Приложение 1. Микробиологические методы изучения свойств сибиреязвенного микроба

Приложение 1

Микробиологические методы изучения свойств сибиреязвенного микроба

1. Состав среды Гладстона-Фильда (80 - 100 мг % аминного азота):	на 1 л
1. Триптический перевар казеина	50 мл
2. Водный экстракт дрожжей (пивные дрожжи)	200 мл
3. Сернокислое железо Fe 2(SO 4) 3 9Н 2О	0,01 г
4. Сернокислая магнезия (MgSO 4 7Н 2О)	0,05 г
5. Сернокислый марганец (MnSO 4 7Н 2О)	0,03 г
6. Хлористый кальций (CaCl 2)	0,1 г
7. Сернокислый натрий (Na 2SO 4)	0,3 г
8. Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH 2PO 4)	1,0 г
9. Калий фосфорнокислый двузамещенный (K 2HPO 4)	5,0 г
10. Агар-агар	30,0 г

Взамен дрожжевого экстракта можно использовать 0,5 %-ный раствор дрожжей "Бакто". Цифры со 2 до 9 последовательность растворения. Натрий фосфорнокислый не следует использовать взамен солей калия. Среду с помощью фосфатного буфера доводят до рН 7,2.

2. Определение концентрации и живых спор в изучаемых культурах В. anthracis.

Концентрацию спор в вакцинной культуре определяют подсчетом в счетной камере Горяева с глубиной 0,1 мл. Исследуемую взвесь спор разводят последовательно десятикратно дистиллированной водой до исчезновения в последней пробирке отчетливо видимой мутности. Взвесью спор из этой пробирки заполняют камеру Горяева по ТУ 64-1-816-77 и через 5 - 10 мин под микроскопом с фазово-контрастным устройством (объектив х 40, окуляр х 7) подсчитывают споры в 10 больших квадратах сетки.

Концентрацию спор в 1 мл (N) исследуемой взвеси вакцинной культуры определяют по формуле:

N=2,5·10 ⁴·n·p, где

p - кратность разведения исследуемого спорового материала;

n - среднее количество спор в одном большом квадрате.

Пример расчета:

Исходная взвесь спор разведена в 1000 раз, n - 40 спорам; отсюда N=2,5·10 ⁴·40·10 ³=10 ¹⁰ спор в 1 мл.

Для повышения точности исследования необходимо пользоваться средними результатами пяти подсчетов, произведенных указанным способом.

Количество живых спор определяют с помощью микрокультуры и высевом на агаровые пластины. На тонкий слой агара по Хоттингеру (аминный азот 200 - 250 мг %) в чашки Петри наносят каплю исследуемой взвеси спор, разведенной 0,9 %-ным раствором хлорида натрия до концентрации 10 ⁸ спор в 1 мл по счету в камере Горяева. Наклоняя чашку в разные стороны, равномерно распределяют каплю по поверхности агара. Засеянную чашку (агаром вниз) помещают в термостат на 2,5 ч при температуре 35 - 37 °С. Микрокультуры просматривают в фазово-контрастном микроскопе с иммерсией через покровное стекло, помещенное на выбранный участок агара. В каждом поле зрения отдельно подсчитывают и непроросшие споры. Оболочки спор менее контрастны. При подсчете спор и палочек оболочки не учитывают. Общее сосчитанное количество клеток должно быть не менее 500. Количество живых спор в микрокультуре устанавливают по отношению палочек к общему числу сосчитанных проросших клеток и спор (в процентах).

Количество живых спор в вирулентных культурах (тест-штамм) определяют только высевом 10 ² спор на агаровые пластинки. Общее количество спор определяют по стандарту мутности ГИСК, 10 ед. которого эквивалентны 10 ⁸ спор.

3. Определение присутствия плазмиды рХО1 проводят одновременно с определением отсутствия плазмиды рХО2 следующим образом. К 25 мл 16-часовой бульонной испытуемой культуры сибиреязвенного микроба добавляют 5 мл свежей среды бульон Хоттингера pH 7,2, а также раствор пенициллина до конечной концентрации 1000 ед/мл и инкубируют с аэрации при 180 оборотах в мин. в термостатируемой качалке в течение 1 ч при температуре (36 + 1) °С. Клетки осаждают центрифугированием при 8000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл Е буфера следующего состава: трис-аминометан 0,04 М; тетранатриевая соль ЭДТА 0,002 М; сахароза 15 %, pH 7,9. Культуру лизируют на водяной бане в течение 30 мин при 60 °С в 2 мл лизирующей смеси (додецилсульфат натрия 3 %, трис-аминометан 0,05 М, натрия гидроксид 0,15 N, сахароза 15 %). К лизату добавляют 0,5 мл раствора 2 М трис-аминометана pH 7,0, содержащего проназу в концентрации 2 мг/мл; после чего инкубируют на водяной бане при температуре 37 °С в течение 20 мин. Экстракцию белков проводят добавлением к лизату 6 мл смеси фенола и хлороформа в соотношении 1:1. Суспензию осторожно перемешивают, а затем центрифугируют 10 мин при 10 тыс. об/мин. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, используют для электрофоретического анализа. Электрофорез ДНК проводят в горизонтальных пластинках 0,7 %-ного агарозного геля при силе тока 70 - 90 мА. Гель окрашивают в течение 20 мин бромистым этидием в концентрации 0,5 мкг/мл, отмывают в дистиллированной воде и фотографируют в ультрафиолетовом свете на фотопленку "Фото-65". На фотографии агарозного геля у испытуемого и эталонного вакцинного СТИ-1 штаммов сибиреязвенного микробов должна быть полоска, соответствующая по размеру ДНК плазмиды рХО1 (110 МД).

4. Определение наличия pag-гена проводится в соответствии с Инструкцией по применению тест-системы для обнаружения В. anthracis рХО1 ⁺ методом полимеразной цепной реакции (ФСЦ 42......).