Приложение 2. Методы определения безвредности вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба

Приложение 2

Методы определения безвредности вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба

1. Подготовка к проведению исследований лабораторных животных (мышей, свинок, кроликов, овец и коз).

Поступивших в лабораторию морских свинок выдерживают перед началом исследований в карантине не менее 10 сут. Проводят оценку поголовья животных путем взвешивания, термометрирования и ежедневного клинического наблюдения. Состояние здоровья поголовья морских свинок определяют также по данным патологоанатомического и гистологического исследований. Для этого по 10 животных вскрывают и исследуют в три этапа: в начале карантина, в день начала опыта и через 30 дней после постановки опыта. Повторное взвешивание и термометрирование свинок проводят накануне введения им испытуемого штамма. Животные могут быть использованы для определения безвредности аттенуированного штамма сибиреязвенного микроба в том случае, если большинство из них в виварии клинически здорово, за время карантина не снизили или прибавили в массе, ректальная (или оральная) температура максимально не превысила 38,5 °С.

При общем благополучном состоянии поголовья могут быть отдельные случаи потери массы, заболевания и даже гибели животных. Эти случаи не должны превышать 1,5 % от общего числа животных вивария.

2. Определение степени остаточной вирулентности и реактогенности для морских свинок.

Оценку безвредности штамма в опытах на морских свинках проводят по клиническим проявлениям на подкожное введение испытуемой культуры, летальности, распространенности и приживаемости микробов в органах и тканях по результатам бактериологических, а также патоморфологических исследований животных, забитых и вскрытых в разные сроки после однократного введения споровой культуры.

2.1. Распространяемость, приживаемость и реактогенность штамма определяют в одном опыте на одной и той же группе животных.

Накануне опыта морских свинок (масса 350 - 400 г) с учетом показателей массы распределяют на равноценные группы для каждого штамма и каждой дозы. На каждый штамм берут по 160 морских свинок, распределяют их по массе на 4 равноценные группы: две - по 50 и две группы - по 30 животных. Испытуемый и эталонный вакцинный штаммы сибиреязвенного микроба в споровой форме (не менее 90 % жизнеспособных спор по методу микрокультуры) вводят морским свинкам под кожу бедра в паховой области в объеме 1 мл, содержащим по 5·10 ⁷ (50 свинок на штамм), 10 ⁶ (50 свинок), 10 ⁴ (30 свинок) и 10 ² (30 свинок) спор.

2.2. Методика вскрытия, патологоанатомические и бактериологические исследования лабораторных животных при определении безвредности штаммов.

Для определения распространяемости и приживаемости микробов и патоморфологических изменений в органах и тканях, вызываемых в разные сроки, животных по 3 для каждой культуры и каждой дозы умерщвляют поочередно хлороформом на 1, 3, 5, 8, 15, 21 и 30-е сутки после введения испытуемых культур. Как можно быстрее, не позднее 20 - 30 мин после смерти, проводят их вскрытие, перед вскрытием тушки смачивают мыльным раствором, проводят тщательное описание патологоанатомических изменений и их бактериологическое исследование, берут органы для патогистологического исследования. Кусочки органов, тканей и лимфатические узлы фиксируют в 10 %-ном растворе нейтрального формалина. Для каждого животного берут отдельную банку емкостью 300 - 500 мл с притертой или резиновой пробкой, на 2/3 заполненной формалином. В банку помешают бумажную этикетку, на которой простым карандашом крупно с обеих сторон написаны номер животного, шифр культуры, дата взятия материала и день наблюдения. На другой этикетке пишут название лимфатических узлов. Результаты патологоанатомического исследования записывают в протокол вскрытия. Вскрытие животных производят на доске, размещенной в кювете из нержавеющего металла. На доску кладут лист пергаментной бумаги. После вскрытия бумагу осторожно свертывают и помещают в бачок для вскрытых животных. Корнцангом со смоченным спиртом горящим ватным тампоном обжигают вскрывочную доску и края кювета. В кювет наливают 5 %-ный раствор перекиси водорода с 1 % моющего средства.

При вскрытии кожных покровов описывают состояние подкожной клетчатки, отмечая степень инъекции ее сосудов, возможные очаги гиперемии, геморрагии или отека. Отмечают состояние кожи, клетчатки, подлежащих мышц в месте введения культуры, характер изменений в них, распространенность. Особое внимание обращают на развитие геморрагических, гнойных и некротических изменений. Указывают размеры (в мм) регионарных к месту введения культуры паховых лимфатических узлов, их цвет, плотность, спаянность с окружающей клетчаткой и состояние других лимфоузлов. После посевов кусочки с места введения погружают в 10 %-ный раствор нейтрального формалина, а лимфатические узлы помещают на этикетку против соответствующих названий и после подсушивания тоже опускают в фиксатор.

После этого вскрывают брюшную и грудную полости. Отмечают полнокровие органов, состояние плевральных полостей, сальника, висцеральной брюшины, кишечника, проводят посевы и описывают состояние внутренних органов. Обращают внимание на развитие интерстициальной реакции в легких (макроскопически она определяется в виде мелких серовато-розовых очагов или тяжей, расположенных главным образом по ходу сосудов и бронхов), а также наличие узелков, очагов некроза в печени и селезенке, отмечая особо их количество, размеры (длина, ширина, толщина) и внешний вид. Кусочки органов берут обязательно с измененными участками. После исследования легких, сердца, селезенки и печени и взятия из них кусочков размером 1x1 см тонкий кишечник отодвигают в правую сторону (по отношению к свинке), берут почку; надрезают ее с надпочечником и подвздошные лимфатические узлы, отмечают их размеры, консистенцию, цвет и состояние окружающей клетчатки. В последнюю очередь берут костный мозг вместе с кусочком диафиза бедренной кости. Кость надо расщепить, т.к. она может препятствовать проникновению фиксатора. Собранный материал оставляют на 14 сут. в комнате для инфицированных животных, после чего его выносят для гистологической обработки.

После посева ткани каждого органа тщательно обрабатывают инструменты: пинцеты и ножницы вытирают ватным тампоном, смоченным 5 %-ным раствором перекиси водорода, опускают в стакан со спиртом и перед очередным использованием обжигают.

Результаты патологоанатомического исследования записывают в протокол.

2.3. Во время вскрытия животных проводят и бактериологическое исследование. Посевы органов и тканей проводят на заранее проверенный на ростовые качества агар Хоттингера (pH 7,0 - 7,2, аминный азот 200 - 250 мг %), используют питательную среду, обеспечивающую рост колоний из 10 засеянных спор. На агаровые пластинки в чашках Петри засевают место введения культуры, правый подвздошный лимфоузел, костный мозг (одна чашка), лимфатические узлы правый (регионарный) и левый паховые, правый и левый подмышечные (вторая чашка), печень и селезенку (третья чашка); легкие и кровь (четвертая чашка); на агар с 3 - 5 % крови засевают легкие и кровь, на агар Эндо - печень и селезенку. Посевы органов проводят методом многочисленных отпечатков, костный мозг берут и сеют петлей из бедренной кости, посев крови проводят мазком-отпечатком отсеченной верхушкой сердца. Среды с посевами органов на агар Хоттингера помещают в термостат при температуре 28 °С, на агар с 3 - 5 % крови и агар Эндо при 37 °C на 2 сут. Просматривают посевы через 1 сут., окончательно через 2 сут. Погибших животных исследуют так же, как и умерщвленных. Кроме того, у погибших морских свинок делают дополнительные посевы из тонкого, толстого кишечника и мезентериальных лимфатических узлов на агар Эндо. Аналогичным образом исследуют поголовье животных.

2.4. Определение "остаточной" вирулентности штамма для мышей. "Остаточную" вирулентность новых вакцинных сибиреязвенных штаммов проверяют на белых мышах или черных инбредных мышах (C57BL) массой 18 - 20 г. Испытуемый и эталонный вакцинный штаммы сибиреязвенного микроба вводят подкожно белым или черным мышам в объеме 0,5 мл в дозе 10 ⁸, 10 ⁷, 10 ⁶, 10 ⁵, 10 ⁴ живых спор. На каждую дозу берут по 6 животных. За животными наблюдают в течение 10 сут. после введения культур. Значительное число мышей (до 80 %) может погибнуть в сроки 2 - 7 сут. Воспалительный отек у мышей на месте введения культуры имеет геморрагический характер. Образование отеков в ответ на инъекцию культуры свидетельствует об остаточной вирулентности штамма и является косвенным показателем ее иммуногенности. Павших мышей вскрывают, делают посевы из внутренних органов, крови, мазки-отпечатки. Определяют LDso испытуемого и контрольного штаммов по методу Кербера.

                            Протокол вскрытия

                   от ________________________ 20__ г.

N животного ________ вид ______________ пол __________ масса ____________

Название культуры ______________ доза _________ срок наблюдения

Метод и место введения __________________________________________________

Дата заражения _____________ падежа ____________ умерщвления ____________

Результаты вскрытия

Упитанность _____________________________________________________________

Состояние подкожных сосудов _____________________________________________

Место введения __________________________________________________________

Лимфатические узлы ______________________________________________________

Правый пахов. ___________________________________________________________

Левый пахов. ____________________________________________________________

Правый подмыш. __________________________________________________________

Подвздошные _____________________________________________________________

Паратрахеальные _________________________________________________________

Бифуркационные * ________________________________________________________

Легкие __________________________________________________________________

Селезенка _______________________________________________________________

Печень __________________________________________________________________

Почки ___________________________________________________________________

Надпочечники ____________________________________________________________

Др. органы ______________________________________________________________

Костный мозг ____________________________________________________________

                            Вскрывал ____________________________________

------------------------------

^*_{Берутся для гистологии при аэрогенном введении.}

------------------------------

3. Реактогенность испытуемого и эталонного сибиреязвенных вакцинных штаммов оценивают на морских свинках по клиническим наблюдениям за животными, которых в первые две недели не забивают. Сроки наблюдения: 2, 4, 6, 8, 10 и 12-е сутки после введения культур. У каждого животного (по 15 для каждой дозы) осматривают и пальпируют место введения, измеряют ректальную температуру термометром, определяют массу тела.

4. Оценку безвредности испытуемого штамма в опытах на кроликах проводят по клиническим проявлениям поствакцинальной реакции, по данным бактериологического и патоморфологического исследований кроликов, забитых и вскрытых в разные сроки после однократного подкожного введения испытуемой сибиреязвенной споровой культуры. В опыт берут на эталонный и испытуемый штаммы по 25 кроликов, предпочтительно породы "шиншиллы" с массой тела 2 - 2,5 кг.

Культуры вводят в дозе 2,5·10 ⁸ живых спор в объеме 1 мл под кожу внешней поверхности бедра. По 2 кролика умерщвляют через 1, 3, 8, 15 и 21 сут. после вакцинации для бактериологического и патогистологического изучения. Одновременно с посевами из тех же органов готовят мазки-отпечатки, фиксируют их метиловым спиртом с 10 % формалина и окрашивают метиленовым синим по Леффлеру. 10 кроликов на каждый штамм оставляют для клинических наблюдений и последующей проверки иммуногенности штаммов для этого вида животных.

4.1. Определение реактогенности по клиническим наблюдениям.

У 10 кроликов, оставленных для проверки иммунитета, проводят на 3, 4, 6, 8 и 10-е сутки после введения культуры следующие клинические наблюдения: осмотр места введения, взвешивание, измерение ректальной температуры.

5. Определение безвредности штаммов для овец и коз. Безвредность культур испытуемого и эталонного вакцинного сибиреязвенных штаммов в опытах на овцах и козах оценивают по клиническим проявлениям поствакцинальной реакции, по данным бактериологического и патоморфологического исследования животных забитых и вскрытых в разные сроки после введения культуры.

В опыт берут на каждый штамм по 14 здоровых овец и 2 козы в возрасте 1 - 1,5 года, не подвергавшихся ранее вакцинации против сибирской язвы. На 10 овцах впоследствии оценивают иммуногенность штамма. Испытуемую и контрольную культуры вводят овцам под кожу внутренней поверхности бедра в дозе 2·10 ⁶ спор в объеме 1 мл. После введения культур проводят ежедневно термометрирование утром и вечером и осмотр животных.

Для проведения патологоанатомического и бактериологического исследования умерщвляют по 1 козе на 5 и 7-е сутки, по 1 овце на 1, 3, 5 и 7-е сутки после введения культур на каждый штамм и срок.