Приложение 3. Бактериологические методы исследования воды

Приложение 3
к МУК 4.2.3963-23

Бактериологические методы исследования воды

1. Перед посевом пробу тщательно перемешивают (стараясь не намочить пробку), край емкости фламбируют открытым пламенем, пробирки и чашки, подготовленные для посева, маркируют. Перед каждым отбором новой порции воды для исследования пробу перемешивают стерильной пипеткой. Схема посева воды из различных объектов приведена в табл. 3.1 и 3.2 приложения 3 к настоящим МУК.

Для посева проб воды используют следующие методы в зависимости от степени загрязнения воды и от поставленной цели исследования:

- метод прямого посева на агаризованные среды;

- метод мембранной фильтрации;

- титрационный метод;

- метод глубинного посева в плотные питательные среды.

Метод прямого посева

2. Метод выполняют путем нанесения дозированного объема воды (0,1 см ³ или 0,25 см ³) на поверхность предварительно разлитых в чашки Петри агаризованных питательных сред в соответствии с определяемым показателем. Внесенный инокулят растирают стерильным шпателем до полного его впитывания с последующим инкубированием посевов.

Для посева десятикратные разведения воды исследуемого образца пробы следует готовить непосредственно перед анализом. Для разведений используют один из стерильных растворов: физиологический раствор, пептонный, пептонно-солевой, воду пептонную забуференную (приложение 2 к настоящим МУК), разлитых в пробирки по 9 см ³. Стерилизация заранее расфасованных растворов для разведений не рекомендуется, т.к. при автоклавировании их объем может измениться из-за испарения.

Для приготовления 1 разведения (1:10) 1 см ³ хорошо перемешанной анализируемой пробы воды стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 см ³ раствора. При этом пипетка не должна быть опущена ниже поверхности раствора для разведения, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны пипетки. Другой стерильной пипеткой путем многократного заполнения и опорожнения пипетки тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 см ³ и переносят в следующую пробирку с 9 см ³ раствора, получая при этом разведение 1:100.

Посев 0,1 см ³ анализируемой воды на поверхность плотных питательных сред будет соответствовать посеву 0,1 см ³ анализируемой воды, посев 0,1 см ³ из 1 разведения - 0,01 см ³ исследуемой пробы. При необходимости посева меньших объемов, этой же пипеткой переносят 1 см ³ содержимого первой пробирки в следующую пробирку с 9 см ³ раствора для разбавления. Эти операции повторяют до получения необходимого количества разведений.

Допустимо использование метода спирального автоматизированного посева проб воды.

Метод мембранной фильтрации

3. Метод мембранной фильтрации используют при посеве больших объемов проб воды (1 и более см ³). Искомые микроорганизмы концентрируют из заданного объема воды на мембранные фильтры с последующим помещением фильтров на питательную среду и инкубацией посевов.

Подготовка мембранных фильтров. Фильтрующие материалы (мембранные фильтры, аналитические трековые мембраны и другие фильтрующие материалы) с размером диска 35 мм, 37 мм или 47 мм и диаметром пор не более 0,45 мкм, должны быть стерильными или приготовлены к анализу в соответствии с указаниями производителя.

Подготовка фильтровального аппарата. Воронку снимают на лоток. Воронку и столик фильтровального аппарата фламбируют, применяя марлевый (ватный) тампон, смоченный спиртом (не менее 95 %) или газовый пистолет для фламбирования. На столик фильтровального аппарата кладут стерильным пинцетом стерильный или специально подготовленный мембранный фильтр и снова устанавливают фильтровальную воронку.

Фильтрование воды. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, согласно метке на фильтровальной установке, а в случае отсутствия метки используют стерильный мерный цилиндр соответствующего объема, затем создают вакуум и отфильтровывают содержимое воронки. После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край стерильным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на поверхность питательной среды, разлитой в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без фламбирования сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием новой пробы прибор обеззараживают.

Анализ следует начинать с фильтрования проб обеззараженной воды или тех проб, которые предположительно не загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы.

При фильтровании 1 см ³ исследуемой воды следует в воронку налить предварительно не менее 10 см ³ стерильной водопроводной воды, а затем внести 1 см ³ анализируемой воды.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку можно поместить 1 или несколько фильтров в зависимости от размера чашки, но с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

Таблица 3.1

Схема
посева поверхностных вод при работе методом мембранной фильтрации

Объект исследования	Объем засеваемой воды в см 3 для определения
	Обобщенные колиформные бактерии	Энтерококки
Водоемы, не загрязняемые сточными водами	100; 50; 10; 1	100; 50; 10
Водоемы, загрязняемые сточными водами	10; 1; 0,1; 0,01	10; 1; 0,1
Водоемы в зоне влияния выпуска сточных вод	0,1; 0,01; 0,001; 0,0001	1; 0,1; 0,01

Титрационный метод

4. Метод основан на накоплении бактерий в жидкой питательной среде при посеве испытуемой воды и (или) ее десятикратных разведений, с последующим пересевом на дифференциальную плотную среду для идентификации выросших колоний по культуральным, морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам.

Титрационный метод может быть использован:

- при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения исследования методом мембранной фильтрации;

- при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;

- в случае высокого бактериального загрязнения воды, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний.

Посев производят в 2 или 3 параллельных рядах, учитывая при этом, что чем больше повторностей, тем выше точность получаемых результатов.

Таблица 3.2

Схема
посева поверхностных вод при работе титрационным методом

Объект исследования	Объем засеваемой воды (в см 3) для определения *
	Обобщенные колиформные бактерии	Энтерококки
Водоемы, не загрязняемые сточными водами	2 или 3 повторности по: 10; 1; 0,1 2 или 3 повторности по: 10; 1; 0,1; 0,01	50 и 5 повторностей по: 10; 1 2 или 3 повторности по: 100; 10; 1; 0,1
Водоемы, загрязняемые сточными водами	2 или 3 повторности по: 1; 0,1; 0,01; 0,001	2 или 3 повторности по: 10; 1; 0,1; 0,01
Водоемы в зоне влияния выпусков сточных вод	2 или 3 повторности по: 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001; 0,00001	2 или 3 повторности по: 1; 0,1; 0,01; 0,001
Примечание: * - схему посева в 2 или 3 повторностях выбирают в зависимости от необходимой степени точности получаемых результатов.

Схему посева 50 см ³ и 5 по 10 см ³ и 5 по 1 см ³ используют при исследовании воды чистых водохранилищ.

Метод глубинного посева в плотные питательные среды

5. Пробу воды или десятикратные ее разведения вносят параллельно в две чашки Петри по 1 см ³ и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры (4547) °C питательной средой тонким слоем 8 - 12 см ³ (при определении общего микробного числа). При внесении большего объема исследуемой воды (10 см ³) каждую чашку заливают агаризованной средой из расчета 2 части агара к 1 части пробы (колифаги, споры сульфитредуцирующих клостридий).

Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки и не загрязняла крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.