Межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14152-2020 "Продукция пищевая. Определение содержания витамина B2 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 апреля 2024 г. N 535-ст) (документ не вступил в силу)

Межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14152-2020
"Продукция пищевая. Определение содержания витамина B ₂ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 апреля 2024 г. N 535-ст)

Foodstuffs. Determination of vitamin B ₂ by high performance liquid chromatography

УДК 664:543.544:006.354
МКС 67.050
IDT

Дата введения - 1 ноября 2024 г.
с правом досрочного применения
Взамен ГОСТ EN 14152-2013 ^*

------------------------------

^* Отменяется ГОСТ 25999-83 "Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов B1 и B2" (в части раздела 3) с момента введения в действие настоящего стандарта.

------------------------------

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2020 г. N 131-П)

За принятие стандарта проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	ЗАО "Национальный орган по стандартизации и метрологии" Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Кыргызстан	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 апреля 2024 г. N 535-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 14152-2020 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 ноября 2024 г. с правом досрочного применения

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 14152:2014 "Продукты пищевые. Определение витамина B ₂ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" ("Foodstuffs - Determination of vitamin B ₂ by high performance liquid chromatography", IDT).

Европейский стандарт разработан техническим комитетом по стандартизации CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочного европейского стандарта соответствующий ему межгосударственный стандарт, сведения о котором приведены в дополнительном приложении ДА

6 Взамен ГОСТ EN 14152-2013 ^*

------------------------------

^* Отменяется ГОСТ 25999-83 "Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов B1 и B2" (в части раздела 3) с момента введения в действие настоящего стандарта.

------------------------------

Предупреждение - Применение настоящего стандарта может быть связано с проведением опасных операций, использованием вредных веществ, опасного оборудования. В задачи настоящего стандарта не входит решение всех вопросов безопасности, связанных с его применением. Ответственность за соблюдение техники безопасности и установление необходимых ограничений при применении настоящего стандарта несет его пользователь.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания витамина B ₂ в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и флуоресцентного детектирования. Данный метод был валидирован в двух межлабораторных исследованиях. В первом исследовании проводился анализ проб сухого молока и свиной печени в пределах от 1,45 до 10,68 мг/100 г. Во втором исследовании анализировали пробы раствора для энтерального питания, пищевой продукции для детского питания, сухого молока, цельнозерновой муки с фруктами, дрожжей, продуктов переработки зерна, шоколадного порошка в диапазоне от 0,21 до 87,10 мг/100 г. Содержание витамина B ₂ представляет собой массовую долю общего рибофлавина, включая его фосфорилированные производные.

Для получения более подробной информации о валидации см. раздел 8 и приложение B.

2 Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

3 Сущность метода

Рибофлавин извлекают из пищевой продукции путем кислотного гидролиза с последующим дефосфорилированием, используя ферментативную обработку, и определяют его количество методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. Для количественной оценки используют метод внешнего стандарта. Для получения дополнительной информации см. [1]-[11].

4 Реактивы

Для проведения анализа, если не указано иное, используют только реактивы признанной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по EN ISO 3696 или бидистиллированную воду.

4.1 Метанол для ВЭЖХ, массовая доля w(CH ₃OH)  99,8 %.

4.2 Натрия ацетат тригидрат, w(CH ₃COONa  3H ₂O) = 99 %.

4.3 Раствор ацетата натрия, молярная концентрация c(CH ₃COONa  3H ₂O) = 0,1 моль/дм ³.

4.4 Раствор ацетата натрия, c(CH ₃COONa  3H ₂O) = 2,5 моль/дм ³.

4.5 Ледяная уксусная кислота, w(CH ₃COOH) = 99,8 %.

4.6 Раствор уксусной кислоты, c(CH ₃COOH) = 0,02 моль/дм ³.

4.7 Раствор соляной кислоты, w(HCl) = 36 %.

4.8 Раствор соляной кислоты, c(HCl) = 0,1 моль/дм ³.

4.9 Раствор соляной кислоты, c(HCl) = 0,01 моль/дм ³.

4.10 Раствор серной кислоты, c(H ₂SO ₄) = 0,05 моль/дм ³.

4.11 Раствор гидроксида натрия, w(NaOH)  99 %.

4.12 Раствор гидроксида натрия, c(NaOH) = 0,5 моль/дм ³.

4.13 Оксид фосфора, w(P ₂O ₅) = 98 %.

4.14 Фермент или смесь ферментов, способные высвобождать витамин B ₂ из пищевой продукции в виде свободного рибофлавина.

П р и м е ч а н и е 1 - Для получения прецизионных данных, указанных в таблице B.1, была использована така-диастаза, произведенная компанией Pfaltz and Bauer ¹⁾. Для получения прецизионных данных, указанных в таблицах B2 и B.3, была использована смесь -амилазы из ячменя и така-диастазы, произведенной Serva ¹⁾.

------------------------------

¹⁾ Информация о поставщиках така-диастазы Pfaltz & Bauer, Уотербери, СТ 06708, США (N Т00040), и Serva приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции. Допускается использовать аналогичную продукцию при условии обеспечения идентичных результатов.

------------------------------

4.15 Подвижные фазы ВЭЖХ

Примеры соответствующих смесей с объемными долями метанола (см. 4.1) от 10 % до 50 % в воде или использования фосфатного или ацетатного буфера представлены в приложениях A, C. Также представлен вариант подвижной фазы с использованием ион-парного реагента.

4.16 Фосфатный буфер (pH 3,5), c(KH ₂PO ₄) = 9,0 ммоль/дм ³.

4.17 Тетраэтиламмоний хлорид, w(C ₈H ₂₀NCl)  98 %.

4.18 Натрия гептансульфонат, w(C ₇H ₁₅NaO ₃S)  98 %.

4.19 Стандартные вещества

4.19.1 Рибофлавин, w(C ₁₇H ₂₀N ₄O ₆) = 98 %.

Витамин B ₂ в виде рибофлавина может быть получен от различных поставщиков, поэтому степень его чистоты может различаться. В связи с этим необходимо определять концентрацию градуировочного раствора методом УФ-спектрометрии (см. проверку концентрации 4.20.3).

4.19.2 Рибофлавин-5'-фосфат натрия, w(C ₁₇H ₂₀N ₄NaO ₉P) = 95 %.

Соль рибофлавин-5'-фосфат натрия (для проверки фермента и времени удерживания на хроматограмме).

4.20 Основные растворы

4.20.1 Меры предосторожности

Витамин B ₂ является очень чувствительным к свету. Поэтому необходимо защитить витамин B ₂ и соответствующие растворы в течение всей процедуры подготовки проб, например, посредством использования посуды из темного стекла.

4.20.2 Основной раствор рибофлавина, M = 376,36, (C ₁₇H ₂₀N ₄O ₆)  100 мкг/см ³.

Взвешивают около 50 мг стандартного вещества рибофлавина (см. 4.19.1) с точностью до 1 мг, которое было предварительно высушено и хранилось в темноте в эксикаторе под вакуумом и/или заполненном оксидом фосфора (см. 4.13), помещают в мерную колбу из темного стекла вместимостью 500 см ³ и растворяют в растворе уксусной кислоты (см. 4.6). Полученный раствор хранят в темноте при температуре 4 °C в течение двух месяцев.

Рибофлавин труднорастворим. Для облегчения его растворения в мерную колбу со стандартным веществом рибофлавина вносят около 300 см ³ раствора уксусной кислоты (см. 4.6) и выдерживают колбу на водяной бане при постоянном перемешивании до полного растворения рибофлавина, затем раствор охлаждают и объем содержимого колбы доводят до метки раствором уксусной кислоты (см. 4.6). В качестве альтернативы в мерную колбу вместимостью 500 см ³ со стандартным веществом рибофлавина вносят 5 см ³ раствора гидроксида натрия (см. 4.12). Поскольку рибофлавин нестабилен в щелочной среде, сразу же после его растворения в колбу вносят 1,5 см ³ ледяной уксусной кислоты (см. 4.5), после чего объем содержимого колбы доводят до метки раствором уксусной кислоты (см. 4.6) или другой соответствующей кислотой. Точную концентрацию свежеприготовленного основного раствора рибофлавина и при необходимости хранившегося следует определять (см. 4.20.3).

4.20.3 Определение точной концентрации основного раствора рибофлавина

В мерной колбе вместимостью 200 см ³ смешивают 20 см ³ основного раствора рибофлавина (см. 4.20.2) с 3,5 см ³ раствора ацетата натрия (см. 4.3) и объем содержимого колбы доводят до метки водой. Для подготовки холостого раствора в мерной колбе вместимостью 200 см ³ смешивают 20 см ³ раствора уксусной кислоты (см. 4.6) с 3,5 см ³ ацетата натрия (см. 4.3) и объем содержимого колбы доводят до метки водой. Данные растворы используют для спектрометрического измерения.

Измеряют оптическую плотность раствора рибофлавина на спектрометре (см. 5.1) при длине волны 444 нм (A ₄₄₄) в кювете с длиной оптического пути 1 см, используя холостой раствор в качестве раствора сравнения. Рассчитывают массовую концентрацию основного раствора рибофлавина (см. 4.20.2) , мкг/см ³, по формуле

,

(1)

где - молярный коэффициент поглощения рибофлавина при максимальной длине волны приблизительно 444 нм,  = 12 340 дм ³·моль ^-1·см ^-1. Данное значение рассчитывается исходя из коэффициента экстинкции  = 328 в ацетатном буфере (pH = 3,8) при 444 нм [9] и молярной массы M = 376,36. Значение округляют до четырех значащих цифр;

M - молярная масса, г/моль. Значение равно 376,36;

A ₄₄₄ - значение оптической плотности раствора рибофлавина.

4.21 Стандартные растворы

4.21.1 Стандартный раствор рибофлавина, (C ₁₇H ₂₀N ₄O ₆)  10 мкг/см ³.

Готовят разведение 1:10 основного раствора рибофлавина (см. 4.20.2). Переносят пипеткой 10 см ³ основного раствора рибофлавина в мерную колбу из темного стекла вместимостью 100 см ³ и объем содержимого колбы доводят до метки раствором уксусной кислоты (см. 4.6) или другим подходящим растворителем. Используют свежеприготовленный раствор.

4.21.2 Стандартный аналитический раствор рибофлавина, (C ₁₇H ₂₀N ₄O ₆)  от 0,1 до 1 мкг/см ³.

В мерную колбу из темного стекла вместимостью 100 см ³ переносят пипеткой от 1,0 до 10,0 см ³ стандартного раствора (см. 4.21.1) и объем содержимого колбы доводят до метки подвижной фазой (см. 4.15). Используют свежеприготовленный раствор.

5 Оборудование

Используют стандартное лабораторное оборудование, стеклянную посуду, в том числе оборудование, перечисленные ниже:

5.1 УФ-спектрометр, пригодный для измерения оптической плотности при определенной длине волны (444 нм) с соответствующими кюветами с длиной оптического пути 1 см.

5.2 Автоклав или нагревательный прибор, автоклав, предназначенный для экстракции, например электрического типа, работающий под давлением, со считывающим устройством давления или температуры, плитка электрическая или водяная баня.

5.3 Система ВЭЖХ

Система ВЭЖХ состоит из насоса, устройства для ввода проб, флуоресцентного детектора с длиной волны возбуждения и эмиссии, установленных на уровнях 468 и 520 нм соответственно (см. приложение C), а также устройства для обработки данных, например интегратора.

5.4 Колонка для ВЭЖХ

Аналитическая колонка для обращенно-фазовой хроматографии, например диаметром от 4,0 до 4,6 мм, длиной от 100 до 250 мм, размер частиц от 3 до 10 мкм. Также могут использоваться другие системы (см. приложение C) при условии обеспечения приемлемой степени отделения пика рибофлавина от пиков сопутствующих компонентов матрицы пробы.

Допускается использовать колонку других размеров, заполненную сорбентом с размером частиц, отличным от указанных в настоящем стандарте. Условия хроматографического разделения подбирают применительно к используемой колонке для обеспечения сопоставимости результатов анализов.

5.5 Фильтровальное устройство

Фильтрация подвижной фазы, а также раствора анализируемой пробы через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм до использования или ввода проб продлевает срок службы колонок.

6 Методика проведения испытания

6.1 Меры предосторожности

Витамин B ₂ является очень чувствительным к свету. Необходимо предпринимать меры, чтобы защитить витамин B ₂ и соответствующие растворы в течение всей процедуры подготовки проб, например, посредством использования посуды из темного стекла.

6.2 Подготовка анализируемой пробы

Гомогенизируют анализируемую пробу. Твердую продукцию измельчают в соответствующей мельнице и перемешивают. Перед измельчением пробу рекомендуется охладить, чтобы не подвергать ее воздействию высоких температур в течение длительного времени.

6.3 Подготовка раствора анализируемой пробы

6.3.1 Экстракция

В мерном стакане или конической колбе взвешивают от 2 до 10 г анализируемой пробы с точностью до 1 мг. Добавляют определенный объем от 50 до 200 см ³ раствора соляной (см. 4.8) или серной кислоты (см. 4.10). Значение pH раствора не должно быть выше 2,0. Накрывают колбу предметным стеклом и автоклавируют пробу для испытания при температуре 121 °C в течение 30 мин или нагревают ее при температуре 100 °C в течение 60 мин.

Исследования, проводимые Европейским бюро стандартов (BCR), показали, что можно применять обширный диапазон условий для кислотного гидролиза (температура от 95 °C до 130 °C, продолжительность от 15 до 60 мин), при этом чем выше температура, тем меньше продолжительность гидролиза. Тем не менее длительное нагревание рибофлавина и рибофлавина-5'-фосфата натрия может вызвать потери. Испытания показали, что, в частности, для пищевой продукции, содержащей шоколад, эффективность экстракции снижается, если значение pH раствора выше 2.

6.3.2 Ферментативная обработка

После охлаждения до комнатной температуры к экстракту добавляют раствор ацетата натрия (см. 4.4) до достижения значения pH, оптимального для действия предполагаемого к использованию фермента, и подходящее количество дефосфорилирующего фермента (см. 4.14). Инкубируют полученную смесь в течение промежутка времени и при температуре, оптимальных для используемого фермента или смеси ферментов. После охлаждения до комнатной температуры переносят раствор в мерную колбу, используя раствор уксусной кислоты (см. 4.6) или другой соответствующий растворитель, и доводят раствор анализируемой пробы до заданного объема V _E.

Для каждого используемого фермента необходимо установить оптимальное значение pH, оптимальные продолжительность и температуру инкубирования.

Для установления оптимальных условий дефосфорилирования проводят процедуру ферментативной обработки проб с добавленным известным количеством рибофлавин-5'-фосфат натрия (см. 4.19.2), а также проб, аналогичных исследуемой пробе по составу матрицы и являющихся аттестованными образцами сравнения.

Количество рибофлавина, внесенное с ферментом, должно учитываться при расчете результата.

П р и м е ч а н и е - Для определения прецизионности результатов испытаний, указанных в таблицах B.1, B2 и B.3, для дефосфорилирования использовали така-диастазу (см. таблицу B.1) и смесь така-диастазы и -амилазы из ячменя (см. таблицу B2 и таблицу B.3) при следующих условиях. Значение pH экстракта довели раствором ацетата натрия (см. 4.4) до 4,0 и 4,5 соответственно и добавили 100 мг така-диастазы и 10 мг -амилазы на грамм пробы. Смесь инкубировали при температуре от 37 °C до 45 °C в течение от 4 до 24 ч, см. [9], [10], [13].

6.3.3 Раствор анализируемой пробы

При необходимости раствор анализируемой пробы (см. 6.3.2) фильтруют через фильтровальную бумагу или мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или центрифугируют на подходящем g уровне.

При необходимости разбавляют аликвоту V _a определенным объемом V смеси растворителя, совместимого с системой элюирования ВЭЖХ. Например, 1,0 см ³ экстракта (см. 6.3.2) разбавляют 1,0 см ³ метанола (см. 4.2.1). Полученный раствор является раствором анализируемой пробы для анализа ВЭЖХ.

6.4 Идентификация

В систему ВЭЖХ вводят одинаковые соответствующие объемы стандартных растворов, а также растворов анализируемой и холостой проб. Идентифицируют рибофлавин путем сравнения времени удерживания индивидуальных пиков на хроматограммах раствора анализируемой пробы и стандартного раствора. Идентификация пиков также может быть выполнена путем добавления определенного количества стандартного вещества в раствор анализируемой пробы.

П р и м е ч а н и е - Ниже приведены условия хроматографического анализа, которые обеспечивают удовлетворительное качество хроматографического разделения и количественного определения (см. рисунок A.1). Для информации об альтернативных системах ВЭЖХ см. таблицу C.1.

Колонка:	Supelco LC-18-DB 2), 5 мкм, 250  4,6 мм.
Подвижная фаза:	метанол (см. 4.1): фосфатный буфер pH 3,5 (см. 4.16), содержащий 1 г/дм 3 тетраэтиламмония хлорида (см. 4.2.17) и 5 ммоль/дм 3 натрия гептансульфоната (см. 4.18) (35:65).
Скорость потока:	1,0 см 3/мин.
Объем введенной пробы:	20 мм 3.
Детектор:	флуориметрический: длина волны возбуждения 468 нм, длина волны эмиссии 520 нм.

------------------------------

²⁾ Supelco LC-18-DB - пример подходящей продукции, имеющейся в продаже. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой CEN указанной продукции.

------------------------------

6.5 Определение

В систему ВЭЖХ вводят равные соответствующие объемы (до 100 мм ³) раствора рибофлавина (см. 4.21.2) ^*, а также раствора анализируемой пробы (см. 6.3.3). Для выполнения количественного определения методом внешнего стандарта интегрируют площади пиков или определяют высоты пиков пробы, результаты сравнивают с соответствующими значениями стандартного раствора.

------------------------------

^* Исправлена ошибка, допущенная в EN 14152:2014: заменена ссылка "4.20.2" на "4.21.2".

------------------------------

Проверяют линейность градуировочной зависимости.

7 Вычисление

Результат определения вычисляют, используя градуировочный график, или соответствующие программы системы обработки данных, или приведенный ниже упрощенный способ вычисления. Рассчитывают массовую долю витамина B ₂ w, мг/100 г пробы, по формуле

,

(2)

где A _S - площадь или высота пика рибофлавина на хроматограмме раствора анализируемой пробы (см. 6.3.3), выраженные в единицах площади или высоты;

A _ST - площадь или высота пика рибофлавина на хроматограмме раствора рибофлавина (см. 4.21.2) ^*, выраженные в единицах площади или высоты;

V - общий объем раствора анализируемой пробы (см. 6.3.3), см ³;

V _E - объем экстракта пробы (см. 6.3.2), см ³;

V _A - объем аликвоты, используемый для разбавления (см. 6.3.3), см ³;

- массовая концентрация рибофлавина в растворе рибофлавина (см. 4.21.2) ^*, мкг/см ³;

m _S - масса пробы, г;

1 000 - коэффициент пересчета микрограммов в миллиграммы;

100 - коэффициент пересчета массовой доли на 100 г;

E - массовая доля рибофлавина, присутствующего в ферменте, мг/100 г;

m _E - масса фермента, используемого в анализе, г;

Результат определения содержания витамина B ₂, мг/100 г, представляют в пересчете на рибофлавин.

8 Прецизионность

8.1 Общие положения

Данные прецизионности для метода частично основываются на данных различных методов ВЭЖХ, применяемых для определения рибофлавина в ходе международного сравнительного исследования, организованного Европейской комиссией в рамках Программы стандартных измерений и испытаний на пробах цельнозерновой муки (CRM 121), сухого молока/сухого молока, полученного методом распылительной сушки (CRM 421), смеси лиофилизированных овощей (CRM 485) и лиофилизированной свиной печени (CRM 487). Статистические данные, полученные в ходе исследования, приведены в таблице B.1 приложения B. Кроме того, данные прецизионности включают результаты совместного французского исследования проб раствора для энтерального питания, пищевой продукции для детского питания с овощами, сухого молока, цельнозерновой муки с фруктами, дрожжей, продуктов переработки зерна, шоколадного порошка и биологически активной добавки к пище. Результаты, полученные в ходе исследования, приведены в таблицах B.2 и B.3.

8.2 Повторяемость

Абсолютная разность между двумя независимыми результатами испытаний, полученными при исследовании идентичного анализируемого материала одним и тем же оператором, использовавшим одно и то же оборудование в пределах самого короткого промежутка времени, не должна превышать предел повторяемости r более чем в 5 % случаев.

Значения для рибофлавина:

Сухое молоко	= 1,45 мг/100 г	r = 0,13 мг/100 г
Свиная печень	= 10,5 мг/100 г	r = 0,51 мг/100 г
Раствор для энтерального питания	= 0,21 мг/100 г
Детское питание с овощами	= 0,30 мг/100 г	r = 0,02 мг/100 г
Сухое молоко	= 1,13 мг/100 г	r = 0,08 мг/100 г
Цельнозерновая мука с фруктами	= 0,60 мг/100 г	r = 0,06 мг/100 г
Дрожжи	= 4,34 мг/100 г	r = 0,37 мг/100 г
Продукты переработки зерна	= 0,43 мг/100 г	r = 0,06 мг/100 г
Продукты переработки зерна	= 2,48 мг/100 г	r = 0,18 мг/100 г
Шоколадный порошок	= 1,26 мг/100 г	r = 0,14 мг/100 г
Биологически активная добавка к пище	= 87,1 мг/100 г	r = 9,5 мг/100 г

8.3 Воспроизводимость

Абсолютная разность между двумя независимыми результатами испытаний, полученными при исследовании идентичного анализируемого материала в двух лабораториях, не должна превышать предел воспроизводимости R более чем в 5 % случаев.

Значения для рибофлавина:

Сухое молоко	= 1,45 мг/100 г	R = 0,30 мг/100 г
Свиная печень	= 10,5 мг/100 г	R = 2,35 мг/100 г
Раствор для энтерального питания	= 0,21 мг/100 г	R = 0,02 мг/100 г
Детское питание с овощами	= 0,30 мг/100 г	R = 0,09 мг/100 г
Сухое молоко	= 1,13 мг/100 г	R = 0,27 мг/100 г
Цельнозерновая мука с фруктами	= 0,60 мг/100 г	R = 0,09 мг/100 г
Дрожжи	= 4,34 мг/100 г	R = 1,2 мг/100 г
Продукты переработки зерна	= 0,43 мг/100 г	R = 0,19 мг/100 г
Продукты переработки зерна	= 2,48 мг/100 г	R = 0,53 мг/100 г
Шоколадный порошок	= 1,26 мг/100 г	R = 0,37 мг/100 г
Биологически активная добавка к пище	= 87,1 мг/100 г	R = 16,6 мг/100 г

9 Протокол испытания

Протокол испытания должен соответствовать требованиям EN ISO/IEC 17025 [17] и содержать следующие данные:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;

c) дату и время отбора проб (если известно);

d) дату получения пробы;

e) дату проведения испытания;

f) результаты и единицы измерения, в которых выражены результаты;

g) любые особенности, которые наблюдались в ходе проведения испытания;

h) любые операции, не установленные в настоящем стандарте или рассматриваемые в качестве дополнительных, которые могли повлиять на результаты.

Библиография

[1]	LUMLEY I.D., WIGGINS R.A. Determination of riboflavin and flavin mononucleotide in foodstuffs using high-performance liquid chromatography and a column-enrichment technique. Analyst (Lond.). 1981, 106 pp. 1103-1108 (Определение рибофлавина и флавин-мононуклеотида в пищевой продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и метода колонного обогащения)
[2]	FINGLAS P.M., FAULKS R. М: Critical review of HPLC methods for the determination of thiamin, riboflavin and niacin in food. J. Micronutr. Anal. 1987, 3 pp. 251-283 (Критический обзор методов ВЭЖХ для определения тиамина, рибофлавина и ниацина в пищевой продукции)
[3]	BALL F.M. in g. F. M. Ball (Ed.): Water-Soluble Vitamin Assays in Food Analysis. Elsevier Applied Science, London, 1994, 237-246 (Химические анализы растворимых в воде витаминов при анализе пищевой продукции)
[4]	HASSELMANN C., FRANCK D., GRIMM P., DIOP P.A., SOULES C. High-performance liquid chromatographic analysis of thiamin and riboflavin in dietic foods. J. Micronutr. Anal. 1989, 5 pp. 269-279 (Высокоэффективный хроматографический анализ тиамина и рибофлавина в диетической пищевой продукции)
[5]	OLLILAINEN ISO MATTILA P., VARO P., KOIVISTOINEN ISO HUTTUNEN J. The HPLC determination of total riboflavin in foods. J. Micronutr. Anal. 1990, 8 pp. 199-207 (Определение общего содержания рибофлавина методом ВЭЖХ в пищевой продукции)
[6]	М., KUMPULAINEN J. Thiamin and riboflavin contents in domestic and imported cereal products in Finland. J. Food Compos. Anal. 1993, 6 pp. 299-306 (Содержание тиамина и рибофлавина в отечественных и импортируемых в Финляндию крупяных продуктах)
[7]	М. Effect of various commercially available enzymes in the liquid chromatographic determination with external standardization of thiamin and riboflavin in foods. J. AOAC Int. 1994, 77 pp. 681-686 (Влияние различных имеющихся в продаже ферментов в жидкостном хроматографическом определении с применением внешних стандартов тиамина и рибофлавина в пищевой продукции)
[8]	EITENMILLER R.R., LANDEN W.O. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C., 1999, pp. 271-297 (Анализ витаминов для валеологии и науки о продуктах питания)
[9]	FINGLAS P.M., SCOTT K.J., WITTHOFT C.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. The certification of the mass fractions of vitamins in four reference materials: Wholemeal flour (CRM 121), milk powder (CRM 421), lyophilised mixed vegetables (CRM 485) and lyophilised pig's liver (CRM 487). EUR-report 18320, Office for Official Publications of the European Communities, Luxembourg, 1999 (Сертификация массовых долей витаминов в четырех эталонных материалах: цельнозерновой муке (CRM 121), сухом молоке (CRM 421), смеси лиофилизированных овощей (CRM 485) и лиофилизированной свиной печени (CRM 487))
[10]	ARELLA F., S., BOURGUIGNON J.B., HASSELMANN C. Liquid chromatographic determination of vitamin B1 and B2 in foods. A collaborative study. Food Chem. 1996, 56 pp. 81-86 (Жидкостное хроматографическое определение витамина B 1 и B 2 в пищевой продукции)
[11]	OLLILAINEN V., FINGLAS P.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. Certification of B-Group Vitamins (B1, B2, B6, and B12) in Four Food Reference Materials. J. Agric. Food Chem. 2001, 49 pp. 315-321 (Сертификация витаминов группы B (B 1, B 2, B 6 и B 12) в четырех эталонных материалах пищевой продукции)
[12]	European Pharmacopoeia 1997: 1997: 0292; Riboflavine. 1442-1443 (Европейская фармакопея 1997: 1997: 0292; рибофлавин)
[13]	NDAW S., BERGAENZLE М., AOUDE-WERNER D., HASSELMANN C. Extraction procedures for the liquid chromatography determination of thiamine, riboflavin and vitamin B 6 in foodstuffs. Food Chem. 2000, 71 pp. 129-138 (Процедуры экстракции для определения методом жидкостной хроматографии тиамина, рибофлавина и витамина B 6 в пищевой продукции)
[14]	HORWITZ W., ALBERT R. The Horwitz Ratio (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision. J. AOAC Int. 2006, 89 pp. 1095-1109 (Индекс Горвица: приемлемый индекс эффективности метода с точки зрения прецизионности)
[15]	THOMPSON М. Recent trends in inter-laboratory precision at and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst (Lond.). 2000, 125 pp. 385-386 (Последние тенденции в межлабораторной точности в концентрациях частей на млрд (ppb) и субчастей на млрд (sub-ppb) в отношении пригодности критериев назначения в квалификационных испытаниях)
[16]	JAKOBSEN J. Food Chem. 2008, 106 pp. 1209-1217. Optimisation of the determination of thiamin, 2-(1-hydroxyethyl)thiamine, and riboflavin in food samples by use of HPLC (Оптимизация определения тиамина 2-(1-гидроксиэтил)тиамина и рибофлавина в пробах пищевой продукции с помощью ВЭЖХ)
[17]	EN ISO/IEC 17025:2005	Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Pruf- und Kalibrier-laboratorien (ISO/IEC 17025:2005) (Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий)

Ключевые слова: пищевая продукция, определение, витамин B ₂, рибофлавин, высокоэффективная жидкостная хроматография.