Приложение 4. Определение стабильности свойств вакцинного штамма сибиреязвенного микроба

Приложение 4

Определение
стабильности свойств вакцинного штамма сибиреязвенного микроба

1. Испытуемую и эталонную культуры засевают в 3 пробирки под резиновыми пробками со средой ГКИ. Через 16 - 18 ч инкубации при температуре 37 °C делают пересев на 3 пробирки с такой же средой. Таких пересевов делают не менее 20 раз. При каждом пассаже делают мазки из культуры, фиксируют их метиловым спиртом с 10 % формалина и окрашивают метиленовым синим по Леффлеру в течение часа. При микроскопии не менее 5 мазков из культур каждого пассажа не должны обнаруживаться даже единичные капсульные бациллы. После проведения 20 пассажей, при отсутствии капсулообразования в этих условиях, пассированную культуру изучают более детально. Ее высевают на чашку Петри со средой Шефера или 1 %-ный бикарбонатный агар и инкубируют 48 ч при температуре 37 °C в атмосфере с повышенным содержанием CO ₂ (10 - 50 %). После 48-часовой инкубации просматривают характер выросших колоний (см. п. 4.7.2). В мазках из колоний не должно быть даже единичных капсульных бацилл. После 20-кратного пассирования культур на среде ГКИ проверяют их остаточную вирулентность для белых и черных мышей в соответствии с прилож. 2, она должна соответствовать п. 5.2.

2. Испытуемую культуру пассируют 10 раз на белых мышах массой 16 - 18 г с предварительным введением кортизона для повышения чувствительности животных к испытуемой культуре. Для этого пяти белым мышам вводят подкожно кортизон в дозе по 5 мг, а через 3 ч - внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл испытуемую культуру с концентрацией бактериальной взвеси 10 единиц по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Погибших или умерщвленных через 2 сут. мышей вскрывают, делают посевы из селезенки, печени и крови. Посевы инкубируют при температуре 37 °C одни сутки. Из выросших, типичных для штамма колоний готовят взвесь в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия, которую вводят новой группе белых мышей. Таких пассажей на мышах проводят не менее 10. При каждом пассаже контролируют отсутствие в мазках из органов даже единичных капсульных бацилл. После завершения 10 пассажей на мышах, подвергнутых действию кортизона, пассированную культуру испытуемого штамма проверяют высевом в среду ГКИ (отсутствие капсулообразования), на остаточную вирулентность для мышей (п. 5.2) и на безвредность для морских свинок (п. 5.3 - 5.5) и кроликов (п. 5.6).

3. Для пассажа испытуемого штамма на морских свинках в опыт берут молодых животных массой 150 - 200 г; 2 - 3 животным испытуемую культуру вводят подкожно в дозе 10 ⁸ микробов в 1 мл (10 единиц по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Через 2 сут. морских свинок умерщвляют, делают посевы из места введения и ткани селезенки на агар Хоттингера (аминный азот 200 - 250 мг %). Выросшую культуру суспендируют в 0,9 %-ном растворе хлористого натрия и далее ведут пассажи на морских свинках аналогично пассажам на белых мышах, но без применения кортизона. При вакцинном штамме пассажи часто прерываются из-за того, что культура от забитых животных не выделяется. В случае невыделения культуры испытуемого штамма после 3-кратного повторения предыдущего пассажа, опыты прекращают и считают, что штамм стабилен в организме морских свинок, не реверсирует в вирулентное состояние. В случае завершения пассажей, культуру 10-го пассажа проверяют на отсутствие капсулообразования на среде ГКИ (п. 6.1), на остаточную вирулентность для мышей (п. 3.3) и безвредность для морских свинок и кроликов (п. 3.4 и п. 3.5).