Приложение 3. Лабораторные исследования материала от больных ЭВИ

Приложение 3
к МУ 3.1.1.4015-24

Лабораторные исследования материала от больных ЭВИ

Правила забора и транспортирования материала от больных для проведения лабораторных исследований

1.1. Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник МО. Забор производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры стерильными инструментами.

Упаковка, условия хранения, транспортирования материала для проведения лабораторной диагностики ЭВИ должны соответствовать санитарно-эпидемиологическим требованиям ⁴¹.

------------------------------

⁴¹Глава IV, пункты 2545 - 2571 главы XXXII СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Пробы отбирают с соблюдением мер, предотвращающих контаминацию возбудителем между пробами от одного больного и (или) от разных больных. Для отбора проб используют одноразовую стерильную пластиковую посуду.

1.2. Образцы фекалий. Для работы берут 1 пробу фекалий. Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 4 - 8 г (примерно ноготь большого пальца руки) одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный пластиковый флакон. Отбирают пробу не позднее 7 дней после начала болезни.

1.3. Мазки из ротоглотки. Мазки берут сухими носоглоточными зондами вращательными движениями с поверхности небных дужек и задней стенки ротоглотки, после предварительного полоскания полости рта водой. Мазки необходимо отобрать в день выявления больного.

После взятия материала зонд (рабочую часть) помещают в стерильную одноразовую пластиковую пробирку с 500 мкл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

1.4. Забор ЦСЖ проводят в максимально ранние сроки от начала болезни (в пределах 7 дней) при наличии клинических показаний в асептических условиях с использованием одноразовых пункционных игл. Для исследования отбирают 0,5 - 1 мл ЦСЖ в стерильную одноразовую пластиковую пробирку или пробирку типа "Эппендорф".

1.5. Кровь. Проведение серологических исследований для диагностики ЭВИ не имеет практической целесообразности, но может быть полезным в научных целях. Первую пробу крови (5 мл) для серологической диагностики (при необходимости) берут как можно раньше после начала болезни, вторую - на 3 - 4 неделе, в стадии реконвалесценции.

1.6. Содержимое везикул. Для взятия материала везикулы участок кожи протирают спиртом. Пузырек прокалывают иглой или вскрывают скальпелем, собирают вытекающую жидкость на ватный тампон, которым также протирают везикулу. Для повышения информативности исследования необходимо собирать одним тампоном материал не менее чем с трех везикул. Тампон помещают в стерильный флакон с 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида.

1.7. В случае летального исхода забирают секционный материал - ткани головного, спинного и продолговатого мозга и варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной стенки. При необходимости исследуют другие материалы (например, ткань сердечной мышцы, печени, легких). Ткани берут как можно раньше после смерти в заранее намеченном порядке для предотвращения их контаминации содержимым желудка и кишечника. Для иссечения тканей используют набор стерильных инструментов для каждой пробы. Рекомендуемый объем пробы (кусочка) из тканей центральной нервной системы составляет 1 см ³. Из толстой кишки иссекается сегмент длиной 3 - 5 см, содержащий фекальные массы. Каждая проба помещается в отдельный стерильный пластиковый флакон 0,9 % раствора натрия хлорида.

Для каждого органа берут 3 - 5 проб для возможности подтверждающего исследования.

Пробы немедленно отправляют в лабораторию с соблюдением холодового режима. Если отправка проб в лабораторию задерживается, их помещают в холодильник при температуре 4 - 8 °C. Если время до отправки превышает 24 часа пробы замораживают и соблюдают эти условия во время транспортировки. Сыворотки без добавления консервантов хранят при температуре 4 °C или в замороженном виде.

1.8. Транспортировку осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁴².

------------------------------

⁴²Глава IV, пункты 2545 - 2571 главы XXXII СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

При транспортировке материалов в лабораторию соблюдают принцип "тройной упаковки":

1) первичная емкость - маркированный контейнер/пробирка/флакон с пробой, надежно закрытая крышкой;

2) вторичная емкость - прочный водонепроницаемый, не протекающий контейнер (или полиэтиленовый пакет) с поглощающим материалом в достаточном количестве для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Во вторичную емкость помещают контейнер/пробирку/флакон с пробой. Образцы от одного пациента упаковываются отдельно. Направление на исследование, в котором указано ФИО, возраст и адрес проживания больного, дата начала заболевания, дата отбора материала, предварительный клинический диагноз, дата последней иммунизации против полиомиелита, учреждение, направляющее материал и его контактные данные, помещают в полиэтиленовый пакет и надежно закрепляют на вторичной емкости;

3) внешняя упаковка - прочный термоизолирующий контейнер или термос. Для обеспечения температурных условий, в термоконтейнеры помещают охлаждающие элементы или пакеты со льдом. На внешней поверхности термоконтейнера укрепляют этикетку с указанием адреса, телефона, факса, электронной почты отправителя, адреса, телефона, факса, электронной почты получателя, условий транспортировки и знак биологической опасности.

Перед отправкой материалов отправитель информирует получателя о планируемой отправке и ее сроках. Недопустимо отправлять материалы без предварительной договоренности с получателем.

Выявление и идентификация геномных последовательностей НПЭВ

2.1. Детекция РНК НПЭВ с помощью МАНК.

Применение МАНК рекомендовано при:

- решении рутинных задач клинической диагностики;

- проведении исследований образцов материала, собранного при развитии вспышек ЭВИ;

- при осуществлении эпидемиологического надзора за ЭВ как элемента скрининга в сочетании с методиками молекулярного генотипирования ЭВ и (или) вирусологическими исследованиями;

- в случае применения генотипоспецифических тест-систем - осуществление оперативного надзора за НПЭВ определенных серотипов, ассоциированными со вспышками и тяжелыми формами ЭВИ (например, EV-A71).

Проведение молекулярно-диагностических работ осуществляют в соответствии с методическими документами ⁴³.

------------------------------

⁴³МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащем микроорганизмы I - IV групп патогенности", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009.

------------------------------

Для детекции РНК НПЭВ используют тест-системы на основе МАНК, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке ⁴⁴. Проведение и интерпретация результатов реакции выполняют в соответствии с инструкцией производителя.

------------------------------

⁴⁴Статья 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации"; Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

------------------------------

При обнаружении РНК полиовирусов нативный материал направляют в Региональный центр эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП ⁴⁵.

------------------------------

⁴⁵Пункт 2456 главы XXXII СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Разрешенные к применению тест-системы на основе МАНК для идентификации отдельных типов НПЭВ (например, EV-A71) могут быть использованы для мониторинга циркуляции энтеровирусов и диагностических целей.

Определение типа НПЭВ методом секвенирования

3.1. Молекулярное типирование НПЭВ основано на определении нуклеотидной последовательности области генома, кодирующей белок капсида VP1. Проведение субтипирования НПЭВ методом амплификации и прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей VP1 региона обладает высокими показателями специфичности ⁴⁶.

------------------------------

⁴⁶МР 4.2.0327-23.

------------------------------

Установленную нуклеотидную последовательность идентифицируют путем сравнения с имеющимися в банке NCBI последовательностями прототипных ЭВ человека, используя программное обеспечение BLAST ⁴⁷.

------------------------------

⁴⁷ Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (в свободном доступе).

------------------------------

При невозможности проведения молекулярного типирования НПЭВ на местах обращаются в Референс-центр по мониторингу ЭВИ, а также Дальневосточный и Урало-Сибирский региональные научно-методические центры по изучению ЭВИ ⁴⁸.

------------------------------

⁴⁸Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 N 1116 "О совершенствовании системы мониторинга и лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации"; приказ Роспотребнадзора от 19.12.2016 N 1236.

------------------------------

Показания к направлению материала для генотипирования НПЭВ:

- эпидемический подъем заболеваемости ЭВИ;

- локальная вспышка/групповое заболевание ЭВИ или с подозрением на ЭВИ;

- тяжелые, атипичные, летальные случаи с подозрением на ЭВИ;

- образцы, содержащие ЭВ-А71 или другие редко встречающиеся НПЭВ.

Нетипируемые в культуре клеток ЦПА, некультивирующиеся ПЦР(+) НПЭВ направляют для типирования методом секвенирования по эпидпоказаниям.

На исследование методом секвенирования направляют следующий материал, содержащий НПЭВ:

- кДНК генома НПЭВ;

- изоляты, выделенные на культуре клеток;

- пробы нативного материала (фекалии или их суспензии, мазки из ротоглотки, ЦСЖ, содержимое везикул, аутопсийный материал, пробы из объектов окружающей среды).

Вируссодержащие образцы, отобранные с целью мониторинга циркуляции, направляются в Референс-центр по мониторингу ЭВИ, Дальневосточный и Урало-Сибирский региональные научно-методические центры по изучению ЭВИ по предварительному согласованию (количество и вид направляемого материала).

Материал в обязательном порядке сопровождают направлением учреждения и прилагают список образцов, в котором указывают:

- для клинического образца: лабораторный номер образца, возраст, диагноз с указанием синдрома, дату заболевания, вид и дату забора материала, данные эпидситуации (вспышка или спорадический случай, выезд за пределы субъекта проживания);

- для объектов окружающей среды: лабораторный номер образца вид (например, вода сточная, питьевая), место и дату забора материала.

Для всех образцов, исследованных методом ПЦР в реальном времени, указывают значение Ct. Как правило, исследование образцов с Ct > 32 нецелесообразно из-за низкой чувствительности метода молекулярного типирования.

Подготовка проб для исследования в культуре клеток ⁴⁹

------------------------------

⁴⁹ ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы (англ. WHO. Polio Laboratory Manual. 4th ed. 2004 - iris.who.int (в свободном доступе) (далее - ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004).

------------------------------

4.1. Пробы фекалий. Готовят 10 - 20 % суспензию фекалий в сбалансированном солевом растворе (далее - ФСБ) с антибиотиками. Пробы обрабатывают хлороформом для удаления бактериального и грибкового загрязнения, токсичных липидов, диссоциации вирусных агрегатов.

В маркированную центрифужную пробирку последовательно добавляют 10 мл ФСБ, 5 г стеклянных бус и 0,5 мл хлороформа. Вносят примерно 2 г фекальной пробы, плотно закрывают пробирку и интенсивно встряхивают в течение 20 мин. Центрифугируют с охлаждением в течение 20 мин при 1500 g. Надосадочную жидкость отбирают для исследования.

4.2. Ватные тампоны с содержимым везикул. Тампоны встряхивают в транспортировочной среде для высвобождения клеточного материала, избегая образования аэрозолей. Полученную суспензию обрабатывают хлороформом, как описано выше.

4.3. Пробы ЦСЖ используют для исследования без дополнительной обработки. Если проба мутная, ее осветляют центрифугированием при 1600 - 2000 g в течение 10 мин.

4.4. Тканевые пробы. Готовят 10 - 20 % тканевую суспензию. Ткани растирают в стерильной ступке, добавляя при необходимости стерильный песок и небольшое количество транспортировочной среды. Суспензию осветляют центрифугированием при 1600 - 2000 g в течение 10 мин.

4.5. Сыворотка крови. Пробы крови помещают в стерильные пробирки без антикоагулянтов или консервантов. Пробы оставляют при комнатной температуре на 2 часа для свертывания крови. После образования сгустка его отделяют от стенки сосуда стерильной пастеровской пипеткой, пробу помещают в холодильник при температуре 4 - 8 °C и спустя 24 ч отделяют сыворотку от сгустка. Сыворотку осветляют центрифугированием на низкоскоростной центрифуге в течение 5 мин при 500 g и переносят в стерильный флакон стерильной пипеткой. В некоторых случаях (отсутствие центрифуги, большое количество проб) центрифугирование можно заменить осторожным отсасыванием сыворотки стерильной пипеткой. Во всех случаях следует предотвращать попадание в сыворотку эритроцитов, гемолиз которых влияет на результаты серологических исследований.

Выделение и идентификация НПЭВ на культуре клеток

5.1. Универсальной культуры клеток (или культуральной системы), пригодной для выделения всех НПЭВ, не существует. Ряд штаммов НПЭВ могут быть выделены только in vivo с использованием чувствительных лабораторных животных. Обобщенные сведения о чувствительности наиболее распространенных перевиваемых культур клеток к различным НПЭВ представлены в таблице 1.

Таблица 1

Чувствительность перевиваемых культур клеток к различным НПЭВ

Вирусы	Проявление цитопатогенного эффекта на культуре клеток
	RD	Hep-2	L20B	BGM
Е (ECHO)	+	-	-
CVA	за исключением не размножающихся A1, А19, А22		(CVA 2-6, 8, 10, 14)
CVB		+	-	+
EV-D68-71		-	-

Эффективность исследования материала зависит от состояния клеточных культур: высокая чувствительность к энтеровирусам, аутентичность, стабильность, свободны от загрязнения микроорганизмами (простейшими, бактериями, грибами, дрожжами, микоплазмами, вирусами). Культуры клеток получаются из аттестованного официального источника ⁵⁰.

------------------------------

⁵⁰ ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

------------------------------

Выделение НПЭВ на культуре ткани проводят в соответствии с методическими документами ⁵¹.

------------------------------

⁵¹МУК 4.2.2410-08 "Организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП)", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 28.07.2008; МУК 4.2.2357-08 "Организация и проведение вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполно) энтеровирусы", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 04.05.2008.

------------------------------

Энтеровирусы идентифицируют в реакции нейтрализации инфекционности с помощью диагностических типоспецифических иммунных сывороток. В опыте по нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД ₅₀, смешивают в равном объеме с диагностическими сыворотками. Инкубируют в течение 1 ч при температуре плюс 36 °C, вносят суспензию культуры клеток, вновь помещают в термостат. Наблюдение (микроскопирование) проводят ежедневно, начиная со второго дня после заражения. Наблюдение продолжают до 7 дней под контролем состояния культуры клеток.

Иммунная сыворотка, которая предотвращает развитие ЦПЭ, указывает на тип вируса.

Серологический метод исследования

6.1. Определение уровня нейтрализующих антител проводят в реакции нейтрализации инфекционности с штаммом НПЭВ соответствующего серотипа.

Для эпидемиологических исследований достаточно одной пробы сыворотки от каждого обследуемого; для получения репрезентативных результатов важен правильный отбор обследуемых лиц и компоновка групп. Реакция нейтрализации выполняется в соответствии с руководством ⁵² по лабораторным исследованиям.

------------------------------

⁵² ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

------------------------------