Приложение A (обязательное). Приготовление реактивов

Приложение A
(обязательное)

Приготовление реактивов

A.1 Элюирующие буферы для Pall Envirochek ^TM STD и капсулы HV

A.1.1 Трис-буфер

Трис, г	121,1
Деионизированная вода, мл	1000

Растворяют трис в 700 мл деионизированной воды и регулируют pH до 7,4, используя раствор HCl или NaOH концентрацией 1,0 моль/л. Доводят объем раствора до 1000 мл деионизированной водой. Проведение стерилизующей фильтрации не обязательное. Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

A.1.2 Раствор ЭДТА

ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль, дигидрат), г	186,1
Деионизированная вода, мл	100

Растворяют ЭДТА в 800 мл горячей деионизированной воды. Охлаждают до комнатной температуры (20  5) °C и регулируют pH до 8,0, используя для первичной регулировки раствор NaOH концентрацией 6,0 моль/л, а для окончательной регулировки раствор HCl или NaOH концентрацией 1,0 моль/л. Доводят объем раствора до 1000 мл деионизированной водой. Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

A.1.3 Элюирующий буфер

Лаурет-12, г	1
Трис-буфер (A.1.1), мл	10
Раствор ЭДТА (A.1.2), мл	2
Пеногаситель A, мкл	150
Деионизированная вода, мл	1000

Взвешивают лаурет-12 в стакане и добавляют 100 мл фильтрованной деионизированной воды (см. 4.1.1).

Нагревают стакан с целью плавления лаурет-12 (около 1 мин) и переносят раствор в мерный цилиндр вместимостью 1000 мл.

Промывают стакан несколько раз, чтобы гарантировать перенос очищающего вещества в цилиндр.

Добавляют 10 мл трис-буфера с pH 7,4, 2 мл раствора ЭДТА с pH 8,0 и 150 мкл пеногасителя A.

Доводят объем раствора до 1000 мл фильтрованной деионизированной водой.

Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 2 мес.

Примечание - Для частого применения могут быть приготовлены объемы до 10 л.

A.1.4 Буфер предварительной обработки

Полифосфат натрия (NaPO 3) n, г	5
Деионизированная вода, мл	1000

Полифосфат натрия растворяют в воде.

Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 1 нед.

A.2 Буферы для фильтров IDEXX Filta-Max , фосфатно-солевой буфер с объемной долей 0,01 % твина 20

A.2.1 Фосфатно-солевой буфер (PBS)

Хлорид натрия, г	8,0
Гидрофосфат натрия (Na 2HPO 4), г	1,15
Дигидрофосфат калия (KH 2PO 4), г	0,2
Хлорид калий, г	0,2
Деионизированная вода, мл	1000

Растворяют все ингредиенты в воде и доводят значение pH до 7,3  0,2, используя раствор HCl или NaOH концентрацией 1,0 моль/л.

Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

A.2.2 Элюирующий буфер

Полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат (твин 20), мл	1
PBS (см. A.2.1), л	10

Около 8 л PBS (см. A.2.1) разливают в емкость (с краном) вместимостью 10 л. Перемешивают жидкость в магнитной мешалке с использованием магнитного элемента. Вносят 1 мл твина 20 в центрифужную пробирку вместимостью 50 мл и добавляют около 10 мл теплой деионизированной воды (см. 4.1.1).

Осторожно выливают содержимое центрифужной пробирки в вышеуказанную емкость вместимостью 10 л. Дважды промывают пробирку 10 мл деионизированной воды (см. 4.1.1), каждый раз выливая содержимое пробирки в ту же емкость. Доводят объем емкости до 10 л PBS (см. A.2.1).

Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 1 мес.

A.3 Реактивы для концентрирования проб воды и выявления криптоспоридий и лямблий

A.3.1 Иммунофлуоресцентная гистологическая среда

1,4-диазабицикпо [2.2.2] октан (DABCO), г	2
Глицерин, мл	60
PBS (см. A.2.1), мл	40

Растворяют DABCO в глицерине и PBS. Доводят значение pH до 7,1  0,2, используя раствор HCl или NaOH концентрацией 0,1 моль/л.

Хранят среду при температуре (5  3) °C. Емкость со средой во время использования может находиться при комнатной температуре (20  5) °C.

Примечание - Сведения об изготовителях приведены в приложении H. Срок годности указывается изготовителем на каждой упаковке.

A.3.2 Исходный раствор DAPI

DAPI, мг	1
Метанол, мл	0,5

Добавляют 0,5 мл метанола в емкость, содержащую 1 мг DAPI (см. 4.4.5).

Хранят раствор при температуре (5  3) °C не более 1 мес.

A.3.3 Рабочий раствор DAPI

Исходный раствор DAPI (A.3.2), мкл	10
PBS (см. A.2.1), мл	50

Разбавляют исходный раствор DAPI в PBS.

Хранят раствор при температуре (5  3) °C не более одного дня.

A.3.4 Среда для хранения паразитов - исходный раствор

Азид натрия (NaN 3), мг	100
Деионизированная вода, мл	5

Растворяют азид натрия в воде.

Хранят среду при температуре (5  3) °C не более 1 мес.

A.3.5 Среда для хранения паразитов - рабочий раствор

Среда для хранения паразитов - исходный раствор (см. A.3.4), мл	1
Деионизированная вода, мл	100

Вносят 1 мл исходного раствора среды для хранения паразитов в 100 мл деионизированной воды.

Хранят среду при температуре (5  3) °C не более 1 мес.