Приложение B (справочное). Примеры методов выделения и культивирования ПСК

Приложение B
(справочное)

Примеры методов выделения и культивирования ПСК

B.1 Общие положения

Существуют различные методы выделения и пассирования ПСК человека и мыши. Подходы, приведенные в B.2, могут быть рассмотрены в качестве вариантов.

B.2 Процесс

B.2.1 Выделение ЭСК человека

Информация о подходах к выделению ЭСК человека приведена в [24] и [25].

B.2.2 Выделение иПСК

B.2.2.1 Метод эписомного перепрограммирования

В качестве примера использовано получение иПСК "без кормильщиков" (feeder-free) из фибробластов крайней плоти новорожденного человека.

a) Эписомальные векторы. В настоящее время существуют различные версии эписомальных векторов. Тип эписомальных векторов, повседневно использующийся в получении иПСК человека, основан на элементах OriP/EBNA1 вируса Эпштейна-Барра.

b) Факторы перепрограммирования. Можно использовать множество различных комбинаций факторов перепрограммирования, например, человеческий OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, L-MYC, KLF4 и SV40LT. Эти гены клонируют в соответствующих экспрессионных кассетах в эписомальных векторах.

c) Культивирование фибробластов крайней плоти новорожденного человека в соответствующей среде, например, DMEM, с добавлением 10 %-ной термоинактивированной бычьей сыворотки, 0,1 мМ неосновных аминокислот, 1 мМ GlutaMAX, 0,1 мМ -меркаптоэтанола и 4 нг/мл ОФРФ. Трансфицируют эписомальные векторы перепрограммирования в фибробласты крайней плоти химическим путем или с помощью электропорации. Для повышения эффективности транфекции можно выполнить нуклеофекцию.

d) Транфектированные фибробласты при низкой плотности засевают в чашки со средой для культивирования фибробластов. Поверхность может быть предварительно покрыта такой матрицей, как Matrigel, Vitronectin или Laminin 511-Е8. Здесь большое значение имеет посев на чашки материала при низкой плотности клеток, например, на три чашки диаметром 10 см можно рассеять около 1,0  10 ⁶ нуклеофектированных фибробластов.

e) Культивируют трансфицированные фибробласты в среде для перепрограммирования. Чтобы повысить эффективность эписомального перепрограммирования без питания, перепрограммируемое культивирование можно разделить на два этапа. На первом этапе (например, с 1 по 13 день для фибробластов крайней плоти новорожденного) среда для культивирования фибробластов без сыворотки (например, базальная среда N2B27) дополняется небольшими молекулами (например, A-83-01, PD0325901, CHIR99021, HA-100), можно использовать факторы роста (например, LIF, ОФРФ). На второй стадии (например, с 13 по 25 день) можно использовать соответствующую питательную среду для ЭСК человека без питания.

f) Собирают колонии иПСК человека. На 21-25 день после трансфекции под микроскопом легко можно увидеть компактные колонии иПСК человека. Под микроскопом используют пипетки с наконечниками, 20 мкл, чтобы вручную собрать и перенести каждую колонию иПСК в отдельную лунку планшета на 48 лунок, предварительно покрытых матрицей, например Matrigel, Vitronectin или LMN511-E8 в подходящей питательной среде без питания для ЭСК человека.

g) Инкубируют в инкубаторе с концентрацией CO ₂ 5 % при температуре (36,5  0,5) °C и меняют среду каждый день.

h) Разделяют и размножают колонии иПСК человека, если они вырастают большими.

B.2.2.2 Метод вируса Сендай

В качестве примера перепрограммируют мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).

День - 4. Засевают МКПК:

- за четыре дня до трансдукции извлекают пробирку(и) МКПК из среды хранения в жидком азоте. Оттаивают пробирку в размораживающем устройстве или на водяной бане при температуре (36,5  0,5) °C. Когда в пробирке останется только маленький кристалл льда, извлекают ее из устройства/водяной бани. Опрыскивают наружную сторону пробирки 70 %-ным изопропанолом или этиловым спиртом (этанолом), прежде чем поместить ее в шкаф для культивирования;

- осторожно, с соблюдением правил асептики переносят МКПК в коническую пробирку вместимостью 15 мл. Медленно (по капле) добавляют от 5 до 10 мл предварительно подогретой готовой питательной среды для МКПК (Complete StemPro_ ¹⁾-34 среда, содержащая 2 мМ L-глютамина, 100 нг/мл SCF, 100 нг/мл FLT-3, 20 нг/мл IL-3 и 20 нг/мл IL-6) в суспензию клеток. Извлекают аликвотное количество клеток, чтобы подсчитать клетки и определить их жизнеспособность;

------------------------------

¹⁾ Complete StemPro_ является торговой маркой Thermo Fisher Scientific. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает поддержку данного продукта со стороны ИСО.

------------------------------

- центрифугируют клеточную суспензию со скоростью 200g в течение 10 мин, надосадочную жидкость извлекают и снова суспендируют клетки в МКПК-среде готового состава до получения 5  10 ⁵ клеток/мл. Добавляют 1 мл на лунку в средней части 24-луночного планшета, чтобы предотвратить избыточное испарение среды при инкубации. Инкубируют клетки в инкубаторе при температуре (36,5  0,5) °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5 % CO ₂.

От дня -3 до дня -1. Наблюдают за клетками и добавляют свежую среду:

- ежедневно питают клетки, осторожно удаляя 0,5 мл среды из каждой лунки и заменяя на 0,5 мл свежей готовой среды МКПК, стараясь не потревожить клетки. Если в 0,5 мл удаленной из лунок среды присутствуют клетки, то центрифугируют клеточную суспензию со скоростью 200g в течение 10 мин, надосадочную жидкость удаляют и снова суспендируют клетки в 0,5 мл среды МКПК, прежде чем вернуть их в лунки.

День 0. Подсчитывают клетки и выполняют трансдукцию:

- подсчитывают клетки подходящим методом и вычисляют объем каждого вируса, необходимого для достижения целевого значения MOI, используя подсчет живых клеток и информацию о титре СоА (сначала выполняют трансдукцию с MOI 5, 5 и 3 (т.е. KOS MOI = 5, hL-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3);

- для каждой трансдукции пипеткой отбирают от 2,5  10 ⁵ до 5  10 ⁵ клеток в круглодонную пробирку;

- извлекают пробирки, содержащие перепрограммированный вирус Сендая, из хранилища с температурой  -70 °C. Размораживают каждую пробирку по очереди, сначала погружая дно пробирки в водяную баню при температуре (36,5  0,5) °C на 10-20 с, а затем извлекают пробирку из водяной бани и дают оттаять при комнатной температуре. После оттаивания быстро центрифугируют пробирку и сразу помещают на лед;

- добавляют вычисленные объемы каждого перепрограммированного вируса Сендая к 1 мл среды МКПК, предварительно нагретой до (36,5  0,5) °C. Обеспечивают тщательное перемешивание раствора пипеткой, взбивая смесь пипеткой вверх и вниз. Следующий этап завершают в течение 5 мин;

- добавляют смесь перепрограммированного вируса, приготовленного по B.2.2.2, шаг 8), в круглодонную пробирку, содержащую смесь МКПК, приготовленную по B.2.2.2, шаг f). Общий полученный объем должен составлять от 1 до 1,5 мл. Плотно закупоривают и оборачивают пленкой пробирку. Центрифугируют клетки и вирус при 1000g в течение 30 мин при комнатной температуре. По завершении центрифугирования добавляют дополнительно 1 мл среды МКПК в пробирку, снова суспендируют клетки и переносят их в одну лунку планшета на 12 лунок (теперь общий объем должен составлять от 2 до 2,5 мл). Инкубируют планшет в течение ночи при температуре (36,5  0,5) °C в инкубаторе в увлажненной атмосфере 5 %-ного CO ₂.

День 1. Заменяют среду и культивируют клетки:

- на следующий день забирают среду и клетки из планшета и переносят в пробирку для центрифугирования вместимостью 15 мл. Осторожно споласкивают лунку порцией среды, равной 1 мл, чтобы обеспечить максимальное собирание клеток;

- удаляют вирусы Сендая центрифугированием клеточной суспензии при 200g в течение 10 мин, удаляют надосадочную жидкость и вновь суспендируют клетки в 0,5 мл готовой среды для МКПК на лунку на планшете на 24 лунки;

- культивируют клетки при температуре (36,5  0,5) °C в увлажненной атмосфере 5 %-ного CO ₂ в течение двух дней. В течение этого времени замены среды не требуется.

День 3. Засевают клетки на покрытые матрицей Laminin 521 лунки для культивирования:

- покрывают достаточное количество чашек для культивирования тканей (например, 6-луночные, 60-мм, 100-мм) матрицей Laminin 521;

- подсчитывают клетки подходящим методом и засеивают 6-луночные покрытые Laminin 521 планшеты для культивирования в количестве, равном от 1  10 ⁴ до 1  10 ⁵ живых клеток на лунку, в 2 мл среды МКПК без цитокинов. Инкубируют клетки при температуре (36,5  0,5) °C в увлажненной атмосфере 5 %-ного CO ₂.

От дня 4 до дня 6. Заменяют отработанную среду:

- через день аккуратно удаляют 1 мл (половину) отработанной среды из клеток и заменяют ее 1 мл свежей среды МКПК без цитокинов и не тревожа клетки.

День 7. Начинают перенос клеток на коммерческую готовую среду чПСК:

- удаляют 1 мл (половину) среды МКПК без цитокинов из клеток и заменяют ее на 1 мл коммерческой готовой среды чПСК, чтобы начать адаптацию клеток к новой питательной среде.

От дня 8 до дня 28. Питают и отслеживают клетки:

- 24 ч спустя (день 8) заменяют полный объем среды на среду Essential 8_ ²⁾ и заменяют отработанную среду каждый последующий день;

------------------------------

²⁾ Essential 8 является торговой маркой Thermo Fisher Scientific. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает поддержку данного продукта со стороны ИСО.

------------------------------

- начиная с дня 8, наблюдают лунки через день под микроскопом на появление скоплений клеток, показательное для перепрограммированных клеток. Ко дню 15-21 после трансдукции колонии должны вырасти до размера, подходящего для переноса;

- когда колонии готовы к переносу, выполняют окрашивание живых клеток, используя Тга1-60 или Тга1-81 для выделения перепрограммированных колоний, при необходимости. Вручную собирают колонии и переносят их на 6- или 12-луночные планшеты для культивирования, подготовленные при помощи покрытия LN521, для размножения.

B.2.3 Выделение клеток ЭСК мышей

Подходящий метод для получения ЭСК мышей приведен в [26]. Информация для дополнительной стадии трипсинизации, которую необходимо провести до выращивания клеток на чашках диаметром 60 мм для промежуточного слияния перед замораживанием, приведена в [27].

B.2.4 Выделение иПСК мышей

Информация для получения иПСК мышей приведена в [28] и [29].

B.2.5 Пример для выращивания ПСК мышей

Ниже приведены примеры трех сред, используемых для ЭСК мышей, которые имеют разные характеристики:

a) содержащие сыворотку (15 % FBS).

Пример 1 - Среда DMEM - это базальная питательная среда (с высоким содержанием глюкозы), содержащая 15 % FBS, 1 % пенициллина/стрептомицина (100), 55 мМ -меркаптоэтанола и 1000 Ед/мл мЛИФ;

b) без сыворотки с заменителем нокаутной сыворотки (20 % KSR).

Пример 2 - Базальная питательная среда DMEM/F12, содержащая 20 % KSR, 1 % пенициллина/стрептомицина (100), 55 мМ -меркаптоэтанола, 1 % GlutaMAX (100), 1 % заменимой аминокислоты (NEAA, 100) и 1 000 Ед/мл мЛИФ;

c) без сыворотки 2i (Chir99021, PD0325901).

Пример 3 - Нейробазальная питательная среда и DMEM/F12, смешанные в соотношении 1:1, содержащие 1 % N-2 добавку, 0,5 % B-27 добавку, 20 нг/мл BSA, 10 мкг/мл инсулина, GlutaMAX, 1 % пенициллина/стептомицина (100), 55 мМ -меркаптоэтанола, 1 мкМ PD0325901 (MEK-ингибитор), 3 мкМ CHIR99021 (GSK3b-ингибитор) и 1000 Ед/мл мЛИФ.

Характеристики должны быть описаны подробно.

B.2.6 Примеры подготовки питающих клеток из эмбрионов мышей

Подходящие методы для подготовки питающих клеток из эмбрионов мышей приведены в [28] и [29].