Приложение 4. Методы окрашивания ооцист криптоспоридий

Приложение 4
к МУК 4.2.3964-23

Методы окрашивания ооцист криптоспоридий

1. Окрашивание мазков по Цилю - Нильсену

1.1. Осадок исследуемого материала, полученного любым из методов санитарно-паразитологического исследования на наличие ооцист криптоспоридий, наносят на обезжиренное предметное стекло и равномерно распределяют с помощью стеклянной палочки или краем шлифованного стекла. Мазки высушивают и фиксируют.

1.2. Фиксацию препарата проводят одним из приведенных способов.

1.2.1. Фиксируют препарат в смеси Никифорова (смесь равных частей эфира и 96 %-го этилового спирта) на 20 - 30 мин. Пинцетом или специальными щипцами берут за боковые концы препарат и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания препарата в пламени не должна превышать 3 - 5 секунд. Затем стекла помещают на специальную подставку ("рельсы") для окрашивания.

1.2.2. Предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при температуре плюс 37 °C. Затем температуру повышают до плюс 105 °C и спустя 10 мин шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу. Высушенные и фиксированные мазки должны сразу окрашиваться.

1.3. Процедура окраски. Препараты помещают на подставку ("рельсы") так, чтобы они не касались друг друга и расстояние между ними составляло порядка 1 см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону. Максимально на стандартные "рельсы" помещают не более 12 стекол. На каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того, чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на препарат кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании могут быть ошибочно приняты за паразитарный агент.

Наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый препарат оставляют на 5 мин для полного его прокрашивания.

Пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу. Осторожно смывают остатки краски слабой струей дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое отхождение краски. Перед тем как нанести на стекло следующий раствор щипцами или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и наклоняют, чтобы с него стекла вода, - это предотвращает разбавление следующего реактива. Препарат обесцвечивают 3 мин одним из обесцвечивающих растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка. Тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают в течение 1 мин (не превышая экспозицию) 0,3 %-м раствором метиленового синего. Вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекала вода. Высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении (не промокая препарат).

1.4. Учет результатов. Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе при увеличении х900, х1000. Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко красного (малинового, вишневого) цвета и имеют вид округлых образований диаметром 3 - 7 мкм с отчетливо видимой оболочкой и структурированным содержанием (можно наблюдать наличие 4 веретенообразных темно окрашенных спорозоитов) на синем (сиреневом) или зеленом фоне (приложение 5 к настоящим МУК).

2. Окрашивание по Романовскому-Гимза
(альтернативный метод окраски препаратов)

2.1. На подсушенный мазок для фиксации наносят метанол или жидкость Никифорова (смесь равных частей эфира и 96 %-го этилового спирта), подсушивают на воздухе или путем быстрой проводки над пламенем горелки, затем покрывают красителем (основным раствором краски Романовского-Гимза). Оставляют окрашиваться на 10 - 30 мин. Промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе при комнатной температуре.

2.2. Учет результатов. Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе при увеличении 900х, 1000х. Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в бледно-голубой цвет с малозаметными красноватыми гранулами в спорозоитах.

3. Окраска препаратов для люминесцентной микроскопии

3.1. Мазки для люминесцентной микроскопии предпочтительно готовить из осадка после обработки материала детергентом с последующим отмыванием и центрифугированием. Перед нанесением материала осадка на предметное стекло рекомендуется добиться значения его pH 6,8 - 7,0. Для этого осадок нейтрализуют несколькими каплями 6 %-го раствора соляной кислоты или 6 %-го раствора едкого натра (в зависимости от метода обработки материала), тщательно встряхивают и с помощью индикаторной тест-полоски определяют уровень pH осадка.

Во всех сомнительных случаях микроскопической картины для контроля рекомендуется использовать микроскопию мазка, повторно окрашенного по методу Циля - Нильсена.

Промывание мазков в процессе окраски рекомендуется проводить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию.

В случае невозможности проведения немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуется сохранять, прикрыв черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции.

При окраске мазков необходимо:

- избегать неполного обесцвечивания;

- не делать толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка на стекле;

- при окраске флюорохромными красителями не подогревать мазки и пользоваться накладками из фильтровальной бумаги.

При использовании каждой новой партии реагентов и перед началом микроскопии препаратов исследуемых проб следует предварительно приготовить препарат положительного контроля, для чего используют контрольную суспензию с точно подсчитанным количеством ооцист криптоспоридий.

4. Метод окраски аурамином О

4.1. Приготовление растворов для люминесцентного окрашивания аурамином О.

Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О: растворить 0,1 г аурамина О в 10 мл этилового спирта 96°-го.

Раствор 2. Раствор фенола: расплавить 3,0 г фенола кристаллического (температура плавления плюс 41 °C) и растворить его в 87 мл дистиллированной воды, пользуясь подогреванием на водяной бане, довести общий объем до 90 мл.

Раствор 3. Раствор аурамина О: смешать растворы 1 и 2 и перелить в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла. Хранить в прохладном затемненном месте. В процессе хранения раствор может стать мутным, что не влияет на качество окрашивания.

Раствор 4. Обесцвечивающий раствор: аккуратно добавить 0,5 мл концентрированной соляной кислоты к 100 мл 70 %-го этилового спирта.

Раствор 5. Гасители фона. Для дополнительного окрашивания препаратов можно использовать растворы перманганата калия или акридинового оранжевого. Хранят готовые растворы в плотно закрывающейся темной емкости. На этикетке обозначают название раствора, дату приготовления, срок годности. Раствор может храниться при комнатной температуре в темном месте до 3 месяцев.

Раствор перманганата калия: растворить 0,5 г перманганата калия в 100 мл дистиллированной воды.

Раствор акридинового оранжевого: растворить 0,01 г безводного двузамещенного фосфата натрия в 100 мл дистиллированной воды, добавить 0,01 г акридинового оранжевого.

4.2. Процедура окраски. Стекла с фиксированными мазками раскладывают на специальные штативы - "рельсы" - для окраски так, чтобы они не касались друг друга. Мазки заливают раствором аурамина О (раствор 3) на 15 мин. Затем тщательно, но аккуратно промывают мазки дистиллированной водой. Далее обесцвечивают 0,5 %-м раствором солянокислого спирта (раствор 4) в течение 2 мин. Промывают дистиллированной водой каждое стекло до тех пор, пока не смоются все остатки краски.

Гашение фона осуществляют раствором перманганата калия или акридинового оранжевого (раствор 5) в течение 2 мин. Мазки промывают дистиллированной водой и высушивают при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

4.3. Учет результатов. Окрашенные препараты исследуют при увеличении от х250 до х450. Аурамин О связывается с ооцистами криптоспоридий, которые при облучении их возбуждающим светом, начинают светиться оранжевым или ярко-желтым светом на черном или темно-зеленом фоне.