Приложение B (справочное). Концентрирование ооцист и цист в небольших объемах (10 л) воды

Приложение B
(справочное)

Концентрирование ооцист и цист в небольших объемах (10 л) воды

B.1 Общие положения

Капсулы для фильтрации могут использоваться для небольших объемов воды (обычно 10 л), однако, учитывая их стоимость, это может оказаться нецелесообразным. В настоящем приложении описаны альтернативные методы концентрирования ооцист и цист из малых объемов воды. Некоторые из приведенных методов не требуют закупки дорогостоящего оборудования и материалов, а основаны на применении химических веществ для концентрирования проб воды (флокуляция). В приложении приведены три метода концентрирования проб воды: карбонатом кальция, сульфатом железа (II) и с помощью мембранной фильтрации. Методы позволяют анализировать небольшие объемы воды, которые могут быть собраны и доставлены в лабораторию в течение относительно короткого периода времени. Если необходимо срочно получить результаты, то они могут быть получены в течение нескольких часов. Можно использовать принципы IMS (см. 7.2), а также окрашивание и выявление (см. 7.3 и 7.4), установленные в настоящем стандарте, после концентрирования проб воды.

Примечание - Концентрирование проб воды с применением химических веществ (флокуляция) не подходит для воды, не содержащей взвешенных частиц. Вода, содержащая значительное количество взвешенных частиц, трудно поддается мембранной фильтрации.

B.2 Реактивы, необходимые для концентрирования проб воды карбонатом кальция

B.2.1 Деионизированная вода, фильтрованная по месту использования через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

B.2.2 Дигидрат хлорида кальция, раствор концентрацией 1 моль/л

Растворяют 1470 г CaCl ₂  2H ₂O в 10 л воды. Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

B.2.3 Гидрокарбонат натрия, раствор концентрацией 1 моль/л

Растворяют 840 г NaHCO ₃ в 10 л воды. Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

B.2.4 Гидроксид натрия, раствор концентрацией 1 моль/л

Растворяют 400 г NaOH в 10 л воды. Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

B.2.5 Сульфаминовая кислота, раствор концентрацией 10 %

Растворяют 1000 г NH ₂SO ₃H в 10 л воды. Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

B.2.6 Полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат (твин 20), раствор концентрацией 0,01 %.

B.3 Приготовление реактивов

Для приготовления реактивов добавляют необходимое количество соответствующего вещества к 9 л  200 мл фильтрованной деионизированной воды (см. B.2.1) и помещают в магнитную мешалку до полного растворения вещества.

Доводят объем раствора до 10 л  100 мл фильтрованной деионизированной водой (см. B.2.1) и хорошо перемешивают.

B.4 Оборудование, необходимое для концентрирования проб воды карбонатом кальция

B.4.1 Мерные цилиндры вместимостью 10, 100, 1000 мл.

B.4.2 Аспирационные трубки.

B.4.3 Источник вакуума с вакуумными датчиками и емкостями для смывов.

B.4.4 Центрифуга, обеспечивающая центробежное ускорение 7200 g и 1100 g.

B.4.5 Центрифужные флаконы, пластиковые, с завинчивающейся крышкой, вместимостью 1000 мл.

B.4.6 Центрифужные пробирки, конические, пластиковые, вместимостью 50 мл.

B.4.7 Емкость для перемешивания - оплетенная стеклянная бутыль вместимостью 10 л.

B.5 Методика концентрирования проб воды карбонатом кальция

Наливают 10 л пробы воды в емкость для перемешивания, добавляют 100 мл раствора CaCl ₂ концентрацией 1 моль/л (см. B.2.2) и 100 мл раствора NaHCO ₃ концентрацией 1 моль/л (см. B.2.3), затем встряхивают емкость для перемешивания (см. B.4.7).

Добавляют 100 мл раствора NaOH концентрацией 1 моль/л (см. B.2.4) и встряхивают емкость для перемешивания.

Содержимому емкости для перемешивания дают отстояться при комнатной температуре не менее 4 ч, но не более 24 ч.

После осаждения хлопьев осторожно (без взбалтывания осадка) удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуума, не превышающего 20 кПа (0,2 бар) (см. B.4.3).

Добавляют достаточное количество (100-200 мл) раствора сульфаминовой кислоты концентрацией 10 % (см. B.2.5) для полного растворения хлопьев.

Хорошо перемешивают содержимое емкости для перемешивания и переливают его в центрифужный флакон вместимостью 1 л (см. B.4.5), пронумерованный в соответствии с номером пробы.

Примечание 1 - Может потребоваться использование двух центрифужных флаконов при большом количестве осадка.

Добавляют (200  20) мл 0,01 %-ного раствора твина 20 (см. B.2.6) в емкость для перемешивания, энергично встряхивая, ополаскивают и переносят содержимое емкости для перемешивания в вышеуказанный центрифужный флакон вместимостью 1 л.

В емкость для перемешивания вновь добавляют (200  20) мл 0,01 %-ного раствора твина 20 и медленно вращают, чтобы подобрать пену у ее краев, затем содержимое емкости для перемешивания переносят в центрифужный флакон вместимостью 1 л.

Содержимое центрифужного флакона должно иметь pH 6-6,5. При несоответствии, значение pH регулируют раствором NaOH концентрацией 1 моль/л (см. B.2.4).

Обеспечение значения pH в указанном диапазоне позволяет избежать повторного образования хлопьев.

Проводят балансировку центрифуги при центробежном ускорении 1 g с помощью центробежных флаконов вместимостью 1 л, наполненных фильтрованной деионизированной водой. Центрифугируют подготовленную пробу при максимальном центробежном ускорении 7200 g в течение 12 мин без торможения во время фазы замедления.

Сразу после центрифугирования извлекают центрифужные флаконы и осторожно удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуума, не превышающего 20 кПа (0,2 бар) (см. B.4.3).

Энергично встряхивают оставшуюся жидкость, чтобы ресуспендировать осадок, затем переносят его в центрифужную пробирку вместимостью 50 мл (см. B.4.6).

Используя промывалку, добавляют (20  2) мл 0,01 %-ного раствора твина 20 в центрифужный флакон вместимостью 1 л для суспендирования возможно оставшихся остатков пробы и переносят в другую центрифужную пробирку вместимостью 50 мл. Доводят объем в каждой центрифужной пробирке до 50 мл, используя фильтрованную деионизированную воду.

Центрифужные пробирки вместимостью 50 мл центрифугируют при центробежном ускорении 1100 g в течение 15 мин без торможения во время фазы замедления. Записывают объем осадка (объем сухого остатка) сразу после центрифугирования.

Примечание 2 - Испытательный комплект IMS обычно включает осадок определенного объема для использования во время испытания, например 0,5-2 мл.

Используя пипетку Пастера, осторожно удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуума, не превышающего 20 кПа (0,2 бар), оставляя 2-5 мл жидкости над осадком. Если нет видимого осадка, принимают дополнительные меры предосторожности, чтобы избежать засасывания ооцист и цист при осуществлении данной процедуры.

Добавляют фильтрованную деионизированную воду в центрифужную пробирку, чтобы довести объем содержимого пробирки до 10 мл. Встряхивают содержимое центрифужной пробирки в течение 10-15 с, чтобы ресуспендировать осадок, и затем либо ставят пробу на хранение при температуре (5  3) °C для будущего проведения IMS, либо сразу переходят к методике, установленной в 7.2.

Если объем осадка превышает объем, рекомендованный изготовителем испытательного комплекта IMS, повторно центрифугируют пробу в пробирке, которая позволяет точно измерить объем осадка. Разделяют пробу на аликвоты для IMS таким образом, чтобы каждая аликвота имела объем, не превышающий максимального объема осадка, рекомендованного изготовителем, и доводят каждую аликвоту до 10 мл фильтрованной деионизированной водой.

B.6 Реактивы, необходимые для концентрирования проб сульфатом железа (II)

B.6.1 Деионизированная вода, фильтрованная по месту использования через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

B.6.2 Гидроксид натрия, раствор концентрацией 1 моль/л

Растворяют 400 г NaOH в 10 л воды. Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

B.6.3 Сульфат железа (II), раствор концентрацией 1 моль/л

Растворяют 2780 г FeSO ₄  7H ₂O в 10 л воды.

Хранят раствор при комнатной температуре (20  5) °C не более 3 мес.

B.6.4 Щавелевая кислота, раствор концентрацией 10 %.

B.6.5 Полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат (твин 80), раствор концентрацией 0,1 %.

B.6.6 PBS-твин, раствор 10 ммоль/л PBS (pH 7,4) и 0,1 % твин 80.

B.6.7 Полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат (твин 20), раствор концентрацией 0,01 %.

B.7 Приготовление реактивов

В соответствии с B.3.

B.8 Оборудование, необходимое для концентрирования проб воды сульфатом железа (II)

В соответствии с B.4.

B.9 Методика концентрирования проб воды сульфатом железа (II)

Наливают 10 л пробы воды в емкость для перемешивания (см. B.4.7). Доводят значение pH до 9,0  0,2, используя раствор NaOH концентрацией 1 моль/л (см. B.6.2).

Примечание 1 - Как правило, потребуется около 2 мл раствора NaOH.

При перемешивании добавляют 20 мл раствора сульфата железа (см. B.6.3) и продолжают перемешивать в течение 5 мин при 280 об/мин.

Содержимому емкости для перемешивания дают отстояться в течение 18 ч при комнатной температуре (20  5) °C. Затем осторожно удаляют надосадочную жидкость, оставляя над осадком слой жидкости высотой 4-5 см.

В центрифужном флаконе вместимостью 1 л собирают осадок в количестве 600-1200 мл в зависимости от обрабатываемой пробы воды.

В емкость для перемешивания добавляют 100-150 мл 10 %-ного раствора щавелевой кислоты (см. B.6.4) и ополаскивают, чтобы полностью растворить осадок сульфата железа.

Добавляют в емкость для перемешивания 150 мл 0,1 %-ного раствора твина 80 (см. B.6.5), ополаскивают и содержимое емкости для перемешивания присоединяют к осадку.

Центрифугируют подготовленную пробу при центробежном ускорении 1500 g в течение 10 мин без торможения во время фазы замедления. Осторожно (без взбалтывания осадка) отсасывают надосадочную жидкость, оставляя над осадком слой жидкости высотой около 1 см.

Измеряют объем осадка и ресуспендируют осадок, используя 5 объемных частей 0,1 %-ного раствора твина 80 (5 объемных частей твина 80 на 1 объемную часть осадка).

Повторяют последний вышеуказанный этап ополаскивания перед центрифугированием.

Центрифугируют при центробежном ускорении 1500 g в течение 10 мин и ресуспендируют осадок, используя 1 объемную часть PBS-твин (см. B.6.6).

Примечание 2 - Используемый объем PBS-твин эквивалентен объему осадка, и, как правило, общий объем составляет 60-80 мл.

Контролируют pH концентрированной пробы воды и при необходимости регулируют его до значения 7,2-7,4, используя PBS (10 ммоль/л, pH 7,4).

Переносят пробу в центрифужные пробирки вместимостью 50 мл (см. B.4.6). Добавляют (20  2) мл 0,01 %-ного раствора твина 20 (см. B.6.7) в центрифужный флакон вместимостью 1 л для суспендирования возможно оставшихся остатков пробы и переносят в другую центрифужную пробирку вместимостью 50 мл. Доводят объем в каждой центрифужной пробирке до 50 мл, используя фильтрованную деионизированную воду.

Центрифужные пробирки вместимостью 50 мл центрифугируют при центробежном ускорении 1100 g в течение 15 мин без торможения во время фазы замедления. Записывают объем осадка (объем сухого остатка) сразу после центрифугирования.

Используя пипетку Пастера, осторожно удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуума, не превышающего 20 кПа (0,2 бар), оставляя 2-5 мл жидкости над осадком. Если нет видимого осадка, принимают дополнительные меры предосторожности, чтобы избежать засасывания ооцист и цист при осуществлении данной процедуры.

Добавляют фильтрованную деионизированную воду в центрифужную пробирку, чтобы довести объем содержимого пробирки до 10 мл. Встряхивают содержимое центрифужной пробирки в течение 10-15 с, чтобы ресуспендировать осадок, и затем либо ставят пробу на хранении при температуре (5  3) °C для будущего проведения IMS, либо сразу переходят к методике, установленной в 7.2.

Если объем осадка превышает объем, рекомендованный изготовителями испытательного комплекта IMS, повторно центрифугируют пробу в пробирке, которая позволяет точно измерить объем осадка. Разделяют пробу на аликвоты для IMS таким образом, чтобы каждая аликвота имела объем, не превышающий максимального объема осадка, рекомендованного изготовителем, и доводят каждую аликвоту до 10 мл фильтрованной деионизированной водой.

B.10 Реактивы, необходимые для смыва осадка с поверхности мембранных фильтров диаметром 142 мм

B.10.1 Твин 80, раствор концентрацией 0,1 %, приготовленный с использованием деионизированной воды.

B.10.2 Деионизированная вода, фильтрованная по месту использования через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

B.11 Подготовка реактивов

В соответствии с разделом B.3.

B.12 Оборудование, необходимое для концентрирования проб воды на мембранных фильтрах диаметром 142 мм

B.12.1 Фильтровальная ячейка из нержавеющей стали под мембранный фильтр диаметром 142 мм.

B.12.2 Мембранные фильтры диаметром 142 мм с размером пор не более 2,0 мкм, изготовленные из ацетата целлюлозы.

B.12.3 Перистальтический насос с номинальной подачей 1 л/мин.

B.12.4 Силиконовые трубки для использования с перистальтическим насосом.

B.12.5 Емкость для мембранных фильтров, используемых для посева, вместимостью 10 л, при использовании метода мембранных фильтров.

B.12.6 Полиэтиленовый пакет для промывки фильтра, например пакет типа "Стомахер".

B.12.7 Центрифуга, обеспечивающая центрифужное ускорение 1100 g

B.12.8 Центрифужные пробирки, конические, пластиковые, вместимостью 50 мл.

B.13 Методика концентрирования с помощью мембранной фильтрации

Помещают мембранный фильтр (см. B.12.2) в фильтровальную ячейку (см. B.12.1) и зажимают. С помощью насоса пропускают пробу воды через мембранный фильтр со скоростью, не превышающей 1,5 л/мин. Промывают емкость, в которой хранилась проба воды, 2 л фильтрованной деионизированной воды (см. B.10.2) и пропускают промывочную воду с помощью насоса через мембранный фильтр.

Извлекают фильтр из фильтровальной ячейки и помещают в чистый полиэтиленовый пакет для промывки фильтра (например, пакет типа "Стомахер") (см. B.12.6). Добавляют 25 мл 0,1 %-ного раствора твина 80 (см. B.10.1) и осторожно протирают поверхность фильтра в течение 1 мин через мешок для смыва осадка.

Смывную жидкость из полиэтиленового пакета декантируют в центрифужную пробирку вместимостью 50 мл (см. B.12.8). Повторяют процедуру смывания осадка, используя также 25 мл 0,1 %-ного раствора твина 80, и полученную смывную жидкость присоединяют к ранее полученной.

Центрифужную пробирку вместимостью 50 мл центрифугируют при центробежном ускорении 1100  g в течение 15 мин.

Используя пипетку Пастера, осторожно удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуума, не превышающего 20 кПа (0,2 бар), оставляя 2-5 мл жидкости над осадком. Если нет видимого осадка, принимают дополнительные меры предосторожности, чтобы избежать засасывания ооцист и цист при осуществлении данной процедуры.

Добавляют фильтрованную деионизированную воду в центрифужную пробирку, чтобы довести объем содержимого пробирки до 10 мл. Встряхивают содержимое центрифужной пробирки в течение 10-15 с, чтобы ресуспендировать осадок, и затем либо ставят пробу на хранение при температуре (5  3) °C для будущего проведения IMS, либо сразу переходят к методике, установленной в 7.2.

Если объем осадка превышает объем, рекомендованный изготовителями испытательного комплекта IMS, повторно центрифугируют пробу в пробирке, которая позволяет точно измерить объем осадка. Разделяют пробу на аликвоты для IMS таким образом, чтобы каждая аликвота имела объем, не превышающий максимального объема осадка, рекомендованного изготовителем, и доводят каждую аликвоту до 10 мл фильтрованной деионизированной водой.