Методические указания МУ 3.3.1.1112-02 "Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей" (утв. Главным государственным санитарным врачом России 26 февраля 2002 г.)

Методические указания МУ 3.3.1.1112-02
"Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей"
(утв. Главным государственным санитарным врачом России 26 февраля 2002 г.)

Дата введения: 1 мая 2002 г.

1. Область применения

1.1. Методические указания "Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей" разработаны в помощь Государственным комиссиям при проведении приемочных испытаний новых вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба для иммунизации людей, а также для исследователей, занимающихся их разработкой.

2. Нормативные ссылки

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы.

2.1. Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

2.2. Методические указания "Основные критерии отбора вакцинных штаммов, предназначенных для изготовления сибиреязвенных вакцин для иммунизации людей", утвержденные Минздравом СССР 22.02.82.

2.3. РД 42-28-24-88 "Медицинские иммунобиологические препараты. Основные термины и определения".

2.4. РД 42-281-91 "Государственные приемочные испытания МИБП. Порядок проведения. Основные положения".

2.5. Положение о государственной регистрации, сертификации и государственном контроле за качеством медицинских иммунобиологических препаратов в Российской Федерации. Постановление ГКСЭН N 5 от 3.07.94.

2.6. Санитарные правила СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности".

2.7. Санитарные правила СП 3.3.2.561-96. 3.3.2. "Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов".

Введение

Сибирская язва относится к числу особо опасных инфекционных заболеваний. Для профилактики сибирской язвы в России применяют живую вакцину, поэтому требования к отбору, доклиническим испытаниям и оценке новых вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба должны быть строгими и информативными. Проведение испытаний безопасности и специфической активности живых сибиреязвенных вакцин на людях ограничено и может быть проведено только в случае установления в предварительных доклинических лабораторных исследованиях полной безопасности вакцинных штаммов.

Все испытания нового штамма, предлагаемого в качестве вакцинного, проводят в сравнении с эталонным вакцинным штаммом сибиреязвенного микроба СТИ-1.

На основании результатов Государственных лабораторных (доклинических) испытаний о соответствии штамма Bac. anthracis требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам данными методическими указаниями, одобренных национальным органом контроля (ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), Министерство здравоохранения Российской Федерации разрешает проведение ограниченных клинических, затем Государственных испытаний живой вакцины, приготовленной на основе этого штамма на добровольцах. После утверждения Министерством здравоохранения испытуемого штамма в качестве вакцинного по результатам Государственных испытаний на добровольцах, одобренных Комитетом МИБП, дальнейшие этапы внедрения живой вакцины проводят в установленном порядке.

3. Общие положения

3.1. Для изготовления живой вакцины применяют штаммы сибиреязвенных бацилл, стабильно утратившие способность продуцировать капсулу в организме животных и на специальных питательных средах, апатогенные для человека, сельскохозяйственных животных и кроликов, проявляющие остаточную вирулентность для морских свинок и белых мышей.

3.2. При испытании новых сибиреязвенных вакцинных штаммов их оценка должна проводиться одновременно с эталонным вакцинным штаммом СТИ-1. Вакцинный штамм СТИ-1 на основании многолетнего экспериментального изучения и широкого применения для вакцинации людей и сельскохозяйственных животных принят в качестве эталона. Лиофилизированные споровые культуры вакцинного штамма СТИ-1 (маточную культуру и отраслевой стандартный образец вакцины СТИ) хранит и выдает Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Министерства здравоохранения РФ.

Основными критериями отбора вакцинных штаммов, предназначенных для вакцинации людей против сибирской язвы, являются безвредность, слабая реактогенность и иммуногенность. Культурально-морфологические, биохимические и другие признаки испытуемых штаммов сибиреязвенного микроба могут варьировать, но должны соответствовать видовым признакам штамма.

3.3. Все исследования с испытуемым штаммом, пока он не будет по настоящим критериям признан вакцинным (III группа), проводят в соответствии с санитарными правилами СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами 1 - 2 групп патогенности" как с микроорганизмом, относящимся ко II группе патогенности. Данное положение не распространяется на варианты, полученные на основе вакцинного штамма СТИ-1.

4. Характеристика штамма по видовым признакам

Возбудителями сибирской язвы являются микроорганизмы рода Bacillus, вида anthracis. В. anthracis - облигатный паразит, хемоорганотроф, метаболизм факультативно аэробный, грамположительные, неподвижные палочки, образуют термоустойчивые эндоспоры.

4.1. Испытуемый сибиреязвенный штамм при посеве в бульон Хоттингера ^*, при pH 7,2 - 7,3 после суточной инкубации при температуре 35 - 37 °С должен давать типичный для возбудителя сибирской язвы рост культуры у дна пробирки в виде "комка ваты", относительно трудно разбивающегося при встряхивании; в толще прозрачного бульона возможно наличие хлопьев растущей культуры. В мазках из суточных бульонных культур, окрашенных по Граму, морфологически типичные для возбудителя сибирской язвы грамположительные палочки длиной 3 - 10 мкм и цепочки из этих палочек. В висячей капле - отсутствие подвижности бацилл.

------------------------------

^*_{Бульон и агар Хоттингера готовят по МУК 4.1/4.2.588-96, с. 45 - 46.}

------------------------------

4.2. При посевах на чашки Петри с питательным агаром Хоттингера ^* после суточной инкубации при температуре (361) °С культура штамма должна вырастать в виде сухих, с "шагреневой" поверхностью колоний, с неровными краями, характерных для R или RO-формы, не должно быть гладких S-форм колоний.

В мазках из агаровых культур должны обнаруживаться грамположительные бациллы, обычно группирующиеся более короткими цепочками, чем в мазках из бульонных культур.

4.3. При посеве испытуемого сибиреязвенного штамма на агар Хоттингера в чашках Петри с добавлением 5 %-ной дефибринированной крови кролика или барана не должно наблюдаться гемолиза. При посеве 1 капли (0,05 мл) взвеси, содержащей 100 - 200 тысяч спор, неантибиотикорезистентного штамма в пробирки с питательным бульоном, разлитым по 5 - 7 мл и содержащим 1000 ед/мл пенициллина, не должно быть роста культуры испытуемого сибиреязвенного штамма через 20 - 24 ч инкубации при температуре (361) °С.

4.4. При посеве 3-часовой бульонной культуры неантибиотикорезистентных сибиреязвенных штаммов на агар Хоттингера в чашках Петри с добавлением к среде 0,5 и 0,05 ед/мл пенициллина через 2,5 - 3 ч инкубирования при температуре (361) °С должен проявляться рост культуры, наблюдаемый при фазово-контрастной микроскопии в виде шаров, соединенных в цепочки - "феномен ожерелья". Необходим контрольный посев изучаемой 3-часовой бульонной культуры на тот же агар без добавления пенициллина; рост должен быть типичным для возбудителя сибирской язвы.

4.5. На плотной питательной среде Гладстона-Фильда (состав среды приведен в п. 1 прилож. 1) или на питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса или рыбокостной муки, принятой для изготовления живой споровой вакцины (РП N 831-98), через 4 сут. инкубации при температуре 33 - 35 °C в мазках из выросшей культуры должно быть не менее 90 % типичных сибиреязвенных спор по отношению к общему числу бацилл. Мазки окрашивают по методу Циля-Нильсена или Ребигера ^*. Методика определения концентрации спор приведена в п. 2 прилож. 1.

4.6. В испытуемой культуре вакцинного штамма должно выявляться методом микрокультур не менее 90 % живых спор, высевом - не менее половины. Методика определения приведена в п. 2 прилож. 1.

4.7. Оценка генетической и фенотипической полноценности сибиреязвенных штаммов, как вакцинных по детерминантам и факторам иммуногенности и вирулентности.

4.7.1. Определение присутствия плазмиды рХО1 в вакцинном штамме.

Вакцинный штамм должен содержать плазмиду рХО1 или клонированные гены, ответственные за синтез ПА. Плазмида рХО1 (110 МД) кодирует синтез сибиреязвенного токсина, состоящего из ПА - протективного антигена, ЛФ - летального фактора, ОФ - отечного фактора. ПА является основным иммуногенным фактором. Методика определения приведена в п. 3 прилож. 1.

4.7.2. Определение отсутствия у штамма капсулы при культивировании на питательных средах.

В посевах культур испытуемого штамма на чашки Петри со средой Шефера (сыворотка крови лошади, свернутая при температуре 80 °C в течение 48 ч) или на 1 %-ном бикарбонатном агаре (агар Хоттингера с 1 %-ной питьевой соды) после инкубации в течение 2 сут. при температуре 37 °C в анаэростате должен наблюдаться рост шероховатых матовых колоний, сходных с R-колониями на обычных питательных средах; в мазках из колоний должны обнаруживаться только бациллы, лишенные капсулы. Должны полностью отсутствовать гладкие, блестящие колонии, содержащие капсульные формы бацилл.

В жидкой среде ГКИ (60 % раствора Хенкса с 40 % сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при 56 °C 30 мин, pH 7,2 - 7,3) должен быть рост только бескапсульных палочек. Для выявления капсулообразования посевы, закрытые резиновыми пробками, инкубируют 16 - 18 ч при температуре 37 °C. Мазки из культур фиксируют метиловым спиртом с 10 %-ным формалином и окрашивают раствором метиленового синего по Леффлеру. Для контроля качества сред и условий культивирования таким же образом следует провести посевы капсулообразующего штамма 71/12 2-й вакцины Ценковского.

Методика окрашивания мазков по Цилю-Нильсену и Ребигеру приведена в Инструкции и методических указаниях по клинической и лабораторной диагностике, лечению и профилактике сибирской язвы у людей (Саратов, 1970. С. 56 - 57).

4.7.3. Определение отсутствия у испытуемого штамма плазмиды рХО2, кодирующей синтез капсулы, с использованием метода электрофореза ДНК в агарозовом геле.

Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба не должен иметь в своем геноме плазмиды рХО2, кодирующей синтез капсулы. Определение отсутствия у штамма плазмиды рХО2 проводят по методике, изложенной в п. 4.7.1, одновременно с определением плазмиды рХО1.

На фотографии агарозного геля у испытуемого штамма и контрольного вакцинного штамма СТИ-1 должна отсутствовать полоска, соответствующая по размеру ДНК плазмиде рХО2 (60 МД). В качестве контроля используют штамм В. anthracis KM 34 рХО2 ⁺, рХО1 ^- или аналогичный несущий только плазмиду капсулообразования и не содержащий в своем геноме плазмиду рХО1 (ПО МД), ответственную за синтез сибиреязвенного токсина.

4.7.4. Определение наличия pag-гена, кодирующего токсинообразование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба должен содержать pag-ген плазмидной или иной локализации.

Определение наличия pag-гена приведено в п. 4 прилож. 1.

4.8. Характеристика основных свойств эталонного вакцинного штамма сибиреязвенного микроба СТИ-1.

N п/п	Признаки	Характеристика
1	Морфология	палочки, споры
2	Подвижность	отсутствует
3	Окраска по Граму	грамположительная
4	Рост на МП Б	"комок ваты" в прозрачном бульоне
5	Рост на плотных питательных средах	R и RO-формы с типичными "локонами", в виде "головы медузы" или "львиной гривы"
6	Гемолиз на агаре Хоттингера с 5 % дефибринированной крови	отсутствует
7	Рост на агаре Хоттингера с пенициллином	"феномен ожерелья"
8	Наличие капсулы	отсутствует
9	Наличие плазмиды рХО1	имеется
10	Наличие pag-гена	имеется
11	Наличие плазмиды рХО2	отсутствует
12	Наличие cap-гена	отсутствует

5. Оценка безвредности штамма как вакцинного

5.1. Вакцинные штаммы сибиреязвенного микроба относятся к III группе патогенности. Они безвредны для людей, сельскохозяйственных животных, кроликов, но обладают определенной степенью остаточной вирулентности для морских свинок и мышей; в больших дозах могут убивать этих животных. Поэтому испытание безвредности аттенуированных штаммов сибиреязвенного микроба, перспективных в качестве вакцинных, проводят на мышах, морских свинках, кроликах, овцах и козах, а также по отсутствию у них полноценного гена, кодирующего патогенность (синтез капсулы). Методики подготовки животных и проведение исследований приведены в прилож. 2.

5.2. Величина LDso для белых беспородных или инбредных мышей C57BL испытуемой культуры не должна статистически значимо отличаться от LDso эталонного вакцинного штамма СТИ-1. Количество погибших мышей с септицемией после введения испытуемого штамма должно быть близким к числу погибших от введения контрольного штамма. В мазках-отпечатках из органов мышей должны обнаруживаться только бескапсульные формы.

5.3. Показатель летальности морских свинок. До 50 % морских свинок, привитых 5·10 ⁷ живых спор вакцинного штамма сибиреязвенного микроба, могут погибать с генерализацией микробов по всем органам, тканям и крови. От 10 ⁶ живых спор могут погибать единичные животные. У погибших животных в области инъекции наблюдают воспалительный отек, часто он распространяется на область паха и брюшной стенки. Возможны изъязвления в области инъекции. От 10 ⁴ и 10 ² спор должны выжить все морские свинки.

5.4. Клинические проявления реакции на введение споровой культуры испытуемого штамма в дозах 5·10 ⁷ спор заключаются в развитии у большинства привитых свинок воспалительного отека в области инъекции с большим или меньшим распространением его на область паха и брюшной стенки. Возможны изъязвления в области инъекции. Эти отеки указывают на наличие остаточной вирулентности у испытуемой культуры и косвенно свидетельствуют о ее иммуногенности. Введение сибиреязвенного вакцинного штамма сопровождается незначительным повышением температуры тела. Допустимо повышение на 1,5 - 2 °С в зависимости от дозы. Температура тела повышается главным образом у животных, которые в дальнейшем погибают от сибиреязвенного штамма. За 1 - 2 сут. до гибели наблюдается снижение температуры на 1 - 2 °C ниже нормы.

В первые трое - пять суток после введения вакцинного сибиреязвенного штамма во всех дозах (10 ² - 5·10 ⁷ спор) возможно снижение массы тела морских свинок до 1/5 от исходной величины. На 7 - 10-е сутки начинается восстановление массы тела.

5.5. Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба должен размножаться в организме морских свинок в течение первых 15 сут., обусловливая тем самым иммунологическую перестройку организма. Бациллы испытуемой культуры могут быть выделены регулярно и в значительном количестве из лимфатических узлов и внутренних органов животных, привитых 5·10 ⁷ спор, забитых, начиная с 1 сут. после введения и до 3 - 5-го дня. В более поздние сроки высевы при этой иммунизирующей дозе бывают скудными и не всегда положительными из отечной жидкости в области инъекции микробы испытуемого штамма могут выделяться в течение всего срока наблюдения (до 30 сут.). Посевы крови из сердца могут дать рост культуры при дозе 5·10 ⁷ до 30 % и более случаев. При дозах 10 ⁶, 10 ⁴ и 10 ² спор рост культуры сибиреязвенного вакцинного штамма наблюдается редко и в виде изолированных колоний.

5.6. Определение безвредности штаммов для кроликов.

5.6.1. Клинические наблюдения. Местная реакция может наблюдаться у кроликов в течение первых 10 сут. в виде гиперемии кожи и незначительного уплотнения: (1 х 1) см или (1,5 х 2) см. Лишь у одной трети животных могут наблюдаться незначительные отеки и пастозность кожи места инъекции, рассасывающиеся без образования язв или абсцессов. Температура тела у кроликов повышается незначительно. Масса тела животных, как правило, не снижается.

5.6.2. Определение приживаемости и распространяемости штаммов по органам и тканям. Культура вакцинного штамма сибиреязвенного микроба выделяется от большинства кроликов в течение первых двух - трех недель и более из места введения, реже - из лимфатических узлов. Из внутренних органов она может быть выделена в первые 5 сут. в незначительном количестве и нерегулярно. Допускается выделение единичных колоний из легкого или крови от 1 - 2 кроликов из 10 взятых в опыт в течение первых трех суток. В мазках-отпечатках органов должны обнаруживаться только бескапсульные бациллы.

5.7. Определение безвредности штамма для овец и коз.

5.7.1. Определение реактогенности по клиническим наблюдениям. В первые сутки после вакцинации может наблюдаться повышение температуры тела большинства животных, в течение первых суток, как правило не превышающее 1 °С. К концу недели температура тела у овец достигает исходной величины. Лишь у единичных овец температура может повыситься на 2 °С и сохраняться выше нормы до 10 - 14 сут. Все овцы и козы должны выжить без клинических проявлений инфекционного процесса при наблюдении за ними в течение 20 дней. Общая и местная реакция у овец и коз на введение испытуемого штамма не должна существенно отличаться от реакции после введения контрольного вакцинного штамма.

5.7.2. Определение приживаемости и распространяемости штаммов по органам и тканям. Вакцинный штамм сибиреязвенного микроба может выделяться от овец и коз в течение 20 - 30 сут. из места введения и регионарного лимфатического узла. Из внутренних органов бациллы вакцинного штамма выделяются редко в течение первых 5 - 7 сут. Допускается выделение вакцинного штамма из крови и легких овец не более, чем от одного из 10 животных до 3 сут. в виде единичных колоний.

5.8. Оценка безвредности нового вакцинного штамма по данным патоморфологических исследований.

5.8.1. Испытуемый штамм не может быть признан вакцинным, если он в одних и тех же дозах и при прочих равных условиях вызывает у привитых животных с большей частотой или более интенсивные и распространенные изменения, чем штамм СТИ-1.

5.8.2. Патоморфологическая оценка безвредности испытуемых штаммов в опытах на морских свинках.

5.8.2.1. Место введения. После введения дозы в 10 ⁶ спор макроскопически через 1 сут. и в последующие сроки наблюдается более или менее выраженная гиперемия кожи, подкожной клетчатки и подлежащих мышц с резким расширением венозных сосудов ("инъекция"). С 3 суток может присоединиться у отдельных животных значительно выраженное серозно-геморрагическое или желатинозно-геморрагическое пропитывание тканей экссудатом (воспалительный отек) и очаговые, иногда довольно крупные, кровоизлияния. Воспалительный отек тканей может распространяться на стороне введения на область паха, боковую стенку брюшка и, отчасти, грудную клетку.

Такие изменения наиболее выражены через 3 - 5 сут. после введения культуры, а затем быстро стихают. В более поздние сроки у единичных животных могут наблюдаться небольшие фокусы нагноения, которые через 21 - 30 сут. принимают характер осумкованных абсцессов. У отдельных животных могут встречаться кожные свищи с опорожнением гнойных полостей и развитием обширного участка рубцевания тканей.

Вышеперечисленные изменения в тканях на месте введения допустимы при дозе в 10 ⁶ спор, но не при меньших дозах и не должны превышать наблюдаемые при действии эталонного штамма СТИ-1.

Недопустимым следует считать систематически наблюдаемое слишком резко выраженное развитие воспалительного отека, распространяющегося на противоположную сторону туловища, включая верхнюю часть грудной клетки, а также обширные и глубокие некротические и гнойные изменения на месте введения. Такие изменения характерны для морских свинок, погибших в ходе опытов. Крупные и плотные скопления микробов с распространенным некрозом или нагноением в тканях нужно считать недопустимыми у умерщвленных животных.

5.8.2.2. Регионарные лимфатические узлы. В остром периоде процесса (1 - 7-е сут.) у большинства животных, особенно в дозе 10 ⁶ спор, могут отмечаться макроскопически умеренное увеличение, уплотнение и полнокровие регионарных лимфатических узлов, выраженные соответственно величине дозы и интенсивности процесса в тканях на месте введения. У единичных животных может наблюдаться значительный серозно-геморрагический периаденит; паховые лимфатические узлы могут быть вовлечены в зону воспалительного отека на месте введения. В поздние сроки (14 - 30-е сут.) допустимы рубцовые изменения в клетчатке вокруг лимфатических узлов. Патогистологически наблюдается картина умеренно, в отдельных случаях значительно выраженного острого серозного или серозно-геморрагического лимфаденита без очагов некроза, нагноения и микробных скоплений. В более поздние сроки (14 - 30-е сут.) преобладают гиперпластические изменения лимфоидной ткани, у отдельных животных могут встречаться подострые и остаточные явления воспаления в виде небольших участков грануляционной ткани без значительных фокусов некроза и нагноения в центре, а также слабовыраженных склеротических процессов. Описанные патогистологические изменения допустимы во всех испытуемых дозах.

Недопустимы макроскопически и гистологически регистрируемые типичные геморрагические лимфадениты с некрозами, очагами гнойного расплавления и скоплениями микробов.

5.8.2.3. Отделенные лимфатические узлы. В остром периоде процесса, особенно при значительных изменениях на месте введения, в контралатеральных, а также в подмышечных лимфатических узлах со стороны первичного аффекта могут наблюдаться умеренное увеличение и полнокровие. Гистологически отмечается переходящий серозный лимфаденит. В более позднем периоде процесса и в остальных отдаленных узлах характерны гиперпластические изменения лимфоидной ткани. Во всех дозах недопустимы значительно выраженные серозно-геморрагические лимфадениты и периадениты, а также некрозы, нагноения и микробные скопления в узлах.

5.8.2.4. Легкие. В остром периоде процесса у части животных допустимо умеренно выраженное неравномерное полнокровие легких, а во все сроки наблюдения - наличие западающих участков легочной ткани несколько пониженной воздушности. При всех дозах в ряде случаев могут встречаться немногочисленные мелкоточечные, редко более крупные свежие кровоизлияния под плеврой. Гистологически при этом имеется неравномерная воздушность легочной ткани и участки интерстициальной инфильтративной реакции за счет накопления мононуклеарных элементов с редкими полиморфонуклеарами и микроскопическими кровоизлияниями. У отдельных животных после введения 10 ⁶ спор, но не меньших доз, допустимо наличие единичных мелких (не крупнее милиарных) очагов уплотнения темно-красного цвета. Гистологически эти изменения характеризуются как катаральная, катарально-десквамативная мелкоочаговая пневмония без значительной выраженности геморрагического компонента.

Недопустимо наличие крупных сливных очагов экссудативной пневмонии, обширных геморрагических изменений, а также очагов некроза, абсцедирования, скопления микробов, гранулем, выраженных склеротических процессов.

5.8.2.5. В печени допустима умеренно выраженная неравномерная зернистая дистрофия с некробиозом отдельных печеночных клеток, иногда единичными мелкими очажками некробиоза и слабо выраженной клеточной инфильтрацией по ходу сосудов, а также умеренное венозное полнокровие. Недопустимы макро- и микроскопические признаки резко выраженной токсической (зернистой в сочетании с жировой) дистрофии, очаги некроза, множественные крупные очаги некробиоза, скопления микробов, крупные геморрагии и гнойные изменения.

5.8.2.6. Селезенка. В остром периоде вакцинальной реакции допустимо умеренное увеличение органа (не более чем в 1,5 - 2 раза), незначительное полнокровие. При дозе 10 ⁶ спор у отдельных животных при разрезе может наблюдаться небольшой соскоб пульпы селезенки с поверхности разреза. Гистологически допустимы умеренно выраженные явления острого инфекционного спленита, небольшая редукция мальпигиевых телец, а в более поздние сроки их гиперплазия. Сочетание дряблой консистенции, уменьшения размера на 1/3 и малокровия органа является неблагоприятным признаком, который характерен для погибших морских свинок. Гистологически при этом наблюдается резко выраженный спленит с некрозом и некробиозом в пульпе и резко выраженной редукцией мальпигиевых телец. Такие изменения допустимы лишь у единичных животных в дозе 10 ⁶ спор, но не при меньших дозах.

Недопустимы резкое увеличение селезенки с обильным соскобом пульпы с поверхности разреза, очаги некроза, крупные очаги некробиоза, гранулемы с некротическим центром, фокусы нагноения, скопления микробов, крупные очаги геморрагии в ткани и под капсулой.

5.8.2.7. Сердце. Наличие макроскопических изменений сердца и его оболочек (кровоизлияния под оболочки и пр.) недопустимо. При гистологическом исследовании при дозе 10 ⁶ спор и в меньшей мере при остальных дозах у животных может наблюдаться умеренно выраженная зернистая дистрофия миокарда, а также мелкие гистиоцитарные инфильтраты в интерстиции, эндокарде. Недопустимы значительные дистрофические изменения миокарда и крупные множественные воспалительные инфильтраты (интерстициальный миокардит).

5.8.2.8. Почки. Во всех дозах допустимо застойное полнокровие почек, небольшие единичные гистиоцитарные инфильтраты в интерстиции, умеренная неравномерная зернистая дистрофия эпителия извитых канальцев. Недопустимы резко выраженные дистрофические и некробиотические изменения канальцев (некротический нефроз), некрозы клубочков и выход эритроцитов в просвет капсулы (очаговый геморрагический нефрит).

5.8.2.9. Надпочечники. Макроскопически у части животных в остром периоде процесса при всех дозах может наблюдаться застойное полнокровие и незначительное увеличение размеров. Гистологически часто отмечается обеднение липоидами коры надпочечников, снижение феохромии клеток мозгового вещества. Эти изменения допустимы. Недопустимы резко выраженные дистрофические изменения, очаги некроза, скопления микробов.

5.8.2.10. Костный мозг. Допустимы застойное полнокровие венозных синусов и явления гиперплазии миэлоидной ткани, плазмоцитарная реакция. Недопустимы очаги некроза и гнойного расплавления, скопления микробов.

5.8.3. Морфологическая оценка безвредности испытуемых штаммов в опытах на кроликах.

5.8.3.1. Место введения. В остром периоде болезни через 1 сут. в подкожной клетчатке бедра развивается ограниченный воспалительный инфильтрат и локальное полнокровие вен. Макро- и микроскопически отмечается умеренное серозное пропитывание подкожной клетчатки, фасций и мышц, которые в последующие сроки приобретают серозно-геморрагический характер, и процесс может распространяться на паховую клетчатку этой же стороны тела. После 14 сут. у отдельных животных могут наблюдаться ограниченные небольшие абсцессы (до 1,5 - 2 см в диаметре), иногда осумкованные, изъязвления на коже, свищи, рубцовые процессы. Эти изменения являются допустимыми. Недопустимы бурно развивающийся обильный серозный или серозно-геморрагический воспалительный отек с обширным распространением на паховую область другой половины тела и брюшко, а также крупные очаги некроза и нагноения в клетчатке и подлежащих мышцах, массивные кровоизлияния. Гистологически недопустимо наличие обширных некрозов и плотных микробных скоплений среди них.

5.8.3.2. Регионарные лимфатические узлы. В паховых и подвздошных узлах со стороны места введения испытуемых культур могут наблюдаться увеличение и полнокровие. Особенно увеличиваются размеры подвздошных узлов (до 1 см в диаметре). У отдельных животных может наблюдаться небольшой серозный перитонит. Умеренное увеличение и уплотнение узлов может сохраняться в поздние сроки. Гистологически допустим умеренно выраженный серозный лимфаденит с небольшими геморрагическими проявлениями, в поздние сроки - гиперпластические процессы. Макро- и микроскопически недопустимы очаги некроза, нагноения, обширные скопления микробов в лимфатических узлах.

5.8.3.3. Отдаленные лимфатические узлы. После 7 сут., иногда в более ранние сроки отмечается некоторое увеличение и небольшое полнокровие отдаленных узлов. Гистологически преобладают гиперпластические процессы в лимфоидной ткани. У отдельных животных допустимы слабо выраженные явления очагового серозного лимфаденита с небольшими геморрагическими проявлениями в подвздошном лимфатическом узле на стороне места введения. Недопустим системный серозно-геморрагический лимфаденит (полиаденит) с поражением ряда групп отдаленных узлов. Гистологически недопустимы значительно выраженные серозно-геморрагический лимфаденит и периаденит.

5.8.3.4. Легкие. Постоянно наблюдается умеренное неравномерное полнокровие легких. В отдельных случаях могут отмечаться мелкопятнистые кровоизлияния под плеврой. Гистологически может быть умеренное полнокровие, неравномерная незначительная эмфизема, некоторое усиление фоновой интерстициальной реакции. Недопустимы макро- и микроскопические очаги экссудативной пневмонии, некрозы, гранулемы.

5.8.3.5. Печень. Макро- и микроскопически в остром периоде процесса постоянно отмечается полнокровие органа и признаки умеренно выраженной зернистой дистрофии. Гистологически допустимы признаки умеренной зернистой дистрофии, изредка - единичные мелкие очаги некробиоза. Недопустимы резко выраженные диффузные альтеративные изменения типа токсической дистрофии печени, очаги некроза и некробиоза, микробные скопления.

5.8.3.6. Селезенка. Допустимы умеренное полнокровие и небольшое увеличение органа. Гистологически в ранние сроки могут наблюдаться признаки слабовыраженного спленита с полнокровием и гиперплазией клеток красной пульпы, небольшой редукцией мальпигиевых телец. В более поздние сроки преобладают умеренно выраженные гиперпластические процессы клеток белой пульпы. Недопустимы резко выраженные явления инфекционного спленита с некробиозом и некрозом клеток пульпы, значительной редукцией мальпигиевых телец, микробными скоплениями, в поздние сроки - гранулемы.

5.8.3.7. Почки. Допустимы умеренное неравномерное полнокровие и зернистая дистрофия эпителия извитых канальцев. Недопустимы резко выраженные дистрофические и некробиотические изменения эпителия извитых канальцев и капиллярных петель клубочков почек.

5.8.3.8. Надпочечники. Макроскопически не изменены. Гистологически допустимы неравномерное полнокровие, некоторое обеднение липоидами клеток коры и снижение феохромии клеток мозгового вещества. Недопустимы резко выраженные дистрофические изменения, очаги некроза, микробные скопления.

5.8.3.9. Сердце. Допустимы неравномерное полнокровие вен миокарда и небольшая или умеренно выраженная зернистая дистрофия волокон миокарда в остром периоде процесса, мелкие тистиоцитарные инфильтраты по ходу сосудов и в интерстиции. Недопустимы значительно выраженные дистрофические и воспалительные изменения.

5.8.4. Оценка безвредности испытуемых штаммов по морфологическим признакам на овцах и козах.

5.8.4.1. Место введения. Макроскопически отмечается ограниченный подвижный инфильтрат в подкожной клетчатке с небольшой припухлостью кожи несколько уплотняющийся к 3 - 5-м суткам после введения культур. Фокусы воспалительной реакции довольно быстро рассасываются, но могут сохраняться до 7 сут. в виде небольшой припухлости. Гистологически наблюдаются ограниченные участки серозного пропитывания дермы и подкожной клетчатки, полнокровие сосудов, в более поздние сроки - небольшие рубцовые изменения, очаговые инфильтраты по ходу сосудов. Недопустимы крупные плотные воспалительные инфильтраты без склонности к резорбции, очаги некроза и нагноения, крупные геморрагии, скопления микробов.

5.8.4.2. Регионарные лимфатические узлы. Допустимо умеренное увеличение, набухание, полнокровие узлов в течение 7 сут. Гистологически отмечаются явления серозного лимфаденита без значительных геморрагии и очагов некроза. Недопустимы изменения, характерные для типичных лимфаденитов с выраженным периаденитом, значительные геморрагические изменения, некрозы, скопления микробов.

5.8.4.3. Отдаленные лимфатические узлы и внутренние органы.

Допустимы изменения кровенаполнения, связанные с умерщвлением животных, некоторое увеличение лимфатических узлов. Другие макроскопические изменения, имеющие отношение к введению испытуемых штаммов, недопустимы. Гистологически допустимые процессы гиперплазии лимфоретикулярных элементов во внутренних органах.

Недопустимо наличие выраженных дистрофических и воспалительных изменений.

6. Определение влияния штамма на иммунную систему

Цель проведения испытания заключается в выявлении возможных иммунологических нарушений в организме после введения культуры исследуемого штамма. Нарушения иммунной системы могут приводить к развитию вторичного иммунодефицита, быть причиной изменений иммуногенной реактивности организма на другие неродственные антигены, лежать в основе неполноценного специфического ответа на сам штамм. Методы определения действия вакцинного штамма на иммунную систему приведены в прилож. 3.

6.1. Испытуемый штамм сибиреязвенного микроба в дозе 1|10 ⁶ спор в объеме 1 мл при подкожном введении кроликам не должен оказывать повреждающее действие на иммунную систему: должен вызывать умеренное повышение количества лимфоцитов, находящихся в S + d + М фазах клеточного цикла, статистически не отличающиеся от показателя наблюдаемого для вакцинного штамма СТИ-1.

6.2. Введение в макроорганизм митогена или антигена индуцирует пролиферацию лимфоцитов, т.е. деление этих клеток. Предполагается прямая зависимость между степенью выраженности специфической трансформации лимфоцитов в условиях in vitro (показатель РБТЛ) и специфического клеточного иммунного ответа организма на данный антиген. Индекс стимуляции реакции бласттрансформации лимфоцитов (ИС РБТЛ) для испытуемого штамма должен быть в 1,5 - 2 раза выше с лимфоцитами кроликов, иммунизированных 1·10 ⁶ спор, чем для интактных лимфоцитов под воздействием неспецифических митогенов и ЛПС сибиреязвенного микроба. Уровень стимуляции РБТЛ для испытуемого штамма не должен быть статистически значимо ниже ИС РБТЛ для вакцинного штамма СТИ-1.

6.3. Цитотоксический индекс (ЦТИ) у кроликов, привитых подкожно 1·10 ⁶ спор испытуемого штамма, не должен быть ниже показателя ЦТИ, чем у привитых эталонным вакцинным штаммом СТИ-1.

6.4. Макрофаги кроликов, привитых подкожно 1·10 ⁶ спор испытуемого штамма, не должны иметь более низкие показатели процента фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарного числа (ФЧ), определяемого количеством фагоцитированных микробов на один фагоцит, а также абсолютного фагоцитарного показателя (АФП), чем у привитых этой же дозой эталонного вакцинного штамма СТИ-1.

6.5. Испытуемый вакцинный штамм сибиреязвенного микроба в дозе 1·10 ⁶ спор не должен подавлять развитие клеточного иммунитета (по реакции гиперчувствительности замедленного типа) и гуморального (по уровню титров антител) иммунного статуса у белых мышей на гетерологичный антиген. Допускается минимальное снижение иммунного ответа, но не больше чем при введении в этой дозе эталонного вакцинного штамма СТИ-1. Методика определения приведена в п. 6 прилож. 3.

7. Стабильность биологических свойств вакцинного штамма

Стабильность испытуемого штамма, в первую очередь по безвредности и утрате патогенности, свойственной сибирской язве, оценивают по результатам многократных пассажей на питательных средах, способствующих капсулообразованию сибиреязвенных бацилл, а также в опытах на морских свинках и белых мышах. Методика определения стабильности биологических свойств вакцинного штамма сибиреязвенного микроба приведена в прилож. 4.

7.1. Двадцатикратные пересевы вакцинного штамма на питательной среде ПСИ, а также 10-кратные пассажи через организм белых мышей и морских свинок не должны приводить к появлению даже единичных капсульных бацилл. Штамм должен соответствовать п. 4.7 настоящих МУ.

7.2. Десятикратные пассажи вакцинного штамма через организм белых и черных мышей и морских свинок не должны приводить к реверсии его вирулентности. Степень остаточной вирулентности пропассированного испытуемого штамма, как и эталонного вакцинного должна соответствовать п. 5.2 для мышей, п. 5.3 - 5.5 - для морских свинок и п. 5.6 - для кроликов.

8. Иммуногенность испытуемого штамма в опытах на лабораторных животных и овцах

Методы определения иммуногенности сибиреязвенных вакцинных штаммов оценивают в опытах на морских свинках, кроликах и овцах, приведены в прилож. 5.

8.1. Индекс иммунитета испытуемого штамма для морских свинок, иммунизированных дозой 5·10 ⁷ спор, должен быть не менее индекса для эталонного вакцинного штамма сибиреязвенного микроба СТИ-1, который для этого штамма должен быть не менее 10000 при заражении иммунизированных свинок сибиреязвенным микробом 71/12.

8.2. Выживаемость кроликов, иммунизированных 5·10 ⁷ спор испытуемой культуры, должна быть не ниже выживаемости животных, привитых этой же дозой эталонного вакцинного штамма сибиреязвенного микроба СТИ-1. Не менее 5 из 10 вакцинированных кроликов должны выжить после заражения 50 LDso вирулентной споровой культуры В. anthracis при гибели от специфической инфекции в первые 2 - 3 сут. всех контрольных животных.

8.3. Величина ЕДзд испытуемого штамма сибиреязвенного микроба для кроликов при заражении 10 Del (безусловно смертельными дозами) должна быть не больше такой же величины эталонного вакцинного штамма СТИ-1 в одном опыте.

8.4. Овцы, вакцинированные 1-1,5·10 ⁷ спор должны выжить после заражения 10 Del вирулентного штамма возбудителя сибирской язвы. В течение первой недели у них может наблюдаться повышение температуры тела, но не более чем на 1 °С.

9. Испытание стабильности штамма в производственных условиях

9.1. Испытуемые штаммы, удовлетворяющие по всем перечисленным свойствам (безвредность, реактогенность для лабораторных животных, иммуногенность и т.д.) требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба, следует испытать на стабильность свойств в производственных условиях.

9.2. Вакцинные штаммы сибиреязвенного микроба не должны изменять свои культурально-морфологические, биохимические и иммуногенные свойства при производственном (масштабированном) культивировании; должны давать в производственных условиях изготовления необходимое накопление споровой массы с жизнеспособностью не менее 90 %, стабильность суспензии.

9.3. Контроль 3 первых серий сибиреязвенной живой сухой вакцины, приготовленной из этих штаммов, проводят в соответствии с фармакопейной статьей на коммерческую вакцину сибиреязвенную живую сухую, новая вакцина должна удовлетворять требованиям, предъявляемым к коммерческой вакцине.

10. Испытание на людях сибиреязвенной живой сухой вакцины

10.1. Для возбуждения ходатайства об испытании вакцины на добровольцах необходимо: обсудить на Ученом совете НИИ отчет о государственных доклинических испытаниях штамма, результаты авторских лабораторных испытаний и контроля трех экспериментальных серий сибиреязвенной живой вакцины, приготовленной из нового штамма, проект программы ограниченных испытаний; представить в комитет МИБП отчеты о авторских и государственных доклинических испытаниях штамма, а в ГИСК им. Л.А. Тарасевича - три первых экспериментальных серии препарата из нового штамма.

10.2. Разрешение на ограниченные государственные испытания на добровольцах вакцины из нового вакцинного штамма сибиреязвенного микроба дает Министерство здравоохранения Российской Федерации после получения решения комитета МИБП о рекомендации этих испытаний.

10.3. Введение сибиреязвенных живых вакцин из испытуемого и контрольного штаммов для людей проводят согласно инструкции по применению коммерческой сибиреязвенной живой вакцины. Контролем должны служить такие же группы людей, привитых плацебо (среда высушивания сибиреязвенной вакцины, разведенная физиологическим раствором до такой же степени, как контрольная и испытуемая вакцины).

10.4. Группы вакцинированных комплектуются методом случайной выборки, являются равноценными по возрасту, полу, трудовой деятельности и т.д. Испытание подкожного метода вакцинации проводят после окончания срока наблюдений за привитыми накожным методом. У привитых учитывается безвредность и реактогенность по клиническим наблюдениям, биохимическим и серологическим реакциям и по аллергической перестройке.

10.5. Признание испытуемого штамма сибиреязвенного микроба в качестве вакцинного оформляется приказом Министра здравоохранения РФ на основании заключений Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских иммунобиологических препаратов им. Л.А. Тарасевича и решения Комитета медицинских иммунобиологических препаратов.

10.6. Дальнейшие этапы внедрения вакцины сибиреязвенной живой осуществляют в соответствии с санитарными правилами СП 3.3.2.561-96, 3.3.2. "Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов".