Приложение 2. Пример оценки комбинированной токсичности наночастиц

Приложение 2
к МР 1.2.0300-22

Пример оценки комбинированной токсичности наночастиц

Протокол
об оценке типа комбинированной токсичности наночастиц оксидов марганца и никеля

1.1. Характеристика исследованных наночастиц (НЧ):

Параметр	Характеристика НЧ
Наименование НЧ	Mn 3О 4	NiO
Размер, нм	18,4 5,4	16,7 8,2
Форма	Сферическая	Сферическая
Концентрация НЧ	0,5 мг/мл	0,5 мг/мл
Растворитель	Деионизированная вода	Деионизированная вода
Токсические свойства НЧ (или входящих в них элементов): - канцерогенность, - гонадотоксичность, - репродуктивная токсичность, - органы-мишени.	Органы-мишени: головной мозг, печень, почки.	Канцерогенность при ингаляционном поступлении (1 категория по МАИР). Кожная сензитивность. Органы-мишени: дыхательная система, кожа, печень, почки, селезенка.

1.2. Дизайн проведенных исследований:

Этап	Объект исследования	Исследуемые дозы/ концентрации	Длительность эксперимента
1	2	3	4
Этап 1 (in vitro)	Клеточная линия нейробластомы человека SH-SY5Y	Концентрация каждого вида НЧ: 3,125 мкг/мл 6,25 мкг/мл 12,5 мкг/мл 25 мкг/мл 50 мкг/мл	24 часа
Этап 2 (in vivo)	Нелинейные белые лабораторные крысы	Доза каждого вида НЧ: 0,125 или 0,25 мг/животное	1 сутки
Этап 3 (in vivo)	Нелинейные белые лабораторные крысы	Однократная доза каждого вида НЧ - 1,25 или 2,5 мг/кг, Суммарная доза - 22,5 или 45 мг/кг	6 недель

1.3. Полученные результаты:

Группа признаков	Ведущий тип комбинированного действия
1	2
Этап 1 (in vitro)
Неспецифические	Аддитивность
Специфические	Аддитивность
Этап 2 (in vivo)
Клеточные показатели	Антагонизм
Отношение нейтрофильных лейкоцитов к альвеолярным макрофагам	Аддитивность
Этап 3 (in vivo)
Приоритетные показатели (при наличии свойств у НЧ или их аналогов): - генотоксичность - канцерогенность, - гонадотоксичность, - репродуктивная токсичность.	Антагонизм
Показатели головного мозга	Антагонизм
Показатели печени	Антагонизм
Показатели почек	Аддитивность
Показатели селезенки	Аддитивность
Показатели общей токсичности на низких уровнях доз	Антагонизм

По завершению 1 этапа экспериментального исследования (см. пункт 3.2) получается разнообразие семейств изобол Лёве, которое интерпретируется как многообразие типов комбинированного действия НЧ NiO и Mn ₃О ₄. Пример аддитивного действия представлен на рис. Б.1.

Рис. Б.1. Аддитивное комбинированное действие НЧ NiO и Mn ₃О ₄ на активность тирозингидроксилазы в культуре клеток линии SH-SY5Y (с ретинолом), измеряется с помощью вестерн-блоттинга и выражается в отношении к активности контрольной культуры. Наблюдается аддитивность со слабо выраженной тенденцией к синергизму при ведущей роли зависимости эффекта от дозы NiO; по осям откладываются концентрации NiO и Mn ₃О ₄ в мкг/мл; цифрами у линий изобол показываются уровни воздействия, которым они соответствуют

По завершению 2 этапа экспериментального исследования (см. пункт 3.3.) получается разнообразие семейств изобол Лёве, которое интерпретируется как многообразие типов комбинированного действия НЧ NiO и Mn ₃О ₄. Пример неоднозначности комбинированного действия НЧ NiO и Mn ₃О ₄ представлен на рис. Б.2: аддитивность на низких дозах НЧ, переходящая в антагонизм и однофакторное действие НЧ NiO при увеличении доз.

Рис. Б.2. Многообразие типов комбинированного действия НЧ NiO и Mn ₃О ₄ на отношение нейтрофильных лейкоцитов к альвеолярным макрофагам; по осям отложены концентрации NiO и Mn ₃О ₄ в мг/животное; цифры у линий изобол показывают уровни воздействия, которым они соответствуют

По завершению 3 этапа экспериментального исследования (см. пункт 3.4) получено разнообразие семейств изобол Лёве, которое интерпретируется как многообразие типов комбинированного действия НЧ NiO и Mn ₃О ₄: на концентрацию мочевой кислоты в сыворотке крови (аддитивность, рис. Б.3(а); на плотность мочи (синергизм при сочетании низких доз НЧ и аддитивность при сочетании высоких доз НЧ, рис. Б.3(б); на процент безъядерных гепатоцитов (аддитивность при сочетании низких доз НЧ и антагонизм при сочетании высоких доз НЧ, рис. Б.3(в).

а	б	в

Рис. Б.3. Многообразие типов комбинированного действия НЧ NiO и Mn ₃О ₄:
(а) на концентрацию мочевой кислоты (мкмоль/л) в сыворотке крови; (б) на плотность мочи; (в) на процент безъядерных гепатоцитов; по осям отложены концентрации NiO и Mn ₃О ₄ в мг/кг массы тела; цифры у линий изобол показывают уровни воздействия, которым они соответствуют.

1.4. Анализ данных.

В процессе анализа полученных результатов выявляется многообразие типов комбинированной токсичности НЧ NiO и Mn ₃О ₄. Ведущими типами для большинства показателей являются аддитивность и антагонизм. Исходя из того, что антагонизм чаще встречается при анализе результатов по органам-мишеням, этот тип комбинированной токсичности рекомендуется считать ведущим.

1.5. Заключение.

По результатам проведенных исследований ведущим типом комбинированного действия НЧ оксидов марганца и никеля является антагонизм.