Приложение 6. Состав и способы приготовления растворов и буферов для ПЦР

Приложение 6
к МУК 4.2.3964-23

Состав и способы приготовления растворов и буферов для ПЦР

1. Раствор 1 М ТРИС - HCI (pH 7,5). В мерной колбе на 100 мл растворяют 12,11 г трис(гидроксиметил)аминометана (молекулярный вес 121) в 80 мл дистиллированной воды, доводят pH концентрированной соляной кислотой до 7,5, затем доводят объем раствора до метки деионизированной водой, перемешивают. Хранят при температуре минус 20 °C не более года.

2. Раствор 5М NaCl. Растворяют 29,22 г натрия хлористого (молекулярный вес 58,5) в 100 мл дистиллированной воды, перемешивают. Хранят в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

3. Раствор 0,5М ЭДТА (pH 8,0). В мерной колбе на 100 мл растворяют 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 мл дистиллированной воды. Раствором 30 %-м натрия гидроокиси доводят pH раствора до 8,0, затем дистиллированной водой доводят объем раствора до метки, перемешивают. Хранят в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

4. Раствор 30 %-й NaOH. Растворяют 3 г натрия гидроокиси (молекулярный вес 40) в 7 мл дистиллированной воды.

5. Раствор хлороформа, насыщенный водой. Смешивают 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставляют на 24 часа для насыщения. Срок хранения при температуре от плюс 4 до плюс 5 °C не более 6 месяцев.

6. Раствор лизирующего буфера (2 %-й ЦТАБ). Растворяют 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды (при плохом растворении подогреть на водяной бане), добавляют 2,5 мл 1М трис-HCl, 7 мл 5 М NaCl, 1 мл 0,5М ЭДТА, доводят объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешивают. Срок хранения при температуре от плюс 4 до плюс 5 °C не более 6 месяцев. Допустимо образование осадка.

Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °C до полного растворения осадка.

7. Раствор 1М взвеси СаСО ₃. Карбонат кальция в количестве 10 г добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Перемешивают 5 мин. Перед применением полученную взвесь встряхивают. Хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

10. Раствор 1М CaCl ₂. К 1,11 г безводного хлорида кальция добавляют дистиллированную воду до объема 10 мл и встряхивают до полного растворения. При использовании обводненного хлорида кальция следует пересчитать количество добавляемой соли в соответствии с молекулярной массой. 50 мМ концентрацию хлорида кальция получают, добавляя к образцу 5 % от объема образца 1М хлорида кальция. Хранят при температуре минус 20 °C не более года.

11. Раствор CH ₃COONa 3М. Добавить к 24,6 г CH ₃COONa дистиллированную воду до 100 мл. Размешать до полного растворения. Для получения конечной концентрации 0,3 М добавляют полученный раствор в количестве 11 % от объема образца.

12. ТЕ буфер. К 9,78 мл дистиллированной воды добавить 200 мкл 1М Трис-HCl pH 7,5 и 20 мкл 0,5М ЭДТА и тщательно перемешать. Хранить при температуре минус 20 °C не более года.

13. Буфер для нанесения. К 9 мл воды добавляют 1 мл глицерина и 0,625 г бромфенолового синего и тщательно перемешивают до полного растворения. Раствор разливают по порциям.

14. 1х ТБЕ буфер для электрофореза. В мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 мг трис(оксиметил)аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения. Срок хранения 1х раствора 10 дней. Обычно готовят 10х и перед употреблением разбавляют до 1х; используют трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, доливают деионизированной водой до метки. Полученный концентрированный раствор перед употреблением разводят в 50 раз. Используют для проведения электрофореза не более двух раз.

15. Раствор бромистого этидия C ₂₁H ₂₀N ₃Br (10 мг/мл). Растворяют 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды. Срок хранения в посуде из темного стекла (обязательно при температуре от 4 до 5 °C) не более 12 месяцев. Бромистый этидий потенциально канцерогенен, работать с ним и содержащими его гелями можно только в перчатках.

16. 1 %-й раствор агарозного геля. Взвешивают агарозу из расчета 1 г агарозы на 100 мл буфера ТБЕ. Нагревают агарозу вместе с буфером до полного растворения (в микроволновой печи или на водяной бане). Нагревание проводят с осторожностью (опасность перегретых жидкостей). Остужают растворенный гель до примерно 56 °C (учитывать указания производителя электрофорезного прибора). Добавляют в гель раствор бромистого этидия до концентрации 0,2 - 0,5 мкг/мл (2 - 5 мкл на 100 мл раствора геля) и перемешивают. Гель заливают в собранную заливочную кассету с установленными гребенками. После застывания геля (гель становится слегка мутным и плотным) удаляют гребенки. Допускается хранение готового геля в 1 х ТБЕ буфере для электрофореза в холодильнике при температуре от 4 до 5 °C не более 2 суток.