Приложение 2. Пример получения, условия хранения и транспортирования биологического материала

Приложение 2
к МУ 3.1.2/4.2.3973-23

Пример получения, условия хранения и транспортирования биологического материала

Получение биологического материала

1. С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей (при подозрении на ВП) исследуется мокрота при глубоком откашливании, мокрота, полученная при индукции ингаляцией стерильного 5 %-го раствора натрия хлорида через небулайзер, мокрота, полученная аспирацией из зева или из трахеи с помощью хирургического вакуумного или электрического отсоса, эндотрахеальный аспират, БАЛ, получаемый с помощью фибробронхоскопии, а также кровь и плевральная жидкость. Исследование плевральной жидкости выполняется при наличии плеврального выпота и условий безопасного проведения плевральной пункции (визуализация на латерограмме свободно смещаемой жидкости с толщиной слоя > 1,0 см).

В случае невозможности получения материала из нижних дыхательных путей при исследовании на респираторные вирусы, микоплазму и хламидию допустимо использование мазков из верхних дыхательных путей (со слизистой оболочки нижнего носового хода и с задней стенки глотки), которые берут у пациента как можно раньше от момента появления симптомов в одну пробирку и исследуют как один образец.

При подозрении на легионеллезную или паразитарную этиологию инфекции нижних дыхательных путей исследуются БАЛ или биоптаты ткани легких.

У госпитализированных пациентов материал для исследования следует собирать как можно раньше при поступлении (не позднее вторых суток), поскольку в более поздние сроки не исключена возможность суперинфекции при контакте с другими пациентами. Сбор биологического материала для бактериологического исследования следует проводить до назначения АБ.

В случае летального исхода исследуется посмертный (аутопсийный) материал.

Забор клинического материала от больного осуществляется МО, лицензированными для соответствующего вида деятельности.

Получение свободно отделяемой мокроты для бактериологического и ПЦР-исследования

2. Для сбора мокроты необходимо использовать стерильные герметично закрывающиеся пластиковые контейнеры. Перед сбором мокроты необходимо попросить пациента тщательно прополоскать рот кипяченой водой. Сбор мокроты осуществляется натощак или не ранее 2 ч после еды.

Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть, что способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты. Затем пациента просят хорошо откашляться и собрать отделяемое из нижних дыхательных путей (не слюну!) в стерильный контейнер. Объем образца мокроты должен быть не менее 3 мл для взрослых и около 1 мл для детей.

До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование следует хранить в холодильнике при температуре от 2 до 8 °C не более 24 часов. Продолжительность хранения мокроты при комнатной температуре не должна превышать 2 ч.

Для исследования методом ПЦР допускается хранение образца мокроты в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °C, более длительно - при температуре не выше -16 °C.

Получение венозной крови для бактериологического исследования

3. Для сбора крови с целью бактериологического исследования используются коммерческие герметично закрывающиеся стеклянные флаконы или флаконы из ударопрочного автоклавируемого пластика двух видов (содержащие питательную среду для выделения аэробов и анаэробов). Для культурального исследования крови необходимо использовать коммерческие флаконы с питательными средами.

Забор крови производится шприцем, кровь асептически переносится во флакон с транспортной средой непосредственно через резиновую пробку.

Забираются 2 образца венозной крови с интервалом 20 - 30 мин. из различных периферических вен - например, левой и правой локтевой вены. Один образец помещается во флакон для выделения аэробов, другой для выделения анаэробов. Объем крови при каждой венепункции должен составлять не менее 10 мл для взрослых и 3 мл для детей. Манипуляция проводится в установленном порядке ³³.

------------------------------

³³_{Клинические рекомендации "Внебольничная пневмония у взрослых".}

------------------------------

Флаконы с венозной кровью должны быть доставлены в микробиологическую лабораторию в течение 2 ч, в случае невозможности быстрой доставки флаконов с кровью в лабораторию допускается их хранение при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 24 ч, "ручные" флаконы для гемокультивирования могут храниться в термостате при 35 - 37 °С до момента доставки в микробиологическую лабораторию. Недопустимо доставлять для бактериологического исследования цельную кровь!

Получение венозной крови для ПЦР-исследования

4. Взятие крови следует производить натощак или через 3 ч после приема пищи из локтевой вены в положении сидя. Манипуляция проводится в установленном порядке ³⁴.

------------------------------

³⁴_{Клинические рекомендации "Внебольничная пневмония у взрослых".}

------------------------------

Манипуляция проводится с помощью вакуумной системы для забора крови типа "Vacuett" в пробирки, содержащие 6 % этилендиаминтетрауксусную кислоту (далее - ЭДТА) или цитрат натрия, или одноразовым шприцем с иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в пластиковые пробирки с 3,8 % раствором цитратом натрия (в соотношении 1:9) или с 6 % ЭДТА (в соотношении 1:20), закрывающиеся герметичной крышкой. Пробирки аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом (в противном случае кровь свернется, и выделение ДНК/РНК станет невозможным). Пробирку поместить в штатив.

Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!

Образцы цельной крови хранятся при температуре от 20 °C до 25 °C - в течение 2 часов; при температуре от 2 °C до 8 °C - в течение 6 часов с момента взятия материала для количественного определения нуклеиновых кислот, в течение 12 часов - для качественного определения нуклеиновых кислот.

Недопустимо замораживание образцов цельной крови.

Получение плевральной жидкости для бактериологического и ПЦР-исследования

5. Получение материала осуществляется в одноразовые, плотно завинчивающиеся пробирки объемом 10 - 15 мл.

Манипуляция проводится в установленном порядке ³⁵. Объем пробы должен составлять не менее 5 мл.

------------------------------

³⁵_{Клинические рекомендации "Внебольничная пневмония у взрослых".}

------------------------------

До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование хранится в холодильнике при от 2 до 8 °C не более 24 часов. Продолжительность хранения плевральной жидкости при комнатной температуре не должна превышать 2 ч.

Для исследования методом ПЦР допускается хранение образца в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °C, более длительно - при температуре не выше -16 °C.

Получение БАЛ для бактериологического и ПЦР-исследования

6. Для сбора БАЛ необходимо использовать стерильные герметично закрывающиеся пластиковые контейнеры. Манипуляция проводится в установленном порядке ³⁶.

------------------------------

³⁶_{Клинические рекомендации "Внебольничная пневмония у взрослых".}

------------------------------

До момента транспортировки образец хранится в холодильнике при температуре от 2 до 8 °C. Продолжительность хранения БАЛ при комнатной температуре не должна превышать 2 ч.

Для исследования методом ПЦР допускается хранение образца в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °C, более длительно - при температуре не выше минус 16 °C.

Получение эндотрахеального аспирата для бактериологического и ПЦР-исследования (проводится ИВЛ)

7. Для получения трахеального аспирата используют систему для сбора содержимого трахеобронхиального дерева через эндотрахеальную трубку. Для сбора эндотрахеального аспирата необходимо использовать стерильные герметично закрывающиеся пластиковые контейнеры. Манипуляция проводится в установленном порядке ³⁷.

------------------------------

³⁷_{Клинические рекомендации "Внебольничная пневмония у взрослых".}

------------------------------

До момента транспортировки образец вместе с направлением хранится в холодильнике при температуре от 2 до 8 °C. Продолжительность хранения БАЛ при комнатной температуре не должна превышать 2 ч.

Для исследования методом ПЦР допускается хранение образца в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °C, более длительно - при температуре не выше минус 16 °C.

Получение аспирата из зева для ПЦР-исследования (пациент на самостоятельном дыхании)

8. Для получения аспирата из зева используется устройства для сбора и транспортировки микробиологического материала (мукус-экстрактор) с герметично завинчивающейся крышкой. Манипуляция проводится в установленном порядке ³⁸.

------------------------------

³⁸_{Клинические рекомендации "Внебольничная пневмония у взрослых".}

------------------------------

Допускается хранение образца в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °C, более длительно - при температуре не выше -16 °C.

Получение индуцированной мокроты для бактериологического и ПЦР-исследования

9. Индукция мокроты проводится под наблюдением врача в помещении, оборудованном для оказания неотложной помощи. Для сбора мокроты необходимо использовать стерильные герметично закрывающиеся пластиковые контейнеры. Манипуляция проводится в установленном порядке ³⁹.

------------------------------

³⁹_{Клинические рекомендации "Внебольничная пневмония у взрослых".}

------------------------------

До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование хранится в холодильнике при температуре от 2 до 8 °C. Продолжительность хранения мокроты при комнатной температуре не должна превышать 2 ч.

Для исследования методом ПЦР допускается хранение в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °C, более длительно - при температуре не выше минус 16 °C.

Получение мазков из верхних дыхательных путей для ПЦР-исследования

10. Материал берут после полоскания полости рта кипяченой водой комнатной температуры. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. В течение 6 ч перед процедурой не рекомендуется использовать медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку и препараты для рассасывания во рту.

Мазки у пациента берут двумя разными зондами сначала со слизистой нижнего носового хода, а затем из ротоглотки, при этом концы зондов с тампонами после взятия мазков последовательно помещаются в одну полипропиленовую пробирку объемом 1,5 - 2,0 мл с 0,5 мл транспортной среды. Рекомендуется использовать коммерческую транспортную среду для респираторных мазков, при невозможности ее приобретения допустимо использовать стерильный физиологический раствор хлористого натрия (0,9 %).

Мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят параллельно небу легким движением по наружной стенке носа вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3 - 4 см для детей и 5 - 6 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают в пробирку с транспортной средой до места слома, далее, прикрывая сверху пробирку крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают.

Мазки со слизистой носоглотки у взрослых допустимо брать также сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампоном.

Мазки из ротоглотки берут сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампоном вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки, аккуратно прижимая язык пациента шпателем. После забора материала рабочую часть зонда с тампоном помещают в пробирку с транспортной средой и зондом с мазком из носоглотки. Конец зонда с тампоном (1 см) отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку.

Допускается хранение при комнатной температуре - не более 6 часов, при температуре 2 - 8 °C - в течение 3 суток (в коммерческой транспортной среде), более длительно - при температуре не выше -16 °C.

При использовании физиологического раствора образцы биоматериала хранятся при температуре 2 - 8 °С не более суток, замораживание/размораживание не рекомендуется, поскольку приводит к разрушению РНК/ДНК возбудителей.

Получение мазков из верхних дыхательных путей для обнаружения вирусных АГ

11. Перечень используемого биоматериала, процедура сбора биоматериала и его исследования проводится строго согласно инструкции производителя конкретного теста.

Расходные материалы (зонды для сбора мазков со слизистой носоглотки и др. биоматериала, пробирки для подготовки образца к исследованию) могут входить или не входить в комплект реагентов.

Биоматериал исследуется сразу после его сбора и хранению не подлежит.

Получение мазков из верхних дыхательных путей для получения культуры вирусов гриппа

12. Мазки со слизистой оболочки носоглотки из нижнего носового хода собирают стерильными зондами с вискозными тампонами в стерильную вирусологическую транспортную среду с антибиотиками (Среда 199: раствор Хенкса (500 мл) + 1 мл гентамицина + 5 мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) + 5 мл Хепес-буфера (Hepes buffer)), рекомендованную в методических рекомендациях ⁴⁰.

------------------------------

⁴⁰_{Выделение вирусов гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация. Методические рекомендации, утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 18.04.2006 N 0100/4430-06-34.}

------------------------------

Вирусологическую транспортную среду готовят в стерильных условиях, аликвотируют в одноразовые стерильные пробирки из полипропилена стерильным наконечником по 1,0 - 2,0 мл, маркируют и хранят до использования при температуре от 2 до 8 °C.

Мазки со слизистой носоглотки берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят параллельно небу легким движением по наружной стенке носа вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3 - 4 см для детей и 5 - 6 см для взрослых).

После взятия материала тампон, не нарушая стерильности, помещают в пробирку с 2,0 - 5,0 мл вирусологической транспортной среды с антибиотиком.

Мазки хранят в течение 24 ч при температуре от 2 до 8 °C, более длительно - при температуре не выше минус 20 °С.

Получение и транспортирование мочи для определения АГ легионелл или пневмококка

13. Образцы мочи для исследования объемом 5 - 10 мл помещают в стандартные пластиковые контейнеры и хранят при комнатной температуре (15 - 30 °С) не более 24 ч после получения перед постановкой реакции. Исследование выполняется непосредственно "у постели больного" или в лаборатории. В случае выполнения с свежесобранным образцом мочи ее нужно перемешать круговыми движениями и далее четко следовать инструкции по выполнению теста. Результат может быть положительным, отрицательным и недействительным. Обычно его выполнение занимает 15 - 20 мин.

В случае необходимости образцы могут храниться при температуре от 2 до 8 °C до 14 дней или при -20 °C в течение длительного времени для первичного или повторного исследования. Перед постановкой реакции охлажденные или замороженные образцы мочи исследуют на наличие АГ после достижения комнатной температуры.

Получение материала для микроскопического исследования на грибы-аскомицеты

14. С помощью микроскопии на наличие грибов-аскомицет исследуется прижизненный материал (БАЛ, индуцированная мокрота, биоптаты тканей легких) и посмертный материал.

При жизни легочную ткань получают трансбронхиальной биопсией с помощью бронхоскопа, что позволяет выявить пневмоцисты в 66 - 98 %, этот метод забора материала показан далеко не всем больным.

Получение материала для исследования возможно и при открытой биопсии легкого или с помощью чрезкожной интраторакальной аспирации легочной иглой у больных, которым противопоказано проведение трансбронхиальной биопсии. Метод открытой биопсии легкого дает наилучшие результаты и приравнивается по результату к хирургическому вмешательству, при этом получается достаточно большой объем материала для исследования и ложноотрицательный результат полностью исключается.

Для выявления цист и трофозоитов исследуется БАЛ, получаемый по стандартному протоколу.

Посмертный материал собирают в течение первых суток после гибели больного, приготавливают мазки-отпечатки легкого или мазки из содержимого альвеол.

Получение материала для серологической диагностики (Выявление специфических АТ)

15. Для серологического исследования (определение АТ) необходимы две пробы сыворотки крови, 1-я проба берется в день постановки первичного диагноза, 2-я проба - через 2 - 3 недели после первой. Взятие крови осуществляется из вены в объеме 3 - 4 мл, или из третьей фаланги среднего пальца в объеме 0,5 - 1,0 мл в одноразовую пластиковую пробирку без антикоагулянта. Пробы крови отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин или помещают в термостат при температуре 37 °C на 15 мин. После центрифугирования (10 мин. при 3000 об/мин) сыворотку переносят в стерильные пробирки, используя для каждого образца отдельный наконечник с аэрозольным барьером. Срок хранения цельной крови - не более 6 ч, замораживание недопустимо. Срок хранения сыворотки крови при комнатной температуре - в течение 6 ч, при температуре 2 - 8 °C - в течение 5 суток, более длительно - при температуре не выше -16 °C (многократное замораживание/размораживание недопустимо).

Сбор посмертного материала для ПЦР-исследования

16. Посмертный (аутопсийный) материал собирают в течение первых суток после гибели больного стерильным индивидуальным инструментом (индивидуально для каждого органа) из зоны поврежденной ткани объемом 1 - 3 куб. см, помещают в одноразовые стерильные полипропиленовые контейнеры с герметично завинчивающейся крышкой, замораживают и хранят при температуре не выше -16 °C.

Исследуется материал следующих органов:

- фрагменты пораженной части трахеи/бронхов/легких;

- фрагменты пораженной части мягких мозговых оболочек/коры больших полушарий (при наличии менингеальной симптоматики в анамнезе);

- фрагменты других органов (при наличии симптомов инфекции и поражений, обнаруженных при вскрытии), например, фрагменты селезенки, пораженной части миокарда, тонкого кишечника.

Материал для исследования должен быть нативным (без фиксации формалином).

Маркировка биоматериала и подготовка к транспортированию для исследования

17. На этикетке пробирки (контейнера) с пробой материала указывается: идентификационный номер образца, по которому можно соотнести сопроводительную информацию об образце и пациенте (приложение 3) с пробой биоматериала, дата взятия материала, тип материала.

При транспортировании внутри одного здания, пробирки / контейнеры с биологическим материалом помещают в штативы и специальные герметичные контейнеры-переноски. Транспортирование производится при комнатной температуре или при температуре от 2 до 8 °C.

При необходимости транспортирования биологического материала в другие организации, образцы от каждого пациента проверяют на герметичность, упаковывают в индивидуальный герметичный пакет (или контейнер) с адсорбирующим материалом и дополнительно упаковывают в общий герметичный контейнер (или пакет), помещаемый в термоконтейнер с хладагентами.

Транспортирование материала производится в термоконтейнерах с соблюдением сроков и температурных режимов, рекомендованных для конкретного типа биоматериала и метода исследования.

В контейнер рекомендуется поместить одноразовый индикатор, контролирующий соблюдение требуемой температуры ⁴¹.

------------------------------

⁴¹_{Глава IV СанПин 3.3686-21.}

------------------------------

Обработка биологического материала перед проведением лабораторных исследований

18. В лаборатории перед проведением лабораторных исследований при необходимости проводится предварительная обработка биологического материала.

Обработка проводится согласно действующим методическим документам и инструкциям к диагностическим наборам.

Для снижения вязкости некоторых образцов мокроты, аспиратов из трахеи для исследований с помощью МАНК обработка препаратами, разрушающими мукополисахариды, проводятся в соответствии с методическими документами ⁴².

------------------------------

⁴²_{МУ 1.3.2569-09.}

------------------------------

Аутопсийный материал гомогенизируют, готовят 10 % суспензию с использованием стерильного 0,9 % раствора натрия хлористого и центрифугируют для использования в работе надосадочной жидкости.