Приложение 3. Методы определения влияния вакцинного штамма чумного микроба на иммунную систему морских свинок

Приложение 3

Методы определения влияния вакцинного штамма чумного микроба на иммунную систему морских свинок

1. Для изучения пролиферации и численности популяций лимфоцитов морских свинок иммунизируют однократно 1·10 ⁵ м. к. односуточной агаровой культурой испытуемого штамма и вакцинного штамма EV. Для проведения исследований по нижеперечисленным тестам испытуемую культуру каждого штамма вводят 10 животным.

Одновременно 10 морским свинкам вводят плацебо - 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

Группы животных формируются методом случайной выборки равнозначных по полу и массе.

2. Выделение лимфоцитов из крови морских свинок.

Кровь у морских свинок берут из сердца в объеме 2 мл в пробирку со средой 199 или раствором Хенкса с (250,5) ед/мл гепарина в соотношении 1 часть крови и 3 части среды. После перемешивания разведенную кровь наливают в пробирку на водный раствор верографина плотностью в (1,080,002) г/мл в соотношении 2:1, центрифугируют (151) мин при (45025) g, затем пастеровской пипеткой собирают образовавшееся над слоем верографина беловатое кольцо лимфоцитов. Количество Т- и В-лимфоцитов определяют одним из приведенных ниже методов.

3. Получение взвеси клеток селезенки и тимуса.

Морских свинок умерщвляют с помощью хлороформа. Извлекают селезенку и тимус и помещают их в гомогенизаторы. Осторожным раздавливанием приготовляют взвесь клеток из расчета 1 мл среды 199 на 50 мг ткани селезенки или тимуса. Полученную суспензию фильтруют через 2 слоя капронового фильтра, дважды отмывают средой 199 путем центрифугирования при (45025) g в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют.

4. Определение пролиферативной активности лимфоцитов.

4.1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Используют для оценки функциональной активности лимфоцитов.

4.1.1. Культуры спленоцитов, тимоцитов и лимфоцитов, выделенных из крови иммунных и контрольных животных, доводят до концентрации 5·10 ⁶ к./мл средой культивирования, состоящей из среды RPMI 1640, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глутамина, 5 х 10 5 М 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Суспензию клеток разливают в 96-луночную пластиковую панель по 0,2 мл в лунку (по три лунки на каждый образец). В опытные пробы для стимуляции лимфоцитов в качестве неспецифических митогенов вносят по 10 - 15 мкг/мл ФГА или KOH-A в концентрации 1 - 15 мкг/мл. В качестве специфического антигена вносят по 100 мкг/мл ультразвуковых дезинтегрантов (УЗД) Y. pestis (соответственно испытуемого и контрольного штаммов в концентрации 2,5|10 ⁸ и 2,5·10 ⁹ м. к./мл).

4.1.2. УЗД получают путем трехкратного воздействия ультразвуком 44 кГц в течение 1 мин взвеси испытуемого и контрольного штаммов в 0,9 %-ом растворе хлорида натрия. Контролем служат культуры без добавления митогенов и антигенов. Инкубацию проводят в СОг-инкубаторе (5 % СОг) при температуре (372) °С в течение 72 ч. Затем в лунки добавляют 3Н-тимидин в объеме 25 мкг (1 - 2 мкКи) в среде RPMI - 1640 на лунку и инкубируют в тех же условиях еще 24 ч. По окончании инкубации клетки переносят на фильтры с помощью прибора "Cell Harwestr", фильтры после сушки в термостате при температуре (372) °С помещают во флаконы, содержащие по 3 мл толуольного сцинтиллятора (на 1 мл толуола 0,2 г РОРОР и 5 г РРО). Радиоактивность (имп/мин) образцов измеряют с помощью В-счетчика. Учет реакции можно проводить визуально, определяя процент бластных форм лимфоцитов. Интенсивность РБТЛ выражают в индексах стимуляции (ИС) РБТЛ, которые подсчитывают по формуле:

4.2. Определение пролиферативной активности лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии.

Принцип метода основан на вторичной флуоресценции, которая возникает в результате окрашивания ДНК лимфоцитов иммунных и контрольных животных специфическим флуорохромом и измерением ее содержания в лимфоцитах в различных фазах клеточного деления.

4.2.1. Приготовление растворов флуорохромов.

Раствор А. Готовят 0,0025 %-ный раствор этидиум бромида в 0,1 М растворе трис-буфера pH 7,4, содержащем 0,6 % хлорида натрия. Величина pH 7,4 достигается добавлением 1 н раствора хлористого натрия.

Раствор Б. Готовят 0,005 %-ный раствор митрамицина в 12,5 %-ном растворе этилового спирта, содержащем 7,5 мМ хлористого магния 6-водного. Величина pH 5,5 достигается добавлением 0,01 н раствора хлорида натрия. Приготовленные растворы хранят при температуре (42) °С не более месяца.

4.2.2. Фиксация лимфоцитов.

Полученные клеточные суспензии с концентрацией 10 ⁶ лимфоцитов в 1 мл фиксируют путем добавления (701)° этилового спирта (использование другого фиксатора недопустимо), охлажденного до (42) °С, из расчета 4,5 мл на 0,5 мл клеточной суспензии, выделенной от вакцинированных испытуемым и контрольным штаммами животных. Смеси перемешивают на вибрационной мешалке, выдерживают при температуре (42) °С не менее 30 мин. Фиксированные клетки можно хранить при температуре (42) °С до 10 сут.

4.2.3. Окраска ДНК лимфоцитов флуорохромами.

Фиксированные этиловым спиртом лимфоциты (5 мл) осаждают путем центрифугирования на центрифуге в течение (31) мин при (100025) g, удаляют надосадочную жидкость. Затем к осадку добавляют 0,5 мл раствора флуорохрома А, перемешивают на вибрационной мешалке 30 - 40 с и выдерживают при температуре (222) °С 10 мин. К смеси лимфоцитов и флуорохрома А добавляют 0,5 мл флуорохрома Б, также перемешивают и выдерживают при температуре (222) °С 5 мин. Пробирки необходимо закрывать парафиновыми бумажками. После окраски суспензии лимфоциты готовы к анализу на приборе и должны быть использованы в течение 2 ч.

4.2.4. Подготовка окрашенных клеток к исследованию. Суспензии окрашенных лимфоцитов в пробирках помещают в ультразвуковую ванну и подвергают обработке 15 с для разрушения агломератов, образовавшихся при центрифугировании, затем фильтруют через фильтры с размером пор от 45 до 50 мкм.

Процентное соотношение лимфоцитов в фазах клеточного деления регистрируют с помощью проточного цитофлуориметра PHY WE JCPP 22 или другой марки.

Определение процентного соотношения пролиферирующих (фазы S и G2 + М) и непролиферирующих (фазы Go/Gi) лимфоцитов проводят путем расчета гистограмм, высвечивающихся в процессе эксперимента на экране дисплея многоканального анализатора импульсов с помощью математической модели.

Общее количество клеток, зарегистрированное анализатором, определяется суммарным количеством клеток, набранных в каждом из каналов:

В свою очередь количество клеток в фазах клеточного цикла Go/Gi, S и G2 + М определяется площадью, ограниченной соответствующей кривой.

Количество клеток в S-фазе определяется площадью трапеции и может быть вычислено путем умножения основания этой трапеции на высоту:

Рис. 1. Условные обозначения: N - количество сигналов (клеток); X - количество ДНК в относительных единицах (каналах), выражается через интенсивность флуоресценции, а затем через амплитуду электрического импульсного сигнала, на выходе ФЭУ; соответственно амплитуде сигнала ставят определенный канал анализатора импульсов, сигнал отсчитывается анализатором; X ₁ - номер произвольного канала до начала распределения (выбирается одинаково для опытной и контрольной пробы); Х ₂ - номер канала максимума пика Go/Gi, определяется на гистограмме при помощи светящейся метки (курсора) и корректируется, исходя из значения коэффициента вариации гауссовского распределения Go/Gi; Х ₃ - номер канала по середине S-фазы, Х ₄ - номер канала максимума пика G2 + М.

Эти клетки содержат количество ДНК вдвое больше, чем диплоидные, поэтому Х4 = 2X2; Xs - номер произвольного канала после распределения (выбирается одинаково в опыте и контроле).

Поскольку в различных точках S-фазы регистрируется неодинаковое число клеток, необходимо заменить число N (Х ₃) на усредненную величину по нескольким каналам (К) и выбрать К равным от 10 до 20, тогда

Поскольку распределения Go/Gi и S перекрываются, число клеток в фазе Go/Gi может быть определено путем вычитания половины площади, занятой фазой S, из общей площади до канала Х ₃.

Количество клеток в фазах G ₂ + М определяется так:

Процент клеток в фазах 5, С, + Ми G/G _i определяют путем деления соответствующих площадей на общую площадь гистограммы и умножения на 100 %

Все операции расчета сводятся к определению с помощью курсора номера каналов Xi, Х2, Х ₃, Х ₃-К/2, Х ₃+К/2, Xs и вычислению с помощью этого же курсора ограниченных ими площадей:

Для этого не требуется длительного суммирования значительного числа клеток в каждом из каналов. Достаточно последовательно поместить курсор в начальную и конечную точки гистограммы, ограничивающие требуемый участок, и нажатием специальной кнопки, указанной в инструкции к любому анализатору, определить площадь этого участка.

5. Определение количества Т- и В-лимфоцитов цитотоксическим тестом.

5.1. Цитотоксический тест - это иммунологическая реакция, позволяющая выявить антигены, расположенные на поверхности жизнеспособных лимфоцитов. Основной принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целостность клеточной мембраны. Трипановый синий, проникая внутрь клетки, окрашивает ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не окрашиваются.

5.1.1. Определение количества Т-лимфоцитов.

Коммерческую поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов (институт им. Г.Н. Габричевского) разводят средой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в лунке панели смешать 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов (концентрация 10 ⁷ кл/мл) и 20 мкл комплемента кролика в разведении 1:3. В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 10 ⁷ кл/мл), 20 мкл взвеси комплемента и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в термостате при температуре (372) °C 25 - 30 мин. В каждую пробирку или лунку добавить по 1200 мкл 0,5 %-ного раствора трипанового синего (500 мг красителя растворить в 100 мл горячего (80 - 90 °C) 0,9 %-ного раствора хлорида натрия; перемешать 10 мин на магнитной мешалке и профильтровать через фильтровальную бумагу). Через 30 - 60 с поместить взвесь из лунки в счетную камеру. Определяют число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества клеток в препарате, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:

ЦТИ указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции.

5.1.2. Определение количества В-лимфоцитов.

Общее количество В-лимфоцитов определяют в цитотоксическом тесте с коммерческой поликлональной специфической сывороткой против В-лимфоцитов мыши. Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с анти-Т-сывороткой.

6. Определение фагоцитарной активности макрофагов.

Фагоцитарную активность определяют по проценту фагоцитирующих клеток и количеству захваченных частиц на один фагоцит.

Внутрибрюшинно уколом по средней линии живота морской свинке вводят 20 мл среды 199 с гепарином (10 ед/мл). Брюшко массируют для смыва клеток, не вынимая иглы, и экссудат отсасывают шприцем.

Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) берут асептически от морских свинок опытной и контрольной групп и помещают в 5 мл среды 199, содержащей 5 ME гепарина в 1 мл, в пробирки, стоящие на льду. Не используют экссудаты, содержащие эритроциты. После осаждения центрифугированием (при 150 g, в течение 10 мин) клетки ресуспендируют в 5 мл среды 199 с 10 % сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Концентрацию клеток доводят до 1-2·10 ⁶ клеток/мл и суспензию разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат с температурой 37 °C с содержанием 5 % СОг. Через 60 мин суспензию сливают, смывают с чашки Петри неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды 199 и оставляют на 18 - 24 ч в термостате с 5 - 7 % СОг при температуре 37 °C. Клетки для исследования фагоцитоза можно получить также на покровных стеклах, помещенных в пробирки с 1,5 - 2 мл КЭП.

Объектом фагоцитоза служат эритроциты барана, Y. pestis EV. Суточную культуру живых Y. pestis EV отмывают не менее 3-х раз 0,9 %-ным раствором хлорида натрия, осаждают путем центрифугирования на центрифуге при 150 g в течение 5 мин, ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии по стандарту оптической мутности. Взвесь разводят средой 199 до концентрации 1·10 ¹⁰ м. к./мл. Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмывают 0,9 %-ным раствором хлорида натрия, осаждают путем центрифугирования на центрифуге при 150 g в течение 5 мин. Готовят 0,5 %-ную взвесь ЭБ на среде 199. В чашки Петри, содержащие КПЭ, наливают 1 мл свежей среды 199 и вносят по 1 мл взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов. Через 30 - 60 мин чашки ополаскивают холодным раствором Хенкса, просушивают и фиксируют 10 мин метанолом. Окрашивают азур-эозином по Романовскому. Просматривают не менее 200 клеток, подсчитывают фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.

Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ПФ), фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством частиц на один фагоцит, абсолютным фагоцитарным показателем (АФП) - суммарным показателем активности полиморфноядерных лейкоцитов, которое рассчитывают по формуле:

АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл крови х ФЧ

Пример:

а) Общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови - 500, содержание полиморфноядерных лейкоцитов - 60 %, ПФ - 80 %, ФЧ - 5.

б) полиморфноядерных лейкоцитов 300 - 100 %, фагоцитирующих (ПФ) - 80 %, т.е. количество фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитов = 300.

в) АФП=240·5=1200

7. Определение влияния вакцинного штамма на развитие клеточного и гуморального иммунного ответа на гетерологичный антиген.

7.1. Определение влияния вакцинного штамма на развитие клеточного иммунного ответа на гетерологичный антиген по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ).

Мышей разделить на три группы. Мышей первой группы иммунизировать исследуемой вакциной, мыши второй группы - интактные (положительный контроль), мыши третьей группы - интактные с введением только разрешающей дозы ЭБ (контроль). Мышам 1-ой и 2-ой групп вводят ЭБ без адьюванта Фрейнда в дозе 10 ⁷ кл/на мышь в объеме 0,1 мл в межлопаточную область подкожно, параллельно внутрибрюшинно (возможны и другие способы введения - перорально, внутривенно, подкожно) ввести исследуемую вакцину. Разрешающую дозу ЭБ ( 10 ⁸ кл/на мышь) ввести на 5-й день в объеме 0,02 мл в подушечку задней лапы, в контрлатеральную - 0,9 % раствор хлорида натрия всем трем группам животных.

Учет результатов - местную реакцию на введение разрешающей дозы ЭБ оценивать через 18 - 20 ч путем определения веса опытной (Ро) и контрольных (Рк) лапок. Интенсивность местной реакции определяют по индексу (ИР), рассчитываемой по формуле:

Оценка результатов. Значение ИР в опытной (1-ой) группе выше двух его значений в положительном контроле (2-я группа) следует оценивать как выраженный иммуностимулирующий эффект вакцины. При значении ИР равного контролю (3-я группа) или менее положительного контроля - как выраженный иммуносупрессирующий эффект вакцинации.

7.2. Влияние вакцинного штамма на развитие гуморального ответа на гетерологичный антиген.

Определение поликлональной активности В-лимфоцитов.

Для оценки этого показателя определяют число клеток, продуцирующих антитела к эритроцитам барана (АОК). Необходимо подчеркнуть, что иммунизация мышей эритроцитами барана в этих опытах не производится, а определяется количество спонтанных "фоновых" АОК в селезенке. Увеличение их количества после введения вакцины является показателем поликлональной активации В-лимфоцитов. Число АОК в селезенке определяют методом локального гемолиза в геле.

7.2.1. Выявление антителообразующих клеток методом локального гемолиза в геле.

Эритроциты барана отмыть 0,9 %-ным раствором хлорида натрия путем центрифугирования 7 мин при 400 g 3 раза, к 0,9 %-ному раствору агарозы ^* добавить из расчета 2-3·10 ⁷ эритроцитов барана в 1 мл. Полученную рабочую смесь разлить по 2,5 мл в пробирки, помещенные в водяную баню при температуре 43 - 44 °C. В каждую пробирку добавить по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток селезенки (концентрация 10 ⁷ кл/мл), перемешать и вылить на чашку Петри, равномерно распределяя ее по дну. Через 5 мин чашки поместить в термостат при температуре (372) °C на 1 час. Затем в каждую чашку вылить по 2,5 мл разведенного в 5 раз средой 199 комплемента морской свинки сухого или разведенного в 10 раз свежезамороженного комплемента. После 30 мин инкубации подсчитать число зон гемолиза на каждой чашке.

Учет результатов. Рассчитать число антителообразующих клеток на селезенку и на 1 млн ядросодержащих клеток (ЯСК) селезенки. Пример результатов опыта этого типа представлен в таблице:

N группы	Вакцинация	Срок после вакцинации (сут)	Число АОК на селезенку	Р	Индекс поликлональной стимуляции
1	(контр)	-	12024	-	1
2	+	3	19839	0,05	1,65
3	+	7	24636	0,05	2,05
4	+	10	15440	0,05	1,28
5	+	15	10527	0,05	0,87
6	+	20	11617	0,05	0,96

Оценка результатов.

В этом опыте обнаружено на 3 - 7 день после прививки выраженное стимулирующее действие вакцины на функциональное состояние В-лимфоцитов.

Кол-во чашек	Масса агарозы	Объем дистиллированной воды	Объем 10-кратного раствора Хенкса
10	225 мг	22,5 мл	2,5 мл

7.2.2. Определение функциональной активности регуляторных Т-лимфоцитов.

Метод оценки активности Т-супрессоров и Т-хелперов основан на исследовании их способности соответственно угнетать или стимулировать in vitro зрелые клетки, продуцирующие антитела к эритроцитам барана.

Тест-объектом служат клетки селезенки от 3 мышей, иммунизированных внутривенно эритроцитами барана (2x10 ⁸ клеток на мышь). Для иммунизации необходимо использовать сингенных мышей, иммунизированных испытуемым и контрольным штаммами.

Иммунизированных ЭБ мышей убить хлороформом, из их селезенок приготовить общую клеточную взвесь (концентрация 10 ⁷ кл/мл) по описанному выше методу (п. 2.2). Клетки отмыть 1 раз средой 199 путем центрифугирования в течение 7 мин, при 400 g. Довести концентрацию до 10 ⁷ кл/мл, 0,2 мл этой взвеси смешать в центрифужной пробирке с 0,2 мл взвеси спленоцитов той же концентрации от иммунизированных испытуемой вакциной животных. В контрольной пробирке к 0,2 мл первой взвеси добавить 0,2 мл среды 199. Все пробирки инкубировать в течение 30 мин при температуре (37 + 2) °С, затем их центрифугировать 7 мин при 400 g. Надосадок слить, в каждую пробирку добавить по 2,5 мл рабочей смеси агарозы с эритроцитами барана (см. п. 2.8). Содержимое пробирки перемешать осторожным встряхиванием и немедленно вылить в чашку Петри, равномерно распределяя смесь по дну. Чашку оставить при температуре 18 - 20 °С на 5 мин, затем инкубировать 90 мин при температуре (372) °C. Далее в каждую чашку налить по 2,5 мл разведенного комплемента морской свинки (сухой комплемент разводят средой 199 в 5 раз, свежезамороженный - в 10 раз) и продолжить инкубацию при температуре (372) °C еще в течение 30 мин, после чего в проходящем электрическом свете подсчитать число зон гемолиза в каждой чашке. Учет результатов. Подсчитать индекс эффективности (ИЭ) по формуле:

Пример результатов опытов этого типа представлен в таблице:

N опыта	Число АОК на чашку		Р	Индекс эффективности
	В контроле	В опыте
1	148 + 36	81 + 30	<0,05	0,55
2	13240	18624	<0,05	1,41

Оценка результатов.

В эксперименте N 1 число АОК на чашку в опыте было меньше, чем в контроле; индекс эффективности составил 0,55, что указывает на высокую активность Т-супрессоров в исследуемой селезенке. В эксперименте N 2 число АОК в опыте было больше, чем в контроле; индекс эффективности составил 1,41. Это указывает на повышенную активность Т-хелперов в исследуемой селезенке.

7.2.3. Исследование влияния испытуемого штамма на иммунореактивность - развитие гуморального иммунного ответа на гетерологичный антиген.

Определение АОК к эритроцитам барана (ЭБ) гетерологичному Т-зависимому антигену.

Для проведения этих экспериментов мышей разделить на 2 группы по 10 штук в каждой. Мыши 1-ой группы иммунизированы изучаемым вакцинным препаратом, мыши 2-ой группы интактные (контрольные). Мышам обеих групп ввести внутривенно по 2|10 ⁷ эритроцитов барана. Иммунный ответ на гетерологичный антиген оценивать через 4 суток после введения эритроцитов. Методика определения числа АОК - см. п. 2.8.

Учет результатов.

Пример анализа результатов опыта приведен в таблице:

Группы мышей	Число АОК на селезенку к эритроцитам барана
1	1568026 + 70 *
2	244004390

------------------------------

^*_{отличие значимо (р<0,05)}

------------------------------

Оценка результатов.

Приведенные в таблице результаты показывают, что у вакцинированных животных иммунный ответ на гетерологичный антиген угнетен. Это является признаком временного иммунодефицита, обусловленного увеличением количества и функциональной активности Т-супрессоров и (или) снижением количества и функциональной активности Т-хелперов.