Приложение B (справочное). Этапы (процедура) исследования раздражения in vitro с использованием моделей реконструированного эпидермиса человека

Приложение B
(справочное)

Этапы (процедура) исследования раздражения in vitro с использованием моделей реконструированного эпидермиса человека

- Подготавливают исследуемую и контрольную пробы в качестве экстрактов в полярном (солевом) и неполярном (кунжутное масло) экстрагенте до получения ткани, как правило, за (48-72) ч до получения тканей RHE в зависимости от необходимых предварительных инкубаций тканей RHE. Время экстракции и температура должны быть обоснованы в соответствии с ISO 10993-12.

Примечание - В обширном анализе по циклической системе для оценки RHE для оценки раздражения экстрактов МИ применялись полимеры с добавками (PVC и силикон), а экстракция проводилась при температуре (37  1) °C в течение (72  2) ч при непрерывном взбалтывании/встряхивании.

- Получение: переносят эпидермис со среды транспортных планшетов на поддерживающую среду.

- Инкубируют в течение от 2 до 24 ч при температуре (37  1) °C и (5  1) % CO ₂ во влажной атмосфере инкубатора согласно инструкциям изготовителя.

- Если в испытание не включены экстракты материалов положительного контроля, то в день эксперимента добавляют положительный контроль (SDS) в полярный (солевой) экстрагент в установленных концентрациях. Можно применять более низкие концентрации (например, от 0,25 % до 0,5 %) в качестве положительного контроля после подтверждения приемлемости и положительных результатов (см. [17], [19]).

- Используют отрицательный контроль, положительный контроль, контроли экстрагентов и исследуемых проб (экстрактов из исследуемых образцов) при объеме 100 мкл на поверхности ткани.

- Инкубируют при температуре (37  1) °C, (5  1) % CO ₂ во влажной атмосфере инкубатора за ночь (например, от 18 до 24 ч, в зависимости от изготовителя).

- Прерывают обработку промыванием DPBS или PBS.

Примечание - Перед оценкой жизнеспособности RHE культуральная среда ниже вкладки может быть собрана для дополнительного определения цитокинов.

- Подготавливают раствор МТТ и инкубационные планшеты МТТ.

- Переносят ткани в раствор МТТ.

- Инкубируют ткани в течение 3 ч  5 мин в МТТ при температуре (37  1) °C, (5  1) % CO ₂, во влажной атмосфере инкубатора.

- Переносят и погружают в среду для экстракции формазаном (изопропанолом).

- Экстракция формазаном: не меньше 2 ч при комнатной температуре или на ночь, герметично закрытая, при комнатной температуре.

- Встряхивают и гомогенизируют.

- Переносят образовавшийся раствор в 96-луночный планшет.

- Измеряют OD, используя планшетный спектрофотометр.

Порядок действий, приведенный выше, содержится в таблице B.1.

Таблица B.1 - Процедура исследования на раздражение с применением реконструированного эпидермиса человека

Время	Порядок действий
От минус 48 ч до 72 ч	Подготавливают полярный и неполярный экстракты (37  1) °C
	Получение тканей
	Преинкубируют ткани согласно инструкциям изготовителя (например, от 2 ч до 24 ч)
Начало исследования T = 0 ч	Применяют NC, PCs, VCs и исследуемые образцы в объеме 100 мкл на поверхности ткани
Инкубация T = 18 ч или T = 24 ч	Инкубируют при температуре (37  1) °C и (5  1) % CO 2 во влажной атмосфере инкубатора в течении ночи (например, 18-24 ч, в зависимости от изготовителя)
Конец инкубации Следующий день	Прерывают обработку промыванием DPBS или PBS
Измерение жизнеспособности	Подготавливают раствор МТТ
	Переносят ткань в раствор МТТ
Инкубация МТТ T = 3 ч	Инкубируют ткани в течении 3 ч  5 мин при температуре (37  1) °C и (5  1) % CO 2 во влажной атмосфере инкубатора
Обнаружение формазана	Подготавливают раствор экстракции МТТ с изопропанолом
Экстракция формазаном T = 2 ч	Инкубируют ткани, по меньшей мере, 2 ч или на ночь при комнатной температуре в изопропаноле
	Встряхивают и гомогенизируют после экстракции формазаном
	Переносят экстрагированный раствор формазана на 96-луночный планшет
Измерение	Измеряют OD при помощи спектрофотометра