Приложение D (справочное). Подготовка к проведению положительного контроля и теста на определение эффективности выделения

Приложение D
(справочное)

Подготовка к проведению положительного контроля и теста на определение эффективности выделения

D.1 Общие положения

Суспензии положительного контроля готовят для моноклональных антител и красителей DAPI, используемых в микроскопии. Их также готовят для мембранных фильтров, используемых для посева, или проб воды в целях определения эффективности выделения для каждой методики испытания и профессиональности специалистов, проводящих данные процедуры. Пробы деионизированной воды для посева не могут должным образом служить для оценки степени выделения криптоспоридий или лямблий из проб воды.

D.2 Определение концентрации ооцист или цист в исходной суспензии

Используют гемоцитометр Нэйбауэра для определения концентрации ооцист криптоспоридий или цист лямблий (Giardia) в исходных суспензиях, полученных от изготовителей. Используют эти данные для приготовления точного разведения исходных суспензий.

При необходимости разведения исходной суспензии в микроцентрифужных пробирках вместимостью 1,5 мл готовят 1 мл суспензии путем разведения необходимого объема исходной суспензии (с учетом предполагаемой концентрации организмов в ней, указанной изготовителем) в 0,01 %-ном растворе твина 20, профильтрованном через мембранный фильтр (с размером пор 0,2 мкм). Концентрация ооцист или цист в полученной суспензии должна составлять около 1  10 ⁶ в миллилитре. Записывают значение используемого объема исходной суспензии (мкл) как объем A, V _A, для использования в дальнейшем.

Используют следующее уравнение:

,

(D.1)

где c _req - необходимая концентрация ооцист или цист в миллилитре;

c _stock - концентрация ооцист или цист в миллилитре исходной суспензии;

V _tot - общий объем, мл;

V _stock - необходимый объем исходной суспензии ооцист или цист, мл и преобразуют значение объема в миллилитрах на микролитры:

V _A=V _stock1000,

где V _A - необходимый объем исходной суспензии ооцист или цист, мкл.

Пример - Если концентрация в поставляемой исходной суспензии около 1  10 ⁸ ооцист в миллилитре, добавляют 10 мкл исходной суспензии ооцист к 990 мкл фильтрованного раствора твина 20. Встряхивают исходную суспензию в течение не менее 30 с перед отбором аликвоты.

Подготавливают предметное стекло гемоцитометра и покровное стекло посредством промывки 90 %-ным раствором этилового спирта и протирают объектив микроскопа с помощью безворсовой ткани.

С помощью безворсовой ткани смачивают линзы микроскопа фильтрованной деионизированной водой (см. 4.1.1) и наносят тонкий слой воды на поверхность предметного стекла гемоцитометра на месте, которое будет контактировать с покровным стеклом. Плотно прижимают покровное стекло, пока не станут заметны кольца Ньютона.

Встряхивают разведенную исходную суспензию ооцист или цист в течение 30 с и заполняют ею подготовленный гемоцитометр с помощью микропипетки.

Примечание - Продолжительное встряхивание может повредить ооцисты и/или цисты. Исходную суспензию можно гомогенизировать путем наклона пробирки не менее 20 раз.

После 1 мин покоя (в течение которой ооцисты и цисты осядут на поверхность предметного стекла) подсчитывают ооцисты и/или цисты, используя микроскопию по методу дифференциально-интерференционного контраста (см. 7.4.4).

При осмотре с помощью DIC поверхность предметного стекла гемоцитометра разделяется на пять основных квадратов, которые далее делятся на 25 или 16 квадратов для удобства подсчета. Должно быть определено первоначальное количество ооцист или цист, содержащихся в пределах центрального главного квадрата. Это включает в себя подсчет количества ооцист или цист, содержащихся в каждом из малых квадратов, последовательно разделяя квадраты, двигаясь слева направо по главному квадрату. Чтобы избежать двойного подсчета организмов, те из них, которые касаются граничных линий малых разделенных квадратов, должны учитываться только в том случае, если они касаются левой или верхней линий. Должно быть подсчитано не менее 100 ооцист или цист. Если общее количество подсчитанных организмов меньше указанного количества, должны быть подсчитаны остальные главные квадраты, пока не будет получено 100. Подсчитывают общее количество организмов, а затем записывают количество подсчитанных главных квадратов.

Площадь счетных камер на главном квадрате составляет 1 мм ². Для того чтобы определить количество ооцист на миллилитр, количество на главном квадрате или среднее количество по всем квадратам умножают на 100, чтобы преобразовать его в квадратные сантиметры. Глубина счетной камеры составляет 0,1 мм, так что значение дополнительно умножают на 100, чтобы получить количество на миллиметр.

Указанное уравнение (D.2) следует использовать для определения числа ооцист или цист в разведенной исходной суспензии.

,

(D.2)

где n _(oo)cysts - общее количество подсчитанных ооцист или цист;

n _square - количество подсчитанных главных квадратов;

c _(oo)cysts - количество ооцист или цист на миллиметр.

Выполняют три повторных подсчета на разведенной исходной суспензии и вычисляют среднее количество организмов.

Используют следующую формулу для определения точного количества ооцист или цист в миллилитре неразведенной исходной суспензии. Полученное значение используют, чтобы вычислить последовательные коэффициенты разведения.

,

(D.3)

где V _A - объем A, мкл;

- среднее количество ооцист или цист в миллилитре (разведенная исходная суспензия);

c _(oo)cysts - количество ооцист или цист в миллилитре.

D.3 Рабочие характеристики суспензий для положительного контроля

Готовят 10 мл суспензии ооцист криптоспоридий и цист лямблий в пластиковой универсальной пробирке вместимостью 25 мл путем разведения в среде для хранения паразитов (см. 4.4.11) необходимого объема соответствующей неразведенной исходной суспензии, чтобы получить конечную концентрацию организмов около 1  10 ³ на миллилитр, т.е. около 100 ооцист и цист каждого организма на 100 мкл.

Встряхивают суспензию криптоспоридий и лямблий в течение 30 с, а затем распределяют по 100 мкл аликвоты суспензии на поверхности лунки предметных стекол 10 микроскопов. Сушат, фиксируют и окрашивают предметные стекла (см. 7.3). Определяют количество ооцист и цист на предметных стеклах, используя эпифлуоресцентную микроскопию (см. 7.4.2). Рассчитывают среднее количество каждого организма на предметное стекло, стандартное отклонение и коэффициент вариации. Записывают результаты.

Удостоверяются, что коэффициен