Приложение D (обязательное). Методы сбора, подготовки и консервации биологического материала

Приложение D
(обязательное)

Методы сбора, подготовки и консервации биологического материала

Таблица D.1 - Рекомендации, требования и информация по сбору, подготовке и/или консервации собранного биологического материала

Тип биологического материала				Метод	Рекомендации и требования
Твердая ткань				Замораживание жидким азотом	Перед замораживанием в жидком азоте может потребоваться препарирование сложных органов. Биологический материал может быть: - разделен на образцы; - изолирован для дальнейшего выделения типов клеток методом лазерной микродиссекции. Для консервации целевых аналитов для последующего анализа биологический материал может быть заморожен в жидком азоте
				Консервация в защитном растворе	Для поддержания стабильности биологического материала допускается использовать консервирующие среды [например, этанол, диметилсульфоксид (ДМСО), изотонический раствор, коммерческие жидкости]. Выбор среды для консервирования должен быть соответствующим и не должен оказывать отрицательного влияния на пригодность материала для использования по назначению. При замораживании тканей в жидкости биобанк должен ограничить объем защитного раствора для компенсации увеличения объема. Биобанк должен минимизировать размер и/или толщину ткани (например, менее 5 мм) для полного проникновения защитного раствора
				Выделение клеток	Перед использованием (например, для проточной цитометрии, анализа одиночных клеток) ткани должны быть диссоциированы с целью выделения клеток механически и/или ферментативно. Выделенные клетки могут быть криоконсервированы для будущего использования с помощью защитного раствора, подходящего для типа(ов) ткани, если это целесообразно. Требования и методы по выделению и культивированию клеток приведены в ИСО 21709
				Выделение нуклеиновых кислот и белков	Преаналитические процедуры для выделения ДНК, РНК или белка из тканей, фиксированных в формалине и парафинированных (FFPE) и замороженных тканей приведены в ИСО 20166-1, ИСО 20166-2 и ИСО 20166-3, ИСО 20184-1, ИСО 20184-2 и ИСО 20184-3
Зародышевая плазма	Эмбрионы		-		Эмбрионы (включая предимплантационные эмбрионы) должны быть законсервированы, а также храниться и оживляться в соответствии с документированными протоколами. При этом используемые методы должны соответствовать типу биологического материала, виду и предполагаемой цели. Биобанк должен вносить в документацию данные о генетическом происхождении, этапе, сведения из протоколов консервации и оживления, а также количестве эмбрионов
	Ооцит, сперма		-		Ооцит или сперма должны быть законсервированы, а также храниться и оживляться в соответствии с документированными протоколами. Методы должны соответствовать типу биологического материала, виду и предполагаемой цели
Фекальный материал	ДНК		Выделение ДНК		Для фекального материала, собранного в различное время и предназначенного для выделения ДНК, следует рассмотреть возможность немедленной частичной обработки (например, замораживание после лизиса клеток) для обеспечения временного сохранения биологического материала для выделения ДНК партиями в дальнейшем. Свежие фекалии следует собирать в стерильные криопробирки с завинчивающимися крышками и немедленно заморозить, при применении пункта 5.2.6 b). Если используют консервирующий раствор, то его следует удалить центрифугированием перед окончанием срока хранения и перед процедурой выделения ДНК. Если образцы откалибровать до заданного веса непосредственно перед началом замораживания, то это значительно облегчит дальнейшую обработку биологического материала. Для фекалий небольшого размера следует собирать весь фекальный материал
Моча и молоко				Разделение, консервация	Для сохранения целостности мочу следует консервировать или обрабатывать при температуре от 2 °С до 8 °С в течение 24 ч после сбора. Для сохранения целостности молоко следует консервировать или обрабатывать при температуре от 2 °С до 8 °С в течение 4 ч после сбора. Моча и молоко могут содержать клеточные и другие компоненты, которые необходимо удалить перед аликвотированием и хранением. Для отделения клеток и любых загрязнений допускается использование центрифугирования. Для консервирования мочи допускается использование консервантов (например, ЭДТА, метабисульфит натрия). На выбор способа консервации (например, подкисления) могут влиять метод планируемого анализа биологического материала, продолжительность транспортирования и условия (например, окружающей среды, хранения), в зависимости от предполагаемой цели
Кровь		Цельная кровь		Консервация с использованием добавок	Перед обработкой и консервацией образцы цельной крови допускается выдерживать при температуре от 2 °С до 8 °С в течение короткого времени. Перед фракционированием крови допускается использовать добавки (например, маннитол, сорбитол, полиэтиленгликоль, ЭДТА) для уменьшения гемолиза. Если фракционирование крови не требуется, образцы цельной крови следует разделить на аликвоты и хранить при температуре, соответствующей предполагаемой цели (например, для выделения РНК или ДНК при температуре ниже - 70 °С). См. ИСО 20186-1 для получения информации о выделении клеточной РНК и ИСО 20186-2 - о выделении геномной ДНК
		Производные крови		Фракционирование крови	Фракционирование крови допускается проводить перед консервацией для выделения определенных типов клеток (например, лимфоцитов). Цельная кровь, собранная для выделения сыворотки, перед центрифугированием должна быть выдержана в течение 30-60 минут при температуре, обеспечивающей свертывание крови. Для минимизации разрушения рекомендуется центрифугировать цельную кровь при температуре от 2 °С до 8 °С в течение 2 ч после сбора. Биобанк может отделить эритроциты с ядрами (например, в образцах крови птиц и рыб) от плазмы/сыворотки путем центрифугирования цельной крови и использовать криоконсерванты (например, 50 %-ный раствор глицерина) для минимизации разрыва клеток во время замораживания-размораживания. Любые отделенные фракции (например, сыворотка, плазма, лейкоцитная пленка) должны быть аспирированы непосредственно после процедуры центрифугирования. При необходимости выделение лимфоцитов следует проводить в течение 24 ч после сбора крови. См. ИСО 20186-3 для получения информации о выделении циркулирующей внеклеточной ДНК из плазмы
Перья				Очистка	Мусор и органические вещества следует удалить с перьев (например, с помощью вакуума с малой мощностью всасывания и слабых растворителей, таких как изопропанол)
Материал плавника				-	Плавниковый материал допускается консервировать в контейнерах с добавками, которые не оказывают негативного влияния на пригодность материала для использования по назначению (например, 80 %-ный этанол для экстракции ДНК)
Чешуя				-	Чешую допускается консервировать в контейнерах с добавками, которые не оказывают негативного влияния на пригодность материала для использования по назначению (например, 95 %-ный неденатурированный этанол). В качестве альтернативы, свежую чешую допускается консервировать между слоями фильтровальной бумаги, высушивать в прохладном вентилируемом месте и хранить в условиях низкой влажности при температуре окружающей среды
Мазки со слизистой оболочки				-	Мазки со слизистой оболочки следует высушить на воздухе или консервировать с использованием добавки, в зависимости от предполагаемой цели (например, выделение и анализ ДНК), и хранить при комнатной температуре
Яичный альбумин				-	Центрифугирование и аспирацию или фильтрацию яичного альбумина допускается использовать для выделения глобулинов и растворимого альбумина. Другие белки в яичном альбумине могут быть кристаллизованы или отделены в зависимости от их уникальных характеристик
Волосы и когти				Выделение ДНК	Материал волос и когтей для выделения ДНК допускается временно хранить при комнатной температуре в сухом помещении до транспортирования в биобанк. Для длительного хранения материал волос или когтей до анализа следует хранить при температуре - 70 °С