткань. Удаляют какую-либо остающуюся агарозу, прилегающую к внешним сторонам вкладки, путем осторожного промакивания стерильной фильтровальной бумагой или марлей и помещают ткани в подготовленные стерильные лунки со свежей средой.

- Визуально проверяют, не осталось ли агарозы, и переносят ткань на свежую среду, наклоняя вставку, чтобы избежать образования пузырьков под ней.

Примечание - 24-луночный планшет, используемый для транспортировки, можно хранить запечатанным при комнатной температуре для проверки на предмет признаков возможной контаминации к концу недели.

- Проверяют состояние тканей RHE и регистрируют изменения в тканях.

- Переносят вкладки с тканями в лунки предварительно наполненных планшетов в соответствии с инструкциями изготовителя. Преинкубируют ткани при температуре (37  1) °C, (5  1) % CO ₂ во влажной среде инкубатора согласно указаниям изготовителя тканей.

6.6 Нанесение исследуемой пробы и промывание

6.6.1 Общие положения

Хотя проведение исследования на раздражение in vitro соответствует одинаковым принципам для всех моделей, необходимо осознавать, что при выполнении проб могут возникнуть второстепенные различия между конкретными моделями.

Если существует стандартная операционная процедура (СОП) для конкретной модели RHE, то необходимо следовать СОП изготовителя, учитывая особые аспекты (например, время воздействия) для исследования экстракта МИ как представлено в настоящем стандарте. Перед применением модели RHE, указанной в OECD 439, для исследования либо экстрактов МИ, либо МИ, либо и тех, и других необходимо продемонстрировать применимость конкретной модели. Данные коммерческие или оптимизированные инструкции должны, при применении с системами МИ, приводить к результатам, эквивалентным уже утвержденным методам, включенным в настоящий стандарт.

6.6.2 Подготовка

- Предварительно подогревают поддерживающую культуральную среду до комнатной температуры.

- Удаляют преинкубационные планшеты из инкубатора примерно за 5 мин до воздействия на экстракты.

- Перед воздействием на экстракты:

- подготавливают культуральные планшеты соответствующего размера для инкубации тканей RHE с исследуемыми образцами и контролями;

- маркируют все крышки планшетов кодами исследуемой пробы; по три ткани/лунки на исследуемую пробу и контроли;

- освежают среду под вкладками (добавляют нужное количество среды) или переносят вкладки в новый планшет со свежей средой.

6.6.3 Воздействие исследуемого экстракта и контролей

- Наносят (100  2) мкл (т.е.  200 мкл/см ²) неразбавленных исследуемых образцов (т.е. экстрактов МИ), контролей среды, отрицательного или положительного контроля на поверхности каждой из трех отдельных тканей. Используют кончик пипетки для аккуратного распределения исследуемого образца на наружной поверхности эпидермиса. Последовательность нанесения важна, так как она должна соблюдаться при промывании.

Примечание - Модельная поверхность является гидрофобной, и важно удостовериться, что 100 мкл хорошо распределены по всей поверхности эпидермиса. Иногда с полярными растворителями из-за механизмов напряженности поверхности капля распределяется только по периферии эпидермиса. В таком случае либо используют кончик пипетки, чтобы расправить образец, или пинцет для того, чтобы поместить вкладку на дно планшета, пока не покрыта вся поверхность эпидермиса. Дополнительно для масляных экстрактов можно использовать шарикоголовую стеклянную пипетку Пастера для распределения исследуемого образца, чтобы обеспечить нужный контакт со всем эпидермисом.

- Помещают планшеты с тканями в ламинарный бокс до окончания обработки всех образцов.

- После обработки последней ткани переносят все планшеты в увлажненную среду инкубатора [температуре (37  1) °C, (5  1) % CO ₂] для необходимого времени воздействия.

Примечание - При анализе по круговой системе время инкубации составляет (18  1) ч для тканей EpiDerm _ модели EPI-200 и (24  2) ч для SkinEthic _ модели RHE.

- После воздействия тщательно промывают ткани стерильным DPBS или PBS, наполняя и опустошая тканевую вкладку несколько раз для удаления какого-либо остаточного материала исследуемого образца. Рекомендуется 15-25-кратное промывание. Необходимо следовать конкретным инструкциям, если таковые предоставлены изготовителем модели RHE. Промывание не должно быть слишком осторожным, иначе исследуемый образец не будет полностью удален.

- После промывания вкладки удаляют остаточный DPBS или PBS путем переворачивания и легкого встряхивания вкладки. Осушивают вкладку переворачиванием на стерильную впитывающую бумагу.

- Осушивают поверхность вкладки (например, используя двусторонний тампон).

- Переносят просушенные вкладки ткани в подходящие контейнеры или лунки планшета культивирования тканей, заранее наполненные свежей средой пробы (0,3 мл/лунку), пока все ткани не промыты. Переходят к инкубации МТТ.

Если следы исследуемого образца продолжают находиться на поверхности, то необходимо постараться удалить их стерильным намоченным ватным тампоном. Регистрируют данную процедуру. Поверхность ткани может быть оценена визуально диссектирующим стереоскопом.

Примечание - До оценки жизнеспособности RHE можно собрать культуральную среду под вкладкой для дополнительного определения цитокинов. Сокращение выживания ткани сопровождается выделением IL 1 (см. [13], [17], [19]).

6.7 Анализ МТТ для определения жизнеспособности ткани реконструированного эпидермиса человека после воздействия

6.7.1 Инкубация с МТТ и экстракция изопропанолом

Жизнеспособность ткани RHE оценивают измерением сокращения МТТ. Измерение количества МТТ проводят незамедлительно после окончания воздействия. Остатки исследуемых проб удаляют промыванием тканей.

Подготовка раствора МТТ и предварительное наполнение 24-луночного планшета (300 мкл/лунка) должны быть проведены до начала процедуры промывания.

- Подготавливают среду МТТ и 24-луночные планшеты со средой пробы. Пипетируют 300 мкл среды МТТ (концентрация 1 мг/мл) в каждую лунку требуемого числа 24-луночных планшетов.

- Удаляют вкладки из временных чашек хранения, высушивают нижнюю сторону каждой вкладки путем прижимания ее к стерильной впитывающей бумаге или стерильным ватным тампоном и переносят их в 24-луночные планшеты, предварительно наполненные 300 мкл МТТ (1 мг/мл). Помещают планшеты в инкубатор [температура (37  1) °C, (5  1) % CO ₂, во влажной атмосфере], отмечают время начала инкубации МТТ (например, в MDS) и инкубируют 3 ч  5 мин.

- После завершения инкубации с МТТ промакивают остатки среды с МТТ с тканевых вкладышей и переносят ткани в подходящие контейнеры или лунки планшетов культивации тканей, предварительно наполненные нужным количеством изопропанола согласно инструкциям поставщика RHE.

- Запечатывают контейнеры или планшеты пленкой (например, применяя Parafilm  ¹⁾) или помещают в запечатываемый пластиковый пакет во избежании испарения экстрагента. Отмечают время начала экстракции (например, в MDS) и экстрагируют формазаном в течение по меньшей мере 2 ч при комнатной температуре, с осторожным встряхиванием на планшетном шейкере при скорости примерно 120 об/мин. В качестве альтернативы также возможна экстракция в течение ночи (от 18 до 24 ч). Запечатывают планшеты, как описано выше, и экстрагируют при комнатной температуре или в холодильнике в темноте без встряхивания. Перед анализом экстрактов встряхивают, по меньшей мере 15 мин, на планшетном шейкере.

------------------------------

¹⁾_{Parafilm является зарегистрированной торговой маркой продукта, поставляемого Пекини Плэстик Пэкэджинг (Pechiney Plastic Packaging), находящимся по адресу 8770 W Брин Мор Авеню, Чикаго, Иллинойс, 60631, США. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой ISO означенного продукта. Можно использовать эквивалентные продукты, если показано, что они приводят к тем же результатам.}

------------------------------

- После инкубации прокалывают пленку (пакет) и ткань острой или инъекционной иглой 20-го калибра для получения всего экстракта из соответствующей лунки. Получают раствор с растворенным формазаном для измерения абсорбции. Перед переносом экстракта из контейнеров или луночных чашек в 96-луночные планшеты проводят пипеткой вверх и вниз не менее 3 раз для получения однородного экстрагента.

6.7.2 Измерения абсорбции

- Переносят на каждый образец ткани 2 или 3  200 мкл аликвот (= 2 или 3 лунки на образец ткани) из каждой исследуемой лунки на 96-луночный плоскодонный микротитрационный планшет (с соответствующей маркировкой) в зависимости от инструкций поставщика RHE. Один 96-луночный планшет используют для каждого измерения.

Примечание - Следует соблюдать осторожность во избежание испарения изопропанола на 96-луночных планшетах. VC1 и VC2 на планшетных картах в приложении C всегда являются контролями для 0,9 % солевого раствора и кунжутного масла. В пробе RHE in vitro применяется контрольный фон изопропанола для определения OD в пробе RHE.

- Измеряют OD на спектрофотометре для 96-луночных планшетов, используя светофильтр согласно инструкциям изготовителя и раствор изопропанола в качестве фонового контроля. Как правило, применяют фильтр в 570 нм или 630 нм.

Примечание - Измерение при 570 нм проводят без эталонного фильтра, так как "классический" эталонный фильтр, часто используемый в исследовании с МТТ (630 нм), все еще находится в пределах диапазона длин волн абсорбции формазана. Поскольку фильтры имеют определенный диапазон, их использование может привести к уменьшению динамического диапазона выходного сигнала.

6.8 Критерии приемлемости исследования

Критерии приемлемости отрицательного контроля и контроля экстрагента: данные NC и VC в общем отвечают критерию приемлемости, если среднее значение OD трех образцов тканей  0,7 и меньше 3,0 при 570 нм. Данные значения являются минимальными и максимальными значениями OD для различных моделей RHE и различаются в зависимости от инструкций поставщика модели RHE (см. OECD 439). Значения OD должны отвечать критериям приемлемости конкретным для каждой модели как обозначено в OECD 439. Значение считается достоверным, если стандартное отклонение средней жизнеспособности трех образцов тканей под воздействием после инкубации с NC или VC равно  20 %. Средняя тканевая жизнеспособность VC должна быть в NC диапазоне от 80 % до 120 %.

Критерии приемлемости положительного контроля: данные PC соответствуют критерию приемлемости, если средняя жизнеспособность, выраженная как процент NC, является < 40 %, а стандартное отклонение жизнеспособности образцов тканей во всех повторах составляет  20 %.

Примечание - Если Y-4 применяется в качестве материала положительного контроля, можно использовать клетки с жизнеспособностью < 50 % вместо < 40 % в соответствии с данными из первоисточника при циклических исследованиях для экстрактов МИ (см. [6]).

Критерии приемлемости исследования: все данные исследуемых проб считаются достоверными, если данные отрицательных и положительных контролей экстрагента отвечают вышеуказанным критериям.

Критерии приемлемости данных исследуемой пробы: данные считаются достоверными, если стандартное отклонение средней жизнеспособности реплицированных тканей  20 %. Если это требование не выполнено, исследование необходимо повторить.

6.9 Этап вычисления данных

6.9.1 Общие положения

Следующие этапы расчета применимы к большинству исследуемых проб со следующими характеристиками:

- не взаимодействует с реагентом МТТ (см. 6.2.2), неокрашенная, с низкой способностью окрашивать ткани;

- и измеренным значением неспецифической окраски  5 % относительно NC.

6.9.2 Фоновый контроль изопропанола для оптической плотности в пробе реконструированного эпидермиса человека

Вычисляют среднюю OD от шести репликатов раствора изопропанола для каждого планшета.

Вычисляют стандартное отклонение между оптической плотностью каждой ткани.

6.9.3 Отрицательные контроли, обработанные фосфатно-солевым буферным раствором Дюльбекко и фосфатно-солевым буферным раствором

Корректируют фоновое значение изопропанола путем вычитания среднего значения OD фона изопропанола из OD отрицательных DPBS или контролей, обработанных PBS.

Рассчитывают среднюю OD на образцы ткани (три репликата/повторения).

Средняя OD для всех образцов тканей соответствует 100 % жизнеспособности.

Рассчитывают стандартное отклонение между OD каждого образца ткани и жизнеспособностью.

6.9.4 Положительный контроль

- Вычисляют скорректированное значение фона изопропанола вычитанием средней оптической плотности фона изопропанола из оптической плотности положительного контроля.

- Вычисляют среднюю оптическую плотность на ткань (три репликата).

- Вычисляют жизнеспособность на ткань путем деления средней OD ткани PC на среднюю OD ткани NC и умножения результата на 100.

- Вычисляют среднюю жизнеспособность для всех тканей.

- Вычисляют стандартное отклонение между оптической плотностью каждой ткани и жизнеспособностью.

6.9.5 Исследуемый экстракт и VC проба (TTs)

- Корректируют фоновое значение изопропанола путем вычитания средней OD фона изопропанола из OD исследуемого экстракта.

- Рассчитывают средний OD на образцы ткани (три репликата/повторения).

- Рассчитывают жизнеспособность на ткань путем деления средней OD ткани ТТ на среднюю OD ткани NC и умножения результата на 100.

- Рассчитывают среднюю жизнеспособность для всех образцов тканей.

- Рассчитывают стандартное отклонение между OD каждого образца ткани и жизнеспособностью.

Процент жизнеспособности каждого обработанного эпидермиса рассчитывают относительно среднего значения отрицательных контролей. Также необходимо вычислить коэффициент вариативности (CV). Средняя относительная жизнеспособность трех тканей используется для классификации данных в соответствии с моделью прогнозирования.

6.10 Интерпретация данных - Прогностическая модель

Раздражающий потенциал исследуемых образцов прогнозируется средней жизнеспособностью тканей под воздействием исследуемого образца. Среднюю жизнеспособность вычисляют по трем отдельным тканям. Раздражающий потенциал прогнозируется, если средняя относительная жизнеспособность равна или ниже 50 % отрицательного контроля.

Для МИ или его компонента, экстрагированного как полярным (например, физраствор), так и неполярным (например, кунжутное масло) растворителем, если как минимум один из экстрактов оказывает положительный эффект на ткани (жизнеспособность  50 % и SD < 20 %), исследуемое изделие или его компонент будут считаться имеющими раздражающую активность (см. таблицу 1). Если изделие или его компонент не является раздражающим (жизнеспособность > 50 %) с двумя растворителями, то изделие или его часть считают нераздражающими.

Таблица 1 - Классификация исследуемой пробы

Критерий для интерпретации In vitro	Классификация
Средняя жизнеспособность ткани составляет  50 % по меньшей мере в одном экстрагенте	Раздражитель (I)
Средняя жизнеспособность ткани составляет > 50 % в двух экстрагентах	Не раздражитель (NI)

Примечание - В случае чистых химических веществ модель RHE in vitro для исследования раздражающего действия обнаруживает раздражители, классифицируемые согласно UN GHS, категории 2 (раздражитель) и категории 1 (коррозия кожи), как указано в OECD 439 и OECD 431 (см. [31]). Дополнительно она может идентифицировать нераздражающие химические вещества "низкой опасности" по категории UN GHS когда жизнеспособность тканей превышает 50 %. В таблице 3 (реакции на раздражение in vivo) модели RHE идентифицируют категории реакции как "незначительные" и "серьезные".

6.11 Бланк документации метода

В качестве примера в приложении C приводится MDS для управления данными, позволяющая осуществлять надлежащий контроль качества (т.е. правильная установка, калибровка, функционирование оборудования и качество заготовок). Для каждых партий эпидермиса и эксперимента сохраняют оригиналы необходимых MDS, заполняют дату экспериментов, вносят требуемую информацию в таблицы и подписывают MDS.

6.12 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать, по меньшей мере, следующие сведения:

- описание исследуемого материала(ов) или изделия;

- подробное описание метода, использованного при приготовлении исследуемых образцов;

- описание примененной модели RHE;

- копию сертификата контроля качества используемой партии тканей (предоставляется изготовителем модели RHE);

- описание протокола пробы, включая метод введения образца и время воздействия;

- запись наблюдений за тканями;

- все индивидуальные необработанные данные (например, OD для каждой лунки), связанные с определением жизнеспособности тканей;

- оценку результатов и классификацию испытуемых проб/образцов;

- примененный международный стандарт (включая год публикации);

- любые отклонения от процедуры;

- любые наблюдаемые необычные свойства;

- дату исследования.

7 Исследования раздражения in vivo

7.1 Общие положения

Исследование раздражающих свойств МИ, их компонентов, биоматериалов или всего вышеуказанного может проводиться на изделиях, их компонентах, самих биоматериалах или их экстрактах либо на всем вышеуказанном.

Факторы, влияющие на результаты исследований раздражения in vivo, включают следующее:

- природу изделия, используемого в кожной пробе;

- дозу исследуемого материала;

- способ нанесения исследуемого материала;

- степень окклюзии;

- место нанесения;

- количество и длительность воздействия;

- методы, применяемые при оценке исследования.

Дополнительная информация представлена в приложении F.

В то время как гибкость в отношении точного соблюдения протокола позволяет исследователю повысить чувствительность исследования в соответствии с условиями применения и воздействием на человека, последовательность процедуры способствует сопоставимости результатов исследований с различными материалами и из разных лабораторий.

В процедуры исследований были включены положения для оценки изделий и материалов, которые будут подвергаться либо повторному, либо длительному воздействию, либо и тому, и другому. Исследование должно быть предназначено для преувеличения ожидаемого контакта (либо по времени, либо по концентрации, либо и то, и другое) в клинической ситуации. Об этом необходимо помнить при интерпретации результата.

Если pH исследуемого образца  2,0 или  11,5, то материал будет считаться раздражающим и дальнейшее исследование не требуется (см. OECD 404). Тем не менее экспериментальные данные указывают, что кислотность и щелочность исследуемого материала не являются единственными факторами, рассматриваемыми в отношении способности материала вызвать серьезные повреждения. Концентрация исследуемого образца, время его контакта, а также многие другие физические и химические свойства тоже являются важными.

В исключительных случаях, когда требуется дальнейшая оценка/характеристика риска, возможно появление необходимости исследования материалов, которые либо являются раздражителем, либо имеют pH вне диапазона, обозначенного выше. Такие случаи должны быть обоснованы и отражены документально.

7.2 Исследование раздражения на кожу животных

7.2.1 Принцип

Проводят оценку способности исследуемого материала вызывать раздражение кожи на подходящей модели животного.

Кролик (Oryctolagus cuniculus) является предпочтительной моделью животного для данного исследования.

7.2.2 Исследуемые образцы

Если исследуемый образец является твердым или жидким веществом, то он должен быть подготовлен согласно приложению A.

Необходимо продемонстрировать чувствительность метода. Это достигается включением в процедуру исследования положительного контроля. Применение положительного контроля требуется только когда испытательная лаборатория не получила положительных результатов, используя метод испытания в течение предшествующих шести месяцев.

Примечание - Надлежащим положительным контролем является SDS, также известный как лаурилсульфат натрия (SLS).

7.2.3 Животные и условия их содержания

Следует использовать трех здоровых молодых взрослых кроликов-альбиносов любого пола одной линии массой не более 2 кг. Так как кожное раздражение не будет отличаться у самцов и самок, можно использовать животных любого пола. При этом самки должны быть нерожавшими и небеременными. При ожидаемом раздражении необходимо рассмотреть первоначальное исследование на одном животном. Если не наблюдается хорошо определяемой положительной реакции, превышающей 2 балла по шкале на эритему или эдему (см. таблицу 2), то должно быть использовано как минимум два дополнительных животных. Если реакция при исследовании с использованием трех животных является неоднозначной, то следует рассмотреть возможность продолжения дальнейшего исследования.

Животные должны быть акклиматизированы и получать уход согласно ISO 10993-2.

7.2.4 Процедура исследования

7.2.4.1 Подготовка животных

Состояние кожи является критическим фактором. Используют только животных со здоровой, неповрежденной кожей. Шерсть со спины животных, как правило, состригают от 24 до 4 ч до исследования. Необходимо состричь достаточный участок (примерно 10  15 см) вдоль обеих сторон позвоночника для нанесения пробы и наблюдения. Шерсть можно состригать повторно либо для облегчения наблюдения, либо для удобства повторных воздействий, или и того, и другого. Подготовленные профессионалы могут использовать депиляторы, если процесс был валидирован в исследовательской организации и если депиляторы не вызовут раздражающий ответ. Если требуются повторные воздействия, то необходимо следовать процедурам в соответствии с 7.2.4.2.1, 7.2.4.2.2 или 7.2.4.2.3. Повторное исследование на раздражающее действие может быть проведено спустя 21 день.

7.2.4.2 Нанесение исследуемой пробы

7.2.4.2.1 Нанесение пробы в форме порошка или жидкости

Наносят 500 мг или 500 мкл исследуемого материала непосредственно на каждый исследуемый участок кожи, как показано на рисунке 1. Для твердых и гидрофобных материалов увлажнение не требуется. Если материал в форме порошка, то он должен быть слегка увлажнен водой или другим подходящим экстрагентом перед нанесением (см. приложение A). Два участка наблюдения должны быть обработаны каждой исследуемой и контрольной пробами (см. рисунок 1).

Закрывают места нанесения неокклюзионной подушечкой (такой, как впитывающая марлевая салфетка) размерами 2,5  2,5 см, а затем накладывают повязку (полуокклюзионно или окклюзионно) на место нанесения минимум на 4 ч. По окончании времени контакта удаляют повязку и отмечают положения участков несмываемым маркером, не являющимся раздражителем кожи. Удаляют остатки исследуемого образца подходящим способом, например промыванием теплой водой или другим подходящим нераздражающим раствором, и тщательно просушивают.

1 - голова; 2 - исследуемая область; 3 - контрольная область; 4 - выстриженная дорсальная область; 5 - хвост

Рисунок 1 - Расположение областей для аппликации

7.2.4.2.2 Нанесение экстрактов и контролей экстрактов

Наносят соответствующий экстракт или экстракты на впитывающие марлевые подушечки размером 2,5  2,5 см. Используют объем экстракта, достаточный для пропитывания марли, как правило, 500 мкл на подушечку. Помещают подушечку на каждый бок животного, как показано на рисунке 2. Наносят контрольную марлевую подушечку, смоченную экстрагентом, как показано на рисунке 1.

Закрывают места нанесения повязкой (полуокклюзионной или окклюзионной) как минимум на 4 ч. По истечении времени контакта удаляют повязку и отмечают положения участков, используя несмываемый маркер, не являющийся раздражителем кожи. Удаляют остатки исследуемого образца подходящим способом, например промыванием теплой водой или другим подходящим раствором, и тщательно просушивают.

7.2.4.2.3 Нанесение твердой пробы

Нанесите образцы исследуемой пробы непосредственно на кожу каждого бока каждого кролика, как показано на рисунке 1. Таким же образом наносят контрольные образцы. При исследовании твердых образцов (которые могут быть измельчены в порошок) они должны быть достаточно увлажнены водой или, при необходимости, соответствующим раствором для обеспечения хорошего контакта с кожей (см. приложение A). При использовании растворов необходимо учитывать их влияние на раздражение кожи, вызванное исследуемым материалом.

Закрывают места нанесения неокклюзионной подушечкой (например, марлевой салфеткой) размером 2,5  2,5 см, затем накладывают повязку на места нанесения (полуокклюзионно или окклюзионно) как минимум на 4 ч. По истечении времени контакта удаляют повязку и отмечают положения участков, используя несмываемый маркер, не вызывающий раздражение кожи. Удаляют остатки исследуемой пробы подходящим способом, например промыванием теплой водой или другим подходящим нераздражающим раствором, и тщательно просушивают.

7.2.5 Наблюдение за животными

7.2.5.1 Общие положения

Для визуальной оценки кожных реакций рекомендуется использовать естественное освещение или освещение со светом полного спектра.

Описывают и оценивают кожные реакции на предмет эритемы и эдемы согласно системе оценки, приведенной в таблице 2, для каждого места нанесения в каждом временном интервале и регистрируют результаты для отчета исследования.

Примечание - В определенных случаях могут помочь гистологические или неинвазивные техники оценки кожных реакций.

7.2.5.2 Исследование с однократной экспозицией

Для исследований однократного воздействия отмечают внешний вид каждого участка нанесения при (1  0,1) ч, (24  2) ч, (48  2) ч и (72  2) ч после удаления подушечек. При наличии устойчивых язв для оценки обратимости или необратимости процесса может потребоваться увеличение срока наблюдения до 14 дней. Животные должны наблюдаться как минимум раз в день в течение этого увеличенного срока.

7.2.5.3 Исследование с повторными экспозициями

Повторное воздействие можно проводить только после завершения исследования острого однократного воздействия [после как минимум (72  2) ч наблюдения]. Повторное воздействие должно ограничиваться предназначенным клиническим применением изделия.

Повторное воздействие после незначительной реакции в исследовании однократного воздействия должно быть обосновано.

Для исследований повторного воздействия отмечают внешний вид мест нанесения через (1  0,1) ч после удаления подушечек и сразу перед следующим нанесением. Количество воздействий может различаться.

После последнего воздействия отмечают внешний вид каждого места нанесения через (1  0,1), (24  2), (48  2) и (72  2) ч после удаления подушечек. При наличии устойчивых язв для оценки обратимости или необратимости процесса может потребоваться увеличение срока наблюдения до 14 дней. Животных следует наблюдать как минимум раз в день в течение этого увеличенного срока.

7.2.6 Оценка результатов

Реакции в различных временных точках после нанесения должны оцениваться согласно таблице 2.

Таблица 2 - Система оценки кожной реакции

Реакция	Оценка раздражения
Образование эритемы и струпа
Отсутствие эритемы	0
Очень незначительная эритема (практически незаметная)	1
Хорошо определяемая эритема	2
Умеренная эритема	3
Сильная эритема (свекольного цвета) до формирования струпа, мешающего оценке эритемы	4
Образование отека (эдемы)
Отсутствие эдемы	0
Очень незначительный отек (эдема, практически незаметная)	1
Хорошо определяемый отек (эдема, определенно поднятые края хорошо определяются)	2
Умеренный отек (эдема, поднятая примерно на 1 мм)	3
Сильный отек (эдема, поднятая более чем на 1 мм и простирающаяся за пределы зоны воздействия)	4
Максимально возможный балл раздражения	8
Другие нежелательные явления на кожных участках должны быть отражены документально и сообщены.

Для исследований однократного воздействия определяют индекс первичного раздражения (PII) следующим способом.

Для вычислений используют только наблюдения через (24  2), (48  2) и (72  2) ч. Наблюдения, сделанные до введения или через 72 ч для мониторинга восстановления, не используют в данном определении.

После 72-часовой оценки все баллы эритемы, плюс баллы эдемы (24  2), (48  2) и (72  2) ч подсчитывают отдельно для каждого исследуемого образца и бланковой пробы для каждого животного. Основной балл раздражения на животное подсчитывают делением суммы всех баллов на 6 (два участка исследования/наблюдения, три временные точки).

Для получения первичного индекса раздражения для исследуемой пробы суммируют все основные баллы раздражения отдельных животных и делят на количество животных (как правило, три).

При использовании контроля экстрагента или отрицательного контроля вычисляют первичный балл раздражения для контролей и вычитают этот балл из балла с использованием исследуемого образца для получения первичного балла раздражения.

Для исследования при повторных воздействиях первичный балл раздражения для каждого животного следует вычислять по вышеуказанному принципу, учитывая все точки оценки. При повторных воздействиях определяют суммарный индекс раздражения следующим образом.

Складывают баллы раздражения всех животных и делят на общее количество животных. Данное значение является суммарным индексом раздражения.

Суммарный индекс раздражения сравнивают с категориями ответной реакции, приведенными в таблице 3, и соответствующую категорию ответа отражают в отчете.

Примечание - Категории раздражения основываются на данных, сравнивающих первичный индекс раздражения химическими веществами у кроликов с первичным индексом раздражения у человека на те химические вещества, которые были исследованы на обоих видах.

При любой ответной реакции отражают документально максимальный первичный балл раздражения, приведенный в таблице 3, для каждого животного, время начала реакции и время максимальной реакции.

Первичный или суммарный индекс раздражения характеризуется числом (баллом) и описанием (категорией ответа), приведенным в таблице 3. При исследовании разных экстрактов категорию ответа определяют экстрактом с самым высоким PII.

Таблица 3 - Категории первичного или суммарного индекса раздражения у кроликов

Средний балл	Категория ответной реакции
0-0,4	Незначительная
0,5-1,9	Легкая
2-4,9	Умеренная
5-8	Сильная

7.2.7 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать:

- описание исследуемого материала или материалов или изделия;

- предназначенное использование/применение исследуемого материала или материалов или изделия;

- детальное описание метода, применяемого при приготовлении исследуемого образца или исследуемого материала;

- описание исследуемого животного/животных;

- метод нанесения на исследуемые участки и тип (полуокклюзивный или окклюзивный) материала перевязки;

- как обозначались участки нанесения, проводилась оценка;

- записи наблюдений;

- количество воздействий и интервалы между ними, когда проводилось повторное воздействие;

- оценку результатов;

- примененный международный стандарт (включая год его публикации);

- любые отклонения от процедуры;

- любые наблюдаемые необычные свойства;

- дату исследования.

7.3 Исследование раздражения на животных при внутрикожном (интрадермальном) введении

7.3.1 Введение

Для МИ, контактирующих с поврежденной или подверженной опасности повреждения поверхностью, присоединяемых извне или имплантатов, рекомендуется исследование внутрикожной (интрадермальной) реактивности. Проводят оценку способности исследуемого образца вызывать раздражение после внутрикожной инъекции экстрактов из образца.

7.3.2 Исключение из исследования

Любой материал, который был известен либо показал себя в предварительных исследованиях как раздражитель кожи, глаз или слизистой, или материал с pH  2,0 или  11,5, не должен исследоваться внутридермально (см. OECD 404). В исключительных случаях, когда требуется дальнейшая оценка/характеристика риска, может быть необходимо исследовать материалы, которые либо являются раздражителем, либо имеют pH вне диапазона, обозначенного выше. Такие случаи должны быть обоснованы и отражены документально.

7.3.3 Исследуемая проба

Исследуемая проба должна являться экстрактом, приготовленным в соответствии с приложением A. Так как на каждом животном находятся несколько участков для исследования, можно нанести несколько исследуемых проб вместе с соответствующими отрицательными контролями или контролем экстрактанта. Для данного исследования не существует положительного эталонного материала, тем не менее некоторые химикаты (SDS, гептановая кислота, молочная кислота, нонановая кислота) дадут положительную реакцию. Во избежание некроза кожи должны быть использованы низкие концентрации, вызывающие раздражение с интенсивностью > 1 балла (см. 7.3.7). Применение положительного контроля для подтверждения чувствительности метода требуется только когда испытательная лаборатория не получала положительных результатов при использовании метода исследования за предыдущие шесть месяцев.

Некоторые МИ, такие как кожные наполнители (филлеры), следует осторожно дозировать, так как кожный наполнитель (филлер) останется в месте введения, его не следует путать с отеком.

7.3.4 Животные и условия их содержания

Следует использовать здоровых, молодых и взрослых кроликов-альбиносов любого пола одной линии массой не менее 2 кг. Так как не ожидается, что кожное раздражение будет различаться у самцов и самок, можно использовать любой пол. Используемые самки должны быть нерожавшими и небеременными. Животные должны быть акклиматизированы и получать уход согласно ISO 10993-2. Необходимо использовать как минимум трех животных для оценки исследуемого материала. При ожидаемом раздражении необходимо рассмотреть предварительное исследование на одном животном. Если не наблюдается хорошо определяемый положительный ответ, превышающий 2 балла по шкале оценки на эритему или отек (см. таблицу 4), то необходимо использовать минимум двух дополнительных животных. Если ответная реакция при исследовании с использованием минимум трех животных неоднозначна, то необходимо рассмотреть возможность дальнейшего исследования.

7.3.5 Процедура исследования

В течение периода от 4 до 18 часов до исследования коротко подстригают шерсть на спинах животных, оставляя достаточное расстояние с обеих сторон позвоночника для инъекции экстрактов.

Вводят внутрикожно 200 мкл экстракта, полученного при помощи полярного или неполярного экстрактанта, в пять участков на одном боку каждого кролика. Для внутрикожных инъекций используют самую маленькую иглу, соответствующую вязкости исследуемого образца.

Пример расположения мест инъекции приведен на рисунке 2.

Таким же образом вводят 200 мкл полярного или неполярного контроля экстрагента в пять участков противоположного бока каждого кролика (например, см. рисунок 2).

Если используют другие экстрагенты и контроли экстрагента, то повторяют вышеописанные действия.

1 - голова; 2 - 200 мкл инъекции полярного экстракта; 3 - 200 мкл инъекции неполярного экстракта; 4 - 200 мкл инъекции контрольного полярного экстрагента; 5 - 200 мкл инъекции контрольного неполярного экстрагента; 6 - хвост

Рисунок 2 - Размещение мест инъекций

7.3.6 Наблюдение за животными

Отмечают внешний вид каждого места инъекции сразу после инъекции и через (24  2), (48  2) и (72  2) ч после инъекции.

Оценивают реакцию ткани на эритему и отек согласно системе, приведенной в таблице 4, для каждого места инъекции и при каждом наблюдаемом временном интервале и записывают результаты.

Примечание 1 - Интрадермальная инъекция масла часто вызывает воспалительную ответную реакцию.

Чтобы помочь оценить ответную реакцию для определения зоны раздражения, через (72  2) ч можно провести внутривенное введение подходящего витального красителя, такого как трипановый синий или синий Эванса.

Примечание 2 - Можно применять гистологические или неинвазивные методы при их наличии для помощи в оценке.

Таблица 4 - Система баллов для внутрикожной (интрадермальной) реакции

Реакция	Оценка раздражения
Образование эритемы и струпа
Отсутствие эритемы	0
Слабая эритема (практически незаметная)	1
Четко выраженная эритема	2
Умеренная эритема	3
Резко выраженная эритема (свекольного цвета) свекольно-красного цвета до формирования струпа, мешающего оценке эритемы	4
Образование отека (эдемы)
Отсутствие отека (эдемы)	0
Слабый отек (эдема, практически незаметная)	1
Четко выраженный отек (эдема) (края области отчетливо приподняты)	2
Умеренный отек (эдема) (поднятие области примерно на 1 мм)	3
Резко выраженный отек (эдема) (поднятие области более чем на 1 мм и распространение за пределы зоны воздействия)	4
Максимально возможный балл раздражения	8
Другие нежелательные изменения на участках кожи должны быть задокументированы и сообщены.

7.3.7 Оценка результатов

После (72  2) ч все баллы степени эритемы плюс все баллы степени отека через (24  2), (48  2) и (72  2) ч суммируют отдельно для каждой испытуемой пробы или контроля экстрагента для каждого отдельного животного. Для вычисления балла исследуемой пробы или контроля экстрагента каждого отдельного животного делят все суммы на 15 (3 засчитываемые временные точки  5 исследуемых участков или контролей экстрагента). Для определения общего среднего балла для каждого исследуемого образца и каждого соответствующего контроля экстрагента складывают баллы у трех животных и делят их на три. Итоговый балл оценки может быть получен вычитанием балла контроля экстрагента из балла исследуемого образца. Требования исследования удовлетворены, если итоговый балл исследуемого образца меньше или равен 1,0. Если результаты непоследовательны от животного к животному или контроли ведут себя непредсказуемо, то, ставя под вопрос интерпретацию результатов, исследование можно повторить на трех дополнительных кроликах.

Итоговый балл, меньше или равный 1,0, будет классифицирован как нераздражитель in vitro в модели RHE.

Проба контроля экстрагента является полярным или неполярным контролем экстрагента, как указано на рисунке 2.

7.3.8 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать следующую информацию:

- описание исследуемых материалов или изделия;

- предполагаемое использование/применение исследуемого материала/ов или изделия;

- подробное описание метода, использованного при приготовлении исследуемых образцов;

- описание подопытных животных;

- метод инъекции;

- как проводилась оценка местной реакции;

- запись наблюдений;

- оценку результатов;

- примененный международный стандарт (включая дату публикации);

- любые отклонения от процедуры;

- любые наблюдаемые необычные свойства;

- дату исследования.

8 Исследование раздражения на коже человека

8.1 Введение

Оценка потенциального риска раздражения также может быть проведена с использованием данных исследований накожных аппликаций на человеке.

Исследование на человеке может служить нескольким целям:

- прямая идентификация опасности для человека путем испытания химических веществ на людях, а не на лабораторных животных;

- предоставление оценки риска определенных химических веществ, контакт человека с которыми высок;

- облегчение экстраполяции на человека данных, полученных ранее в ходе лабораторных исследований на животных.

Настоящий стандарт позволяет получать данные о раздражении кожи непосредственно от людей для целей идентификации опасности. Его цель - определить, представляет ли материал или медицинское устройство значительную опасность раздражения кожи после острого воздействия.

Клинические исследования следует проводить в соответствии с ISO 14155. Дополнительные конкретные требования к клиническим исследованиям описаны в приложении E.

Примечание - Приложение F приводит дальнейшую информацию по исследованиям раздражения.

8.2 Предварительная оценка

Адекватная информация по профилю токсичности материала или МИ и (где применимо) составляющих его химических веществ, включая данные чрезкожной абсорбции, должны быть доступны, чтобы обозначить, что исследование не представляет какого-либо значительного риска для здоровья.

Материалы не должны быть исследованы на людях, если:

- было показано, что они являются раздражителем в прогностической пробе, in vitro или in vivo.

Примечание - В отдельных ситуациях может быть необходимым провести дополнительные исследования образцов раздражителей/экстрактов продуктов на людях для дальнейшей характеристики потенциального риска для человека;

- было показано, что они вызывают коррозию в прогностическом анализе, либо in vitro, либо in vivo;

- потенциальная коррозионная активность для кожи человека может быть предсказана либо на основе взаимосвязи структуры и активности, либо на основе физико-химических свойств, таких как сильный кислотный или щелочной показатель, либо и то, и другое;

- они представляют риск сенсибилизации кожи или респираторного тракта;

- они представляют любую острую токсичную опасность при условиях исследования;

- они представляют любую генотоксичную, репродуктивную или канцерогенную опасность.

Библиография

[1]	ISO 9394:2012, Ophthalmic optics - Contact lenses and contact lens care products - Determination of biocompatibility by ocular study using rabbit eyes (Оптика офтальмологическая. Контактные линзы и изделия по уходу за ними. Определение биосовместимости контактных линз на кроликах)
[2]	Agner Т. Noninvasive measuring methods for the investigation of irritant patch test reactions. A study of patients with hand eczema, atopic dermatitis and controls. Acta Derm. Venereol. Suppl. (Stockh.). 1992, 173 pp. 1-26
[3]	N., Tornier C., Robert C., Amsellem C., Roux M.-H., Doucet O. et al. A catch-up validation study on reconstructed human epidermis (SkinEthicTM RHE) for full replacement of the Draize skin irritation test. Toxicol. In Vitro. 2010, 24 pp. 257-266
[4]	Casas J.W., Lewerenz G.M., Rankin E.A., Willoughby J.A.Sr, Blakeman L.C., McKim J.M.Jr. et al. In Vitro Human Skin Irritation Test for Evaluation of Medical Device Extracts. Toxicol. In Vitro. 2013, 27 pp. 2175-2183
[5]	Coleman K.R., Grailer T.R., McNamara L.R., Rollins B.L., Christiano N.J., H. et al. Preparation of irritant polymer samples for an in vitro round robin study. Toxicol. In Vitro. 2018, 50 pp. 401-406
[6]	De Jong W.H., Hoffmann S., Lee M., H., Pellevoisin C., Haishima Y. et al. Round robin study to evaluate the reconstructed human epidermis (RhE) model as an in vitro skin irritation test for detection of irritant activity in medical device extracts. Toxicol. In Vitro. 2018, 50 pp. 439-449
[7]	Draize J.H., Woodand G., Calvery H.O. (1944) Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1944, 82 pp. 337-390
[8]	Draize J.H. Appraisal of the safety of chemicals in foods, drugs, and cosmetics, Austin, Texas, Association of food and drug officials of the United States, Texas State Department of Health, 1959
[9]	Faller C., Bracher M., Dami N., Roguet R. Predictive ability of reconstructed human epidermis equivalents for the assessment of skin irritation of cosmetics. Toxicol. In Vitro. 2002, 16 pp. 557-572
[10]	Hagi-Pavli E., Williams D.M., Rowland J.L., Thornhill M., Cruchley A.T. Characterizing the immunological effects of oral healthcare ingredients using an in vitro reconstructed human epithelial model. Food Chem. Toxicol. 2014, 74 pp. 139-148
[11]	Horita K., Tomita C., Yasoshima M., Matsunaga K. Optimal evaluation time point for patch testing to predict skin irritation of commercial topical drugs. J. Dermatol. 2015, 42 pp. 851-860
[12]	H., Hayden P., Klausner M., Kubilus J., Kearney P., Sheasgreen J. (2009): In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol. ATLA 37, 671-669, 2009
[13]	Kandarova H., Willoughby J.A., De Jong W.H., Letasiova S., Milasova Т., Bachelor M.A. et al. Pre-validation of an in vitro skin irritation test for medical devices using the reconstructed human tissue model EpiDerm _ Toxicol. In Vitro. 2018, 50 pp. 407-417
[14]	H., Bendova H., Letasiova S., Coleman K.P., De Jong W.H., Jirova D. Evaluation of the medical devices benchmark materials in the controlled human patch testing and in the RhE in vitro skin irritation protocol. Toxicol. In Vitro. 2018, 50 pp. 433-438
[15]	Lee C.H., Maibach H.I. The sodium lauryl sulfate model: an overview. Contact Dermat. 1995, 33 pp. 1-7
[16]	Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983, 65 pp. 55-62
[17]	Olsen D.S., Lee M., Turley A.P. Assessment of test method variables for in vitro skin irritation testing of medical device extracts. Toxicol. In Vitro. 2018, 50 pp. 426-432
[18]	Pellevoisin C., Tornier C., Bremond C., Rollins B., Briotet D., Turley A. et al. Skin irritation of medical devices: In vitro assay with EPISKIN reconstructed human epidermis (RHE). Toxicol. Lett. 2016, 258 (S63) p. viii
[19]	Pellevoisin C., Videau C., Briotet D., Gregoire C., Tornier C., Alonso A. et al. SkinEthic _ RHE for in vitro evaluation of skin irritation of medical device extracts. Toxicol. In Vitro. 2018, 50 pp. 419-425
[20]	SOP of in vitro skin irritation of medical devices extracts with SkinEthic _ RHE. EPISKIN SA, Lyon (France), Available at https://www.episkin.com/~/ media/Files/SOP-SkinEthic-RHE-lrritation-Medical-devices, 2018
[21]	In Vitro EpiDerm _ Skin Irritation Test (EPI-200-SIT). Protocol For use with MatTek Corporation's Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm _ (EPI-200-SIT). MK-24-007-0023. Available at https://www.mattek.com/wp-content/uploads/Medical-Devices-Testing-Protocol 201603010.pdf https://www.mattek.com/wp-content/uploads/EPI-200-SIT-Skin-lrritation_MK-24-007-0023_10_02_19.pdf, 2017
[22]	Nomura Y., Lee M., Fukui C., Watanabe K., Olsen D., Turley A., Morishita Y., Kawakami Т., Yuba Т., Fujimaki H., Inoue K., Yoshida M., Ogawa K., Haishima Y. Proof of concept testing of a positive reference material for in vivo and in vitro skin irritation testing. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2018, 106(8) pp. 2807-2814
[23]	Scott L., Eskes C., Hoffmann S., Adriaens E., N., Bufo M. et al. A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. In Vitro. 2010, 24 pp. 1-9
[24]	Wahlberg J.E., Wahlberg E.N. Quantification of skin blood flow at patch test sites. Contact Dermat. 1987, 17 pp. 229-233
[25]	Wahlberg J.E., Mailbach H.I. Nonanoic acid irritation - A positive control at routine patch testing? Contact Dermat. 1980, 6 pp. 128-130
[26]	Walters R.M., Khanna P., Hamilton M., Mays D.A., Telofski L. Human Cumulative Irritation Tests of Common Preservatives Used in Personal Care Products: A Retrospective Analysis of Over 45 000 Subjects. Toxicol. Sci. 2015, 148 pp. 101-107
[27]	York M., Griffiths H.A., Whittle E. et al. Evaluation of a human patch test for the identification and classification of skin irritation potential, Contact Dermatitis, 1996, 34, pp. 204-212
[28]	European Chemical Industry Ecology and Toxicology Centre Eye irritation testing, Monograph 11, Brussels, Belgium, 1988
[29]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Guidelines for testing of chemicals No. 405, Acute eye irritation/corrosion. OECD Publications, Paris, 2017
[30]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Guidelines for testing of chemicals. No. 430, In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER). OECD Publications, Paris, 2015
[31]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Test No. 431: In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OCDE, Paris, 2019
[32]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), Guidelines for testing of chemicals. No. 437. Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD Publications, 2020
[33]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Test No. 438: Isolated Chicken Eye Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OCDE, Paris, 2018
[34]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Guidelines for testing of chemicals. No. 460. Fluorescein Leakage Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants. OECD Publications, Paris, 2017
[35]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Test No. 491: Short Time Exposure In Vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OCDE, Paris, 2020
[36]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Test No. 492: Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OCDE, Paris, 2019
[37]	Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment, No. 34, OECD Publishing, Paris, 2005
[38]	British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeia 2016. London: TSO; 2016
[39]	European Pharmacopoeia, 10th Edition, European Pharmacopoeia, Council of Europe, B.P. 907, F-67029 Strasbourg, France, 2019
[40]	United States Pharmacopeia and National Formulary (USP 43-NF 38). Rockville, MD: United States Pharmacopeial Convention; 2020
[41]	Commission Regulation (EU) 2019/1390 of 31 July 2019 amending, for the purpose of its adaptation to technical progress, the Annex to Regulation (EC) No 440/2008 laying down test methods pursuant to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council on the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) (Text with EEA relevance) OJ L 247, 26.9.2019

Ключевые слова: медицинское изделие, оценка биологического действия, раздражение, общие требования к проведению исследований в процессе менеджмента рисков.