Приложение D (обязательное). Специальные исследования на раздражение

Приложение D
(обязательное)

Специальные исследования на раздражение

D.1 Общие положения

Существуют следующие специальные исследования на раздражение. Данные исследования применимы для МИ, предназначенных для применения в специфических областях. При применении необходимо предоставить обоснование для выбора метода исследования.

D.2 Исследование глазного раздражения

D.2.1 Общие положения

Исследование глазного раздражения должно рассматриваться только если данные по безопасности не могут быть получены другими способами и только для материалов, входящих в контакт с глазом или веком.

OECD 405 по острому глазному раздражению/коррозии (см. [29]) описывает пошаговую стратегию исследования in vivo для определения свойств химических веществ, раздражающих/корродирующих глаз. Используя эту стратегию, а также анализ по совокупности доказательств (когда вся доступная информация по способности к раздражению глаз рассматривается до перехода к исследованию in vivo), важно избегать необоснованного использования животных. Сокращение исследований веществ, приводящих к выраженной реакции у животных, содействует сбережению животных и надежности научных данных. Хотя TG 405 является методом исследования in vivo, он также поддерживает принцип 3 Rs в сокращении и улучшении исследований на животных. Данное исследование не было валидировано для экстрактов МИ.

D.2.2 Альтернативное исследование глазного раздражения in vitro

Было оценено несколько альтернативных методов исследований на глазное раздражение in vitro. Тем не менее, они еще не были валидированы для применения в исследованиях МИ. Ни одно исследование in vitro не способно заменить исследование глазного раздражения in vivo, охватывая все конечные точки in vivo. Тем не менее стратегические комбинации нескольких альтернативных методов исследования внутри (многоуровневой) стратегии исследования могут быть способны заменить глазной тест Дрейза (Draize). Возможная концептуальная схема для такой (многоуровневой) стратегии исследования была разработана для химических веществ в рамках рабочей группы EURL ECVAM (см. [23]). Схема основана на альтернативных методах глазного раздражения, которые различаются их способностью определять серьезные раздражающие вещества (ЕС R41; GHS "Категория 1"), либо вещества, считающиеся нераздражающими (ЕС "неклассифицируемые" GHS. Нет категории). Согласно этой схеме весь диапазон раздражимости может быть решен путем распределения исследований в многоуровневой стратегии, которая может применяться с любого конца: для определения первых серьезных раздражителей и решения отсутствия раздражимости (подход сверху вниз) или для процедуры в обратном порядке, начиная с определения нераздражителей (подход снизу вверх). Легкая степень раздражения допустима на последнем уровне при применении обоих подходов.

Уже существует несколько руководств OECD по исследованиям, основывающимся на методах in vitro, связанных с конечной точкой "глазное раздражение": OECD 437:2020, OECD 438:2017, OECD 460:2017, OECD 491:2020 и OECD 492:2017. Эти руководства для определения раздражающей активности химических веществ основываются на валидированных (Межведомственным координационным комитетом по валидации альтернативных методов - ICCVAM, EURL ECVAM, Японским центром по валидации альтернативных методов - JaCVAM или другими) исследованиях in vitro. В этих руководствах описаны следующие методы: метод исследования помутнения и проницаемости роговицы крупного рогатого скота (см. OECD 437), метод исследования на изолированном глазе цыпленка (см. OECD 438), метод исследования проницаемости флуоресцеина с использованием клеток, растущих на полупроницаемой мембране (см. OECD 460), и метод исследования краткосрочного воздействия in vitro (см. OECD 491), состоящий из основанной на цитотоксичности пробы in vitro, которая проводится на конфлюэнтном монослое клеток роговицы кролика (SIRC), и исследования с применением реконструированного человеческого роговицеподобного эпителия, так называемого, исследования реконструированного человеческого роговицеподобного эпителия (RHCE) (см. OECD 492). Ни одно из данных исследований OECD не было валидировано для МИ.

D.2.3 Принцип

Проводят оценку способности исследуемого материала вызывать глазное раздражение.

D.2.4 Исключения из исследования

Материалы, либо готовые изделия, или и те, и другие, продемонстрировавшие определенную коррозию или серьезное раздражение при кожном исследовании, не должны исследоваться на предмет глазного раздражения. Любой материал, доказанный как кожный раздражитель или с pH  2,0 или  11,5 не должен исследоваться, а должен быть обозначен как потенциальный глазной раздражитель.

В исключительных случаях, когда требуется дальнейшая характеризация/оценка риска, может возникнуть необходимость исследовать материалы, являющиеся минимально раздражающими. Такие случаи должны быть обоснованы и отражены документально.

D.2.5 Исследуемые образцы

Если образец является жидкостью, то вводят 100 мкл без разбавления в нижний конъюнктивальный мешок одного глаза.

Если образец является твердым или гранулированным продуктом, то его измельчают в мелкий порошок. После осторожного утрамбовывания вводят количество, занимающее объем в 100 мкл и массой не более чем 100 мг, в нижний конъюнктивальный мешок одного глаза.

Примечание - Некоторые изделия не подходят для исследования непосредственно на глазе. Механические повреждения могут привести к бесполезности исследования.

Если исследуемый образец содержится в пульверизаторе, то выпускают и вводят 100 мкл как для жидкостей.

Если исследуемый образец содержится в аэрозольном контейнере, то исследуют

- либо однократным распылением длительностью 1 с на расстоянии 10 см, направленным в открытый глаз или

- перемещением аэрозоля в прохладный контейнер и обращением с ним, как с жидкостью.

Если исследуемый образец таков, что может быть нанесен только как экстракт, то экстракты подготавливают в соответствии с приложением A. Вводят 100 мкл аликвот экстракта в нижний конъюнктивальный мешок одного глаза.

При условиях, идентичных примененным выше, подготавливают бланковую жидкость, используя как полярный, так и неполярный растворитель, без исследуемого образца.

D.2.6 Животные и условия их содержания

Следует использовать здоровых молодых взрослых кроликов альбиносов любого пола одной линии массой не менее 2 кг. Так как не ожидается, что глазное раздражение будет отличаться у самцов и самок, можно использовать один пол. При выборе самок они должны быть нерожавшими и небеременными.

Животные должны быть акклиматизированы и содержаться согласно ISO 10993-2.

Изначально для оценки исследуемого образца необходимо использовать одно животное. Отчетливо определяемый положительный ответ (см. таблицу D.1) исключает необходимость дополнительного исследования. Для материалов, которые, как ожидается, не вызовут выраженного глазного раздражения (например, растворов для контактных линз, хорошо охарактеризованных, не цитотоксичных материалов или других, с научно подтвержденным отсутствием раздражающих свойств), изначально можно проводить исследования на трех кроликах без предварительного скрининга на одном кролике.

Если реакции на твердые или жидкие образцы не наблюдаются (см. таблицу D.1), то следует использовать как минимум еще двух животных. Для экстрактов следует использовать как минимум еще двух животных на один экстракт.

Если ответная реакция с использованием минимум трех животных неоднозначная или неясная, то следует рассмотреть возможность дополнительного исследования.

D.2.7 Процедура исследования

Не ранее, чем за 24 ч до начала исследования визуально осматривают оба глаза каждого кролика на предмет глазных аномалий. Если у любого глаза есть признаки аномалий, то кролика необходимо заменить.

После осмотра глаз можно использовать флюоресцин натрия 2 % Британской Фармакопеи (BP) (см. [38]) или эквивалент для визуализации какого-либо повреждения роговицы. Рекомендуется использовать офтальмоскоп, ручную щелевую лампу или другое подходящее устройство.

Вводят исследуемый образец, как обозначено в D.2.5, в один глаз.

После введения веки держат вместе примерно 1 с.

Контралатеральный глаз каждого животного служит контролем и должен обрабатываться бланковой жидкостью или, при исследовании экстракта, бланковым контролем. В качестве бланка можно использовать воду или физраствор, если исследуемые образцы находятся в неразбавленном виде.

Если ожидается повторное воздействие материала, а исследуемый материал не показал значительного ответа на острое исследование, то может быть проведено исследование повторного воздействия. Повторное воздействие должно проводиться только после завершения исследования острого воздействия спустя как минимум (72  2) ч. Продолжительность воздействия должна соответствовать продолжительности использования исследуемого образца/устройства в клинической практике.

D.2.8 Наблюдение за животными

У животных, получающих однократное введение исследуемого материала, осматривают оба глаза каждого животного примерно через (1  0,1), (24  2), (48  2) и (72  2) ч после введения.

При наличии устойчивых изъязвлений, для определения прогресса или обратимости изъязвлений, может потребоваться продленное наблюдение, которое не должно превышать 21 д. Продленное наблюдение для животных с тяжелыми изъязвлениями не оправданно.

Примечание - ISO 9394 приводит руководство для исследования контактных линз, которое требует воздействие по 8 ч в день в течение 21 дня. Это исключение из правил [1].

Оценивают и отражают документально любые наблюдаемые реакции в соответствии с оценочной шкалой глазных изъязвлений, приведенной в таблице D.1.

Таблица D.1 - Система оценки повреждений глаз

Реакция	Балл
a) Роговица
1) Степень помутнения (по самой плотной зоне)
Без помутнения	0
Отдельные или рассыпанные участки, радужная оболочка детально видна	1 a
Легко определяемые прозрачные участки, детали радужной оболочки частично неразличимы	2 a
Опалесцирующие участки, детали радужной оболочки неразличимы, размер зрачка едва различим	3 a
Непрозрачная, детали радужной оболочки неразличимы	4 a
2) Пораженная область роговицы
Одна четверть (или меньше), не отсутствует	0
Больше, чем одна четверть, но меньше, чем половина	1
Больше, чем половина, но меньше, чем три четверти	2
Больше, чем три четверти, вплоть до всей площади	3
b) Радужная оболочка
1) Нормальная	0
Складки выше нормы, гиперемия, перикорнеальная инъекция (все вместе, по отдельности или сочетание), радужная оболочка все еще реагирует на свет (вялая положительная реакция)	1 a
Отсутствие реакции на свет, геморрагия, серьезные повреждения (любое из них или все вместе)	2 a
c) Конъюнктива
1) Покраснение (относится к пальпебральной и бульбарной конъюнктивам, исключая роговицу и радужную оболочку)
Сосуды нормальные	0
Сосуды инъеционированы выше нормы	1
Более диффузное, насыщенно малиново-красная, отдельные сосуды трудно различимы	2 a
Диффузное, выраженное красное	3 a
2) Хемоз
Без опухания	0
Любое опухание выше нормы (включая мигательную перепонку)	1
Явное опухание с частичным выворотом век	2 a
Опухание с полузакрытыми веками	3 a
Опухание от полузакрытых до полностью закрытых век	4 a
3) Выделения
Без выделений	0
Любое количество, отличающееся от нормального (не включает незначительные количества, наблюдаемые во внутреннем углу глаза у здоровых животных)	1
Выделения с увлажнением век и волосков, непосредственно прилегающих к векам	2
Выделения с увлажнением век и волосков, а также значительной зоны вокруг глаз	3
a Положительный результат.

У животных, получающих многократные введения исследуемого материала, осматривают оба глаза каждого животного непосредственно до и через (1  0,1) ч после каждого введения.

Если есть признаки раздражения после последнего введения, то наблюдение может быть продлено. При стойком поражении роговицы или другом раздражении глаз может потребоваться длительное наблюдение, чтобы определить развитие поражений и их обратимость.

Оценивают и отражают документально любые наблюдаемые реакции в соответствии с таблицей D.1.

Немедленно выводят животное из исследования и подвергают эвтаназии, если у него наблюдаются:

- очень тяжелое глазное повреждение (например, отслаивание и изъязвление конъюнктивальной мембраны, перфорация роговицы, кровь или гной в передней камере);

- кровяные или гнойные выделения;

- значительное изъязвление роговицы.

Выводят из исследования любое животное с максимальной ответной реакцией по шкале, приведенной в таблице D.1, т.е.:

- отсутствие светового рефлекса (ответ радужной оболочки 2 степени) или непрозрачность роговицы (4 степень) без признаков восстановления в течение (24  2) ч или

- максимальное воспаление конъюнктивы (хемоз 4 степени вместе с покраснением 3 степени) без признаков восстановления в течение (48  2) ч

и подвергают эвтаназии.

D.2.9 Оценка результатов

D.2.9.1 Общие положения

Различия между исследуемым и контрольным глазами должны быть охарактеризованы и описаны с точки зрения системы оценки, приведенной в таблице D.1.

D.2.9.2 Острое воздействие

Если обработанный глаз демонстрирует положительную реакцию у более чем одного животного (см. таблицу D.1) при каком-либо из наблюдений, то материал считается глазным раздражителем и дальнейшее исследование не требуется.

Если только один из трех обработанных глаз демонстрирует легкую или умеренную реакцию или если реакция неоднозначна, то используют дополнительных животных.

После обработки дополнительных животных исследуемый материал признается глазным раздражителем, если более чем половина обработанных глаз в исследуемой группе показывает положительный результат (см. таблицу D.1) на любой стадии наблюдения.

Резко выраженная реакция только у одного животного считается достаточной для признания материала глазным раздражителем.

D.2.9.3 Повторное воздействие

Исследуемый материал считается глазным раздражителем, если более половины животных в исследуемой группе показали положительный результат (см. таблицу D.1) при любой стадии наблюдения.

D.2.10 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать следующую информацию:

- примененный международный стандарт (включая дату публикации);

- описание исследуемых образцов;

- предполагаемое использование/применение исследуемых образцов;

- подробное описание метода, использованного при приготовлении исследуемых образцов;

- описание подопытных животных;

- метод введения;

- как проводилась оценка ответной реакции;

- запись наблюдений;

- оценку результатов;

- любые отклонения от процедуры;

- любые наблюдаемые особенности;

- дату исследования.

D.3 Исследование раздражения на слизистой ротовой полости

D.3.1 Общие положения

Исследование раздражения полости рта должно рассматриваться только для материалов с предназначенным контактом с тканями полости рта, если данные по безопасности не могут быть получены другими способами. Так же, как и модели in vitro реконструированного эпидермиса человека, теперь существуют и модели слизистой in vitro. Это включает применение восстановленных структур слизистой человека (см. [10]). Тем не менее они еще не были утверждены для использования в исследовании МИ.

D.3.2 Принцип

Проводят оценку потенциала исследуемого материала вызывать раздражение ткани полости рта.

D.3.3 Исключение из исследования

Любой материал, являющийся кожным или глазным раздражителем, или любой материал с pH  2,0 или  11,5 не должен исследоваться и должен считаться потенциальным раздражителем ткани полости рта.

В исключительных случаях, когда требуется дальнейшая оценка/характеристика риска, может стать необходимым испытать материалы, которые либо являются раздражителем, либо имеют pH вне диапазона, обозначенного выше. Такие случаи должны быть обоснованы и отражены документально.

D.3.4 Исследуемый образец

Подготавливают исследуемые образцы в соответствии с приложением A.

D.3.5 Животные и условия содержания

Следует использовать здоровых молодых и взрослых сирийских хомяков любого пола из одной неродственной линии. Животные должны быть акклиматизированы и содержаться согласно ISO 10993-2.

В дополнение к вышесказанному, по необходимости, надевают подходящий ошейник шириной от 3 мм до 4 мм на шею каждого животного, чтобы он не мешал нормальному питанию и дыханию, но предотвращал удаление ватного шарика животным. Взвешивают каждое животное ежедневно в течение 7 дней во время периода исследования. Осматривают каждое животное с потерей массы тела и корректируют его ошейник по необходимости. Если животное продолжает терять массу тела, то его исключают из исследования.

Первоначально для оценки исследуемых образцов следует использовать как минимум трех животных.

Примечание - Может быть применимо использование дополнительных животных, обработанных отрицательным контролем или контролем экстрагента.

Если ответ в первоначальном исследовании неоднозначен или неясен, то следует рассмотреть возможность проведения дополнительного исследования.

D.3.6 Процедура исследования

У каждого животного выворачивают защечные мешки. Промывают мешки физиологическим раствором и осматривают на предмет любых аномалий.

Для твердых исследуемых материалов помещают образец (диаметром не больше, чем 5 мм) напрямую в защечный мешок.

Для жидких исследуемых материалов или образцов экстракта мочат ватный шарик образцом, записывают впитанный объем и помещают шарик в один мешок каждого животного. В качестве альтернативы необходимый объем образца может быть залит в защечный мешок.

В другой защечный мешок, который будет служить контролем процедуры, образец не помещают. По необходимости, животные отрицательного контроля могут исследоваться параллельно, также получая контроль процедуры.

Когда требуется, снова надевают ошейник и возвращают животное в клетку.

Длительность воздействия должна соответствовать ожидаемой при использовании материала, но не менее 5 мин.

После воздействия удаляют ошейник и ватный шарик, промакивают мешок физраствором, стараясь не затронуть другой мешок.

При остром воздействии повторяют вышеописанную процедуру каждый час ( 0,1 ч) в течение 4 ч. Другие схемы обработки (например, основанные на клиническом применении) должны быть обоснованы и отражены документально.

При проведении исследований с повторным воздействием количество нанесений, их длительность и интервал между ними основываются на времени воздействия, ожидаемом в клинической практике.

D.3.7 Наблюдение за животными

Осматривают мешки макроскопически после удаления шариков. Перед повторным воздействием следует осмотреть макроскопически мешки.

Описывают внешний вид защечных мешков у каждого животного и оценивают реакции поверхности мешка на предмет эритемы по системе, приведенной в таблице D.2 для каждого животного в каждый временной интервал. Записывают результаты для отчета об исследовании.

Через (24  2) ч после последней обработки осматривают защечные мешки макроскопически, проводят эвтаназию и отбор образцов тканей из репрезентативных областей мешков. Помещают образцы тканей в соответствующий фиксатор для гистологического изучения.

Таблица D.2 - Макроскопическая система оценки реакций слизистой оболочки

Реакция	Балл
Эритема и формирование струпа
Отсутствие эритемы	0
Очень незначительная эритема (едва заметная)	1
Четко выраженная эритема	2
Умеренная эритема	3
Резкая эритема (свекольно-красная) с образованием струпа, мешающего оценке эритемы	4
Другие негативные изменения тканей должны быть отражены документально и включены в отчет.

D.3.8 Оценка результатов

D.3.8.1 Макроскопическая оценка

Сравнивают обработанный защечный мешок с контралатеральным защечным мешком с мешками животных в контрольной группе.

Баллы (см. таблицу D.2) суммируют для каждого наблюдения и сумму делят на количество наблюдений для определения среднего балла на животное.

Примечания:

1 Эти наблюдения могут помочь при гистологической оценке.

2 Наблюдения, сделанные до первого нанесения исследуемого образца, не включаются в средний балл.

D.3.8.2 Гистологическая оценка

Раздражающие эффекты на ткань ротовой полости должны быть оценены патологоанатом (морфологом) при помощи микроскопа. Оценивают каждую ткань по системе, приведенной в таблице D.3.

Баллы для микроскопической оценки всех животных в исследуемой группе суммируют и сумму делят на количество наблюдений для получения среднего балла исследуемой группы. Повторяют для контрольной группы или групп. 16 является максимальным баллом.

Для микроскопической оценки в контрольном защечном мешке общий балл, превышающий девять, может указывать на скрытую патологию, а у контрольного животного - травму при воздействии. Обе ситуации могут потребовать повторного исследования, если другие исследуемые или контрольные животные демонстрируют эквивалентно высокие баллы.

Чтобы получить индекс раздражения, вычитают средний балл контрольной группы из среднего балла опытной группы (см. таблицу D.4).

Для исследований повторного воздействия может потребоваться модификация таблицы D.3 для дополнительных тканевых ответов, связанных с хроническим раздражением.

D.3.9 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать следующую информацию:

- описание исследуемых образцов;

- предполагаемое использование/применение исследуемых образцов;

- подробное описание метода, использованного при приготовлении исследуемых образцов;

- описание подопытных животных;

- метод нанесения;

- как проводилась оценка ответной реакции;

- запись наблюдений;

- гистологическую оценку;

- оценку результатов;

- примененный международный стандарт (включая дату публикации);

- любые отклонения от процедуры;

- любые наблюдаемые особенности;

- дату исследования.

Таблица D.3 - Система микроскопической оценки реакции тканей слизистой

Реакция	Количественная оценка
Эпителий
Нормальный, неповрежденный	0
Дегенерация, сплющивание клеток	1
Метаплазия	2
Фокальная эрозия	3
Общая эрозия	4
Инфильтрация лейкоцитами (при высоком разрешении)
Отсутствует	0
Минимальная (меньше 25)	1
Легкая (26-50)	2
Умеренная (51-100)	3
Ярко выраженная (больше 100)	4
Застой в сосудах
Отсутствует	0
Минимальный	1
Легкий	2
Умеренный	3
Ярко выраженный, с повреждением сосудов	4
Отек (эдема)
Отсутствует	0
Минимальный	1
Легкий	2
Умеренный	3
Ярко выраженный	4

Таблица D.4 - Индекс раздражения

Средний балл	Характеристика ответной реакции
0	Отсутствует
1-4	Минимальный
5-8	Легкий
9-11	Умеренный
12-16	Резкий
Другие отрицательные изменения тканей должны быть отражены документально и включены в оценку ответа. Микроскопическая оценка, приведенная в таблице D.3, применима ко всем перечисленным исследованиям. "Индекс раздражения" разработан для применения с моделью вагинального раздражения, но может применяться для других исследований.

D.4 Исследование раздражения на пенис

D.4.1 Общие положения

Исследование пенильного раздражения должно рассматриваться только для материалов, предназначенных для контакта с пенильной тканью и, если данные по безопасности не могут быть получены другими способами.

D.4.2 Принцип

Проводят оценку способности исследуемого материала вызывать раздражение пенильной ткани.

D.4.3 Исключение из исследования

Любой материал, являющийся кожным или глазным раздражителем, или материалы с pH  2,0 или  11,5 не должны исследоваться и должны считаться пенильными раздражителями.

D.4.4 Исследуемый образец

Если исследуемый образец твердый или жидкий, то его следует подготовить в соответствии с приложением A.

D.4.5 Животные и условия их содержания

Следует использовать самцов кролика-альбиноса или морской свинки. Они должны быть здоровыми молодыми взрослыми особями с массой не меньше 2 кг для кроликов и от 300 г до 500 г для морских свинок.

Животные должны быть акклиматизированы и содержаться согласно ISO 10993-2.

Доступная длина пениса должна быть по меньшей мере 1 см.

Из-за индивидуальных различий в пигментации животные должны наблюдаться и оцениваться на предмет эритемы до первого нанесения. Для оценки эритемы следует использовать систему, приведенную в таблице D.2. Животные с серьезным изменением пигментации или с эритемой в 2 и выше балла не должны использоваться.

Изначально следует использовать по меньшей мере трех животных для оценки исследуемого материала и трех животных в качестве контрольной группы.

Если ответ в первоначальном исследовании неоднозначен или неясен, то необходимо рассмотреть дополнительное исследование.

D.4.6 Процедура исследования

Помещают животное в супинальную позицию с конечностями, зафиксированными ассистентом.

Указательным и средним пальцем осторожно надавливают на зону гениталий для высвобождения пениса.

Когда пенис виден, наносят достаточное количество (примерно 200 мкл) исследуемого образца, чтобы убедиться, что пенис полностью им покрыт.

Позволяют пенису вернуться в оболочку. Необходимо предотвратить облизывание места нанесения и внесение мешающих факторов, затрудняющих оценку первичного раздражения (например, применить елизаветинский воротник).

В качестве альтернативы животное может быть закреплено в ограничителе соответствующей конструкции в течение (1  0,1) ч после последнего нанесения.

При остром воздействии повторяют вышеописанную процедуру каждый час ( 0,1) ч в течение 4 ч. Другие схемы обработки (например, основанные на клиническом применении) должны быть обоснованы и отражены документально.

При проведении длительных исследований с повторным воздействием количество нанесений, их длительность и интервал между ними основываются на времени воздействия, ожидаемом в клинической практике.

D.4.7 Наблюдение за животными

Для острого воздействия отмечают внешний вид пениса через (1  0,1) ч после первоначального нанесения (например, сразу перед следующим нанесением) и последующих обработок. Отмечают и отражают документально внешний вид пениса через (1  0,1), (24  2) и (48  2) ч после последнего нанесения.

При проведении длительных исследований с повторным воздействием отмечают внешний вид пениса через (1  0,1) ч после первоначального воздействия и сразу перед следующим нанесением.

Оценивают реакции поверхности кожи на предмет эритемы согласно системе, приведенной в таблице D.2, для каждого животного в каждый временной интервал и записывают результаты для отчета об исследовании.

Если у какого-либо животного имеется покраснение до первоначального воздействия, то балл, присвоенный до первоначального воздействия, вычитается из баллов оценки эритемы при наблюдениях в разные сроки, чтобы определить степень эритемы, обусловленную исследуемой пробой. Наивысшим возможным баллом для каждого наблюдения является 4.

D.4.8 Оценка результатов

D.4.8.1 Макроскопическая оценка

Сравнивают обработанный пенис и его оболочку с пенисом контрольных животных.

Для определения среднего балла на животное баллы (см. таблицу D.2) за каждое наблюдение суммируют и делят на количество наблюдений для определения среднего балла на животное.

Примечания:

1 Эти наблюдения могут помочь при гистологической оценке.

2 Первоначальные наблюдения, сделанные до первого нанесения исследуемого материала, не включают в средний балл.

Сразу после 48 ч наблюдения проводят эвтаназию. Отделяют дистальный отдел пениса и оболочку и помещают в соответствующий фиксатор для гистологического изучения.

D.4.8.2 Гистологическая оценка

Раздражающие эффекты на коже пениса должны оцениваться патологоанатом (морфологом). Оценивают каждую ткань по системе, приведенной в таблице D.3.

Баллы для микроскопической оценки всех животных в исследуемой группе складывают и сумму делят на количество наблюдений для получения среднего балла исследуемой группы. 16 является максимальным баллом.

Повторяют процедуру оценки для контрольной группы (групп).

Для микроскопической оценки общий балл, превышающий девять, у контрольного животного может указывать на травму при воздействии. Может потребоваться повторное исследование, если другие опытные или контрольные животные демонстрируют такие же высокие баллы.

Для получения индекса раздражения вычитают средний балл контрольной группы из среднего балла опытной группы (см. таблицу D.4).

Для длительных исследований с повторным воздействием может потребоваться модификация таблицы D.3 для включения дополнительных тканевых реакций, обусловленных хроническим раздражением.

D.4.9 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать следующую информацию:

- примененный международный стандарт (включая год публикации);

- описание исследуемого образца;

- предполагаемое использование/применение исследуемых образцов;

- подробное описание метода, использованного при приготовлении исследуемых образцов;

- описание подопытных животных;

- метод нанесения;

- как проводилась оценка ответной реакции;

- запись наблюдений;

- гистологическую оценку;

- оценку результатов;

- любые отклонения от процедуры;

- любые наблюдаемые особенности;

- дату исследования.

D.5 Исследование ректального раздражения

D.5.1 Общие положения

Исследование ректального раздражения должно рассматриваться для материалов, предназначенных для контакта с ректальной тканью, если данные по безопасности не могут быть получены другими способами.

D.5.2 Принцип

Проводят оценку способности материала вызывать раздражение ректальной ткани.

D.5.3 Исключение из исследования

Любой материал, являющийся кожным или глазным раздражителем, или материалы с pH  2,0 или  11,5 не должны исследоваться и считаться ректальными раздражителями.

D.5.4 Исследуемый образец

Если исследуемый образец твердый или жидкий, то его следует подготовить в соответствии с приложением A.

D.5.5 Животные и условия их содержания

Следует использовать молодых взрослых кроликов-альбиносов одной линии любого пола массой не меньше 2 кг. При использовании других особей выбор необходимо обосновать.

Животные должны быть акклиматизированы и содержаться согласно ISO 10993-2.

Первоначально следует использовать, по меньшей мере, трех животных для оценки исследуемых образцов, а также трех животных используют в качестве контрольной группы.

Если ответ первоначального исследования неоднозначен или неясен, то необходимо рассмотреть дополнительное исследование.

Животные должны быть осмотрены на предмет ректальных выделений, опухания или других признаков инфекции нижних отделов кишечника или и того, и другого, наличия раздражения или травмы перед каждой обработкой либо всех сразу.

D.5.6 Процедура исследования

Прикрепляют короткий (6 см) мягкий катетер или тупоконечную канюлю к шприцу, объемом более 1 мл. Наполняют шприц и катетер для введения 1 мл исследуемой пробы. Подготавливают отдельный шприц с прикрепленным катетером для каждого животного.

Закрепляют животное, поместив его в фиксирующее устройство, оставляющее доступ к промежности, либо ассистент должен осторожно удерживать животное, закрепив его задние лапы таким образом, чтобы обеспечить доступ к промежности.

Непосредственно перед введением смачивают катетер контрольной пробой образца или подходящей смазкой.

Поднимают хвост животного для доступа к промежности. Осторожно вводят смоченный катетер глубоко в прямую кишку и вводят всю дозу в 1 мл из шприца. Выводят катетер и утилизируют его надлежащим образом.

Из-за разницы во вместительности прямой кишки отдельных животных некоторое количество исследуемой пробы может вытекать во время процедуры или сразу после введения. Вытекший материал осторожно удаляют мягкой тканью.

Повторяют вышеописанную процедуру в течение пяти дней подряд с интервалами (24  2) ч. Другие режимы обработки (например, основанные на клиническом применении) должны быть обоснованы и отражены документально.

При проведении длительных исследований с повторным воздействием количество нанесений, их длительность и интервал между ними определяют с учетом клинического применения МИ.

D.5.7 Наблюдение за животными

Через (24  2) ч после первоначального нанесения и сразу перед каждой обработкой отмечают и регистрируют внешний вид промежности на предмет признаков выделений, эритемы и раздражения.

Животные, у которых наблюдаются излишние выделения, отечность или сложности с введением или все перечисленное, должны быть подвержены процедуре эвтаназии, а образцы их ткани исследованы (см. D.5.8.1 и D.5.8.2).

D.5.8 Оценка результатов

D.5.8.1 Макроскопическая оценка

Через (24  2) ч после последнего введения проводят процедуру эвтаназии. Отделяют весь нижний отдел кишечника, вскрывают в продольном направлении и осматривают на предмет признаков раздражения, травмы эпителиального слоя ткани и некроза.

Помещают прямую кишку и дистальную часть толстой кишки в подходящий фиксатор для гистологического изучения.

Сравнивают ректальные ткани опытных кроликов с ректальными тканями контрольных кроликов.

Записывают и описывают макроскопически внешний вид ректальной ткани для каждого животного, отмечая различия между опытными и контрольными участками.

Примечание - Эти наблюдения могут помочь при гистологической оценке.

D.5.8.2 Гистологическая оценка

Раздражающие эффекты на ректальную ткань должны быть оценены патологоанатом (морфологом). Оценивают каждую ткань по системе, приведенной в таблице D.3.

Суммируют баллы микроскопической оценки для всех животных в опытной группе и делят сумму на количество наблюдений для получения среднего балла опытной группы. Максимальным баллом является 16.

Повторяют процедуру оценки для контрольной группы (групп).

Для микроскопической оценки общий балл, превышающий девять, у контрольного животного может указывать на травму при введении. Может потребоваться повторное исследование, если другие опытные или контрольные животные демонстрируют такие же высокие баллы.

Для получения индекса раздражения вычитают средний балл контрольной группы из среднего балла опытной группы (см. таблицу D.4).

Для длительных исследований с повторным воздействием может потребоваться модификация таблицы D.3 для включения дополнительных тканевых реакций, обусловленных хроническим раздражением.

D.5.9 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать следующую информацию:

- примененный международный стандарт (включая год публикации);

- описание исследуемых образцов;

- предполагаемое использование/применение исследуемых образцов;

- подробное описание метода, использованного при приготовлении исследуемых образцов;

- описание подопытных животных;

- метод нанесения;

- как проводилась оценка ответной реакции;

- запись наблюдений;

- гистологическую оценку;

- оценку результатов;

- любые отклонения от процедуры;

- любые наблюдаемые особенности;

- дату исследования.

D.6 Исследование вагинального раздражения

D.6.1 Общие положения

Исследование вагинального раздражения должно рассматриваться только для материалов, предназначенных для контакта с вагинальной тканью, и если данные по безопасности не могут быть получены другими способами.

D.6.2 Принцип

Проводят оценку способности исследуемого материала вызывать раздражение вагинальной ткани.

D.6.3 Исключение из исследования

Любой материал, являющийся кожным или глазным раздражителем или материалы с pH  2,0 или  11,5 не должны исследоваться и должны считаться потенциальными вагинальными раздражителями.

D.6.4 Исследуемый образец

Если исследуемый образец твердый или жидкий, то его следует подготовить, как указано в приложении A.

D.6.5 Животные и условия их содержания

Следует использовать самок молодых взрослых кроликов-альбиносов одной линии массой не меньше 2 кг. При использовании других особей выбор необходимо обосновать. Животные должны быть возраста, при котором репродуктивный тракт достаточно развит для введения исследуемых образцов. Животные должны быть нерожавшими и небеременными.

Животные должны быть акклиматизированы и содержаться согласно ISO 10993-2.

По меньшей мере трех животных следует первоначально использовать для оценки испытуемых образцов, а трех животных используют как контрольную группу.

Если ответ в первоначальном исследовании неоднозначен или неясен, то необходимо рассмотреть дополнительное исследование.

Животные должны быть осмотрены на предмет вагинальных выделений, опуханий либо других признаков вагинальной инфекции или и того, и другого, раздражения или травмы перед каждой обработкой или всего вышеперечисленного. Необходимо проводить осмотр в стадии астрального цикла, чтобы убедиться, что не дается ложноположительная реакция на основании физиологических изменений в вагине.

D.6.6 Процедура исследования

Прикрепляют короткий (6 см) мягкий катетер или тупоконечную канюлю к шприцу, объемом более 1 мл. Наполняют шприц и катетер для введения 1 мл исследуемой пробы. Подготавливают отдельный шприц с прикрепленным катетером для каждого животного.

Закрепляют животное, помещают его в фиксирующее устройство, оставляющее доступ к половым органам, либо ассистент должен осторожно удерживать животное, закрепив его задние лапы таким образом, чтобы обеспечить доступ к влагалищу.

Непосредственно перед введением смачивают катетер контрольной пробой образца или подходящей смазкой.

Поднимают хвост животного для доступа к отверстию влагалища. Осторожно вводят смоченный катетер глубоко в вагину и вводят 1 мл из шприца. Выводят катетер и утилизируют его надлежащим образом.

Из-за разницы во вместительности влагалища отдельных животных некоторое количество исследуемой пробы может вытекать во время процедуры или сразу после введения. Вытекший материал осторожно удаляют мягкой тканью.

Повторяют вышеописанную процедуру с интервалами в (24  2) ч каждый день в течение пяти дней подряд. Другие графики обработки (например, основанные на клиническом применении) должны быть обоснованы и отражены документально.

При проведении длительных исследований с повторным воздействием количество нанесений, их длительность и интервал между ними определяют с учетом клинического применения МИ.

D.6.7 Наблюдение за животными

Через (24  2) ч после первоначального нанесения и сразу перед каждой обработкой отмечают и регистрируют внешний вид отверстия влагалища и промежности на предмет выделений, эритемы и отека (эдемы).

Животные, у которых наблюдаются излишние выделения, эритема и/или отек (эдема) или сложности с введением или все перечисленное, должны быть подвержены процедуре эвтаназии, а образцы их ткани исследованы (см. D.6.8.1 и D.6.8.2).

D.6.8 Оценка результатов

D.6.8.1 Макроскопическая оценка

Через (24  2) ч после последнего введения проводят процедуру эвтаназии. Отделяют всю вагину, вскрывают в продольном направлении и осматривают на предмет признаков раздражения, травмы эпителиального слоя ткани и некроза.

Помещают вагину в подходящий фиксатор для гистологического изучения. Следует забрать образцы ткани из трех отделов вагины, цервикального, центрального и хвостового.

Сравнивают вагины животных, подвергнутых воздействию исследуемой пробы, с вагинами контрольных животных.

Записывают и описывают макроскопически внешний вид ткани влагалища каждого животного, отмечая различия между опытными и контрольными группами.

Примечание - Эти наблюдения могут помочь при гистологической оценке.

D.6.8.2 Гистологическая оценка

Раздражающие эффекты должны быть оценены патологоанатом (морфологом). Оценивают каждую ткань по системе, приведенной в таблице D.3.

Суммируют баллы микроскопической оценки для всех животных в опытной группе и делят сумму на количество наблюдений для получения среднего балла опытной группы. Максимальным баллом является 16.

Повторяют процедуру оценки для контрольной группы (групп).

Для микроскопической оценки общий балл, превышающий девять, у контрольного животного может указывать на травму при введении. Может потребоваться повторное исследование, если другие опытные или контрольные животные демонстрируют эквивалентно высокие баллы.

Для получения индекса раздражения вычитают средний балл контрольной группы из среднего балла опытной группы (см. таблицу D.4).

Для длительных исследований с повторным воздействием может потребоваться модификация таблицы D.3 для включения дополнительных тканевых реакций, обусловленных хроническим раздражением.

D.6.9 Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать следующую информацию:

- примененный международный стандарт (включая год публикации);

- описание исследуемых образцов;

- предполагаемое использование/применение исследуемых образцов;

- подробное описание метода, использованного при приготовлении исследуемых образцов;

- описание подопытных животных;

- метод нанесения;

- как проводилась оценка ответной реакции;

- запись наблюдений;

- гистологическую оценку;

- оценку результатов;

- любые отклонения от процедуры;

- любые наблюдаемые особенности;

- дату исследования.