Методические указания МУ 3.3.2.3972-23 "Обеспечение безопасности работы со штаммами фиксированного вируса бешенства при производстве иммунобиологических лекарственных препаратов" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 17 октября 2023 г.)

Методические указания МУ 3.3.2.3972-23
"Обеспечение безопасности работы со штаммами фиксированного вируса бешенства при производстве иммунобиологических лекарственных препаратов"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 17 октября 2023 г.)

ББК 51.946.16

О-13

ISBN 978-5-7508-2093-1

взамен МУ 3.3.1.1099-02

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУ) описывают принципы обеспечения безопасности работ с использованием фиксированного вируса бешенства при производстве иммунобиологических лекарственных препаратов (далее - ИЛП), обеспечивающие соблюдение санитарно-эпидемиологических требований ¹.

------------------------------

¹Глава IV СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 N 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный N 67587); от 25.05.2022 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный N 68934) (далее - СанПиН 3.3686-21).

------------------------------

1.2. Фиксированный вирус бешенства (virus fixe) - аттенуированный штамм вируса бешенства Lyssavirus rabies (род Lyssavirus семейство Rhabdoviridae), полученный путем длительного пассирования через головной мозг лабораторного животного и характеризующийся укороченным и постоянным инкубационным периодом. Фиксированный вирус бешенства вызывает у лабораторных животных паралитическую форму заболевания с инкубационным периодом от 4 до 6 дней, имеет высокую тропность к центральной нервной системе (далее - ЦНС) и низкую тропность к внутренним органам, у незаболевших животных не проникает в слюнные железы и не выделяется вместе со слюной. Паспортизированные штаммы фиксированного вируса бешенства относятся к III группе патогенности ².

------------------------------

²Приложение 1 СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

1.3. Производственными являются штаммы фиксированного Lyssavirus rabies, прошедшие аттестацию для применения в производстве ИЛП, предназначению для профилактики бешенства у людей.

1.4. К контрольным относятся штаммы фиксированного вируса бешенства, прошедшие аттестацию для применения при контроле качества ИЛП, предназначенного для профилактики бешенства у людей, например, штамм фиксированного вируса бешенства CVS.

Перечень основных производственных и контрольных штаммов фиксированного вируса бешенства, используемых для производства и контроля лекарственных препаратов, представлен в таблице.

Таблица

Перечень основных производственных и контрольных штаммов

Производственный штамм вируса бешенства	Субстрат для культивирования	Конечный продукт
1	2	3
Москва (Москва 3253)	Кролик	Антирабический иммуноглобулин
Москва Vero (Москва 3253 Vero)	Перевиваемая культура клеток Vero	Антирабический иммуноглобулин
Внуково-32 (SAD: Внуково-32)	Первично-трипсинизированная культура клеток почек сирийского хомяка	Вакцины для человека и животных
Щелково-51	Перевиваемая культура клеток ВНК-21/13	Вакцина для животных
ВНИИЗЖ	Перевиваемая культура клеток ВНК-21	Вакцина для животных, диагностическая сыворотка
РВ-97	Перевиваемая культура клеток ВНК-21	Вакцина для животных
ТС-80	Перевиваемая культура клеток почки сайги	Вакцина для животных
РБ-71 (71 БелНИИЭВ-ВГНКИ)	Перевиваемые культуры клеток ВНК-21 или Vero	Вакцина для животных
ERA-CB20M	Перевиваемая культура клеток ВНК-21	Вакцина для животных
Овечий-ВГНКИ	Овцы	Вакцина для животных, диагностические препараты
Paris Pasteur	Кролик, перевиваемая культура клеток Vero	Вакцины для человека и животных
PV-12	Кролик, перевиваемая культура клеток ВНК-21	Вакцины для человека и животных
Pitman-Moore (PM) (ATCC VR-320)	Диплоидные клетки человека, первично-трипсинизированная культура клеток почек собак, перевиваемые культуры клеток Vero или Nill-2	Вакцины для человека и животных
Flury LEP	Куриные эмбрионы, первично-трипсинизированная культура клеток куриных эмбрионов, перевиваемые культуры клеток ВНК-21	Вакцины для человека и животных
Flury HEP	Куриные эмбрионы, первично-трипсинизированная культура клеток куриных эмбрионов	Вакцины для человека и животных
Kelev	Куриные эмбрионы	Вакцины для человека и животных
SAP: ERA (Evelyn Rokitniki Abelseth)	Клетки почек свиней; перевиваемая культура клеток ВНК-21	Вакцина для животных
SAD (Street-Alabama-Duffering)	Перевиваемая культура клеток ВНК-21	Вакцина для животных
Beijing	Первично-трипсинизированные клетки почек хомяков	Вакцина для человека
CTN	Диплоидные клетки человека	Вакцина для человека
CVS-21	Белая мышь	Штамм для проведения контрольных исследований
CVS-27 (ATCC VR-321)	Белая мышь, перевиваемая культура клеток ВНК-21	Штамм для проведения контрольных исследований
CVS-11 (ATCC VR-959) Kissling	Перевиваемая культура клеток ВНК-21	Штамм для проведения контрольных исследований
Примечание: в Российской Федерации для производства ИЛП "Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади" используется штамм фиксированного вируса бешенства "Москва 3253" (вариант штамма Пастера, ВОЗ, 1975), рекомендованный ВОЗ для производства антирабических препаратов [1] Штамм фиксированного вируса бешенства "Внуково-32" используется для изготовления ИЛП "Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная" [2].

II. Организация работы со штаммами фиксированного вируса бешенства

Организации

2.1. Организации, в которых проводятся производственные и экспериментальные работы с использованием штаммов фиксированного вируса бешенства, осуществляют деятельность на основании лицензии ³. Лаборатории, в которых проводятся производственные и экспериментальные работы с использованием штаммов фиксированного вируса бешенства, осуществляют деятельность на основании санитарно-эпидемиологического заключения ⁴. Производственные штаммы фиксированного вируса бешенства, используемые при производстве ИЛП, депонируются в государственной коллекции микроорганизмов ⁵.

------------------------------

³Пункт 19 статьи 12 Федерального закона от 04.05.2011 N 99-ФЗ "О лицензировании отдельных видов деятельности"; пункт 134 главы IV СанПиН 3.3686-21.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо слов "Пункт 19 статьи 12" следует читать "Пункт 19 части 1 статьи 12"

⁴Пункт 3 статьи 26 Федерального закона от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", пункт 135 главы IV СанПиН 3.3686-21.

⁵Статья 11 Федерального закона от 30.12.2020 N 492-ФЗ "О биологической безопасности в Российской Федерации".

------------------------------

2.2. Контроль соблюдения правил биологической безопасности в организации осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁶.

------------------------------

⁶Пункты 144 - 146 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Персонал

2.3. Работу с фиксированным вирусом бешенства выполняют специалисты, допущенные к проведению работ с ПБА III группы в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁷. Сотрудникам, работающим с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, обязательная профилактическая вакцинация не проводится ⁸.

------------------------------

⁷Пункты 149, 151, 320 главы IV СанПиН 3.3686-21.

⁸Приложение 2 приказа Минздрава России от 06.12.2021 N 1122н "Об утверждении национального календаря профилактических прививок, календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям и порядка проведения профилактических прививок".

------------------------------

2.4. Допуск персонала для инженерно-технического сопровождения работ с ПБА осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁹.

------------------------------

⁹Пункт 150 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.5. Вводный и периодические инструктажи по биологической безопасности персонала, осуществляющего деятельность с фиксированным вирусом бешенства или посещающих "заразную" зону, проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹⁰.

------------------------------

¹⁰Пункты 155, 156 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.6. Сотрудники, работающие с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, проходят периодические медицинские осмотры ¹¹.

------------------------------

¹¹Приказ Минздрава России от 28.01.2021 N 29н "Об утверждении порядка проведения обязательных предварительных и периодических медицинских осмотров работников, предусмотренных частью четвертой статьи 213 трудового кодекса Российской Федерации, перечня медицинских противопоказаний к осуществлению работ с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также работам, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры", приказ Минтруда России и Минздрава России от 31.12.2020 N 988н/1420н "Об утверждении перечня вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные медицинские осмотры при поступлении на работу и периодические медицинские осмотры".

------------------------------

Помещения и оборудование

2.7. Лаборатории, работающие с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, располагаются в отдельно стоящем здании или изолированной части производственного здания с отдельным входом. На входной двери лаборатории обозначаются название (номер) лаборатории и международный знак "Биологическая опасность" ¹².

------------------------------

¹²Пункт 162 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.8. Лаборатории обеспечиваются холодным и горячим водоснабжением, канализацией, электричеством, отоплением и вентиляцией в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹³.

------------------------------

¹³Глава VIII СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению населения, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 3 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный N 62297), с изменением, внесенным постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 26.06.2021 N 16 (зарегистрировано Минюстом России 07.07.2021, регистрационный N 64146) (далее - СанПиН 2.1.3684-21).

------------------------------

Устройство, режим работы, эксплуатация систем водоснабжения, канализации, вентиляции "заразной" зоны осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹⁴.

------------------------------

¹⁴Приложение 4 СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.9. Помещения лаборатории разделяются на "заразную" и "чистую" зоны. Планировочные решения, внутренняя отделка помещений, размещение оборудования, материал для изготовления мебели в "заразной" зоне выполняются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиям ¹⁵.

------------------------------

¹⁵Глава IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.10. В лаборатории предусматривается набор рабочих и вспомогательных помещений в соответствии с производственной мощностью и номенклатурой выполняемых технологических операций по производству ИЛП ¹⁶.

------------------------------

¹⁶Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 N 916 "Об утверждении Правил надлежащей производственной практики" (далее - приказ Минпромторга России от 14.06.2013 N 916).

------------------------------

2.11. Во вновь строящихся и реконструируемых подразделениях для поддержания нормируемых параметров микроклимата в рабочих комнатах и боксированных помещениях система приточно-вытяжной вентиляции (далее - ПВВ) оснащается устройствами для кондиционирования воздуха (чиллер/калорифер) и фильтрами очистки воздуха (далее - ФОВ) на входе ¹⁷.

------------------------------

¹⁷Пункт 331 главы IV, приложение 4 СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Рекомендуется установка сплит-систем. Во время работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, устройства кондиционирования воздуха отключаются. Фильтрующие элементы периодически (не реже 1 раза в 3 месяца) подвергаются дезинфекции и очистке. Сбор конденсата осуществляется в емкость с дезинфицирующим раствором. Сплит-системы в комнатах для содержания зараженных животных не устанавливаются ¹⁸.

------------------------------

¹⁸Пункт 199 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.12. Работы со штаммами фиксированного вируса бешенства проводятся в боксированных помещениях в боксах микробиологической безопасности (далее - БМБ) не ниже II класса ¹⁹. Работы с высоким риском образования аэрозольных частиц живого вируса (дезинтеграция, гомогенизация мозговых тканей, приготовление суспензий органов, вскрытие черепной коробки, работа с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства) рекомендуется выполнять в БМБ III класса. Рекомендуется проведение работ с высоким риском образования аэрозоля в защитных боксирующих устройствах (далее - ЗБУ) или БМБ не ниже II класса в противочумном костюме IV типа, дополненном защитным щитком или защитными противотравматическими очками, респиратором не ниже класса FFP2.

------------------------------

¹⁹Пункт 333 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Проверка эксплуатационных характеристик БМБ осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ²⁰.

------------------------------

²⁰Пункт 188 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.13. Площадь помещения для безопасного проведения работ со штаммами фиксированного вируса бешенства соответствует санитарно-эпидемиологическим требованиям ²¹.

------------------------------

²¹Пункт 166 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.14. В работе с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства используются технически исправные, аттестованные, прошедшие метрологическую поверку приборы, оборудование и средства измерений ²². На каждый прибор (установку) разрабатываются правила (инструкция) по их эксплуатации.

------------------------------

²²Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 N 916.

------------------------------

Содержание лабораторных животных

2.15. Устройство, оборудование и содержание вивариев осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ²³.

------------------------------

²³Пункты 239 - 243 Глава IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.16. Содержание кроликов, зараженных производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, рекомендуется в клетках открытого типа.

2.17. Чистка клеток после содержания в них зараженных животных осуществляется жидкими дезинфицирующими средствами, разрешенными к применению в Российской Федерации ²⁴. Сухие отходы (например, остатки корма, подстилка) замачиваются в дезинфицирующем растворе в соответствии с п. 6.3.

------------------------------

²⁴Таблицы 3, 6 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.18. Учет движения животных осуществляется в специальном журнале с указанием даты заражения, наименования штамма, заражающей дозы, способа аппликации, номера животного ²⁵.

------------------------------

²⁵Пункты 482, 484 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.19. Клетки с зараженными животными маркируются этикетками, на которых указывается дата заражения, наименование штамма, заражающая доза, способ введения вируса, номер животного, фамилия и инициалы специалиста, работающего с ПБА ²⁶.

------------------------------

²⁶Пункт 258 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.20. Посещение блока для работы с инфицированными животными регистрируется в журнале в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ²⁷.

------------------------------

²⁷Пункт 255 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Проведение работ с производственными и контрольными штаммами фиксированного вируса бешенства

2.21. В помещениях "заразной" зоны осуществляются следующие виды работ:

- работа с животными (заражение, вскрытие);

- содержание инфицированных животных;

- дезинтеграция, гомогенизация мозговых тканей и другие операции с вероятным образованием аэрозоля;

- заражение культуры клеток;

- приготовление взвесей и суспензий;

- работа с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства;

- хранение производственных штаммов вируса бешенства и объектов, их содержащих.

2.22. В помещениях "заразной" зоны не рекомендуется:

- оставлять после окончания работы на рабочих местах посуду с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства;

- хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, зонты, хозяйственные сумки, косметику, а также продукты питания;

- принимать пищу, пить воду, курить;

- оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любого вида работ с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства;

- сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый материал в канализацию без предварительного обеззараживания).

2.23. Во время работы двери рабочих комнат закрываются. Перед работой включается вытяжная вентиляция. Выход из рабочей комнаты во время проведения работы не рекомендуется.

2.24. Для дезинфекции используются дезинфицирующие средства, разрешенные к применению в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ²⁸.

------------------------------

²⁸Пункт 84 главы III СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.25. Заражение животных фиксированным вирусом бешенства осуществляется не менее чем двумя сотрудниками ²⁹.

------------------------------

²⁹Пункт 204 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.26. При пипетировании вируссодержащих жидкостей рекомендуется пользоваться лабораторными грушами или автоматическими устройствами с наконечниками, оснащенными фильтрами. Не рекомендуется переливание жидких культур через край сосуда (пробирки, колбы, флакона), продувание через них воздуха из пипеток.

2.27. Перед использованием посуда, пипетки, оборудование, шприцы проверяются на целостность и исправность.

2.28. По окончании работы все объекты с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства помещаются в опечатываемые хранилища (холодильники, термостаты, шкафы); проводится текущая дезинфекция рабочих поверхностей путем протирания или, в случае труднодоступных поверхностей - орошения с применением дезинфицирующих растворов в соответствии с п. 6.3 и обеззараживания воздуха и поверхностей бактерицидными лампами. Длительность использования бактерицидных ламп зависит от их мощности и площади поверхностей и рассчитывается индивидуально ³⁰.

------------------------------

³⁰Пункт 7.1, приложение 5 Р 3.5.1904-04 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях", утвержденное Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 04.03.2004 (далее - Р 3.5.1904-04).

------------------------------

2.29. Использованные пипетки погружаются в дезинфицирующий раствор, избегая образования в каналах пузырьков воздуха. Груши и иные механические устройства для пипетирования зараженного материала обрабатываются в соответствии с приложением 1 к настоящим МУ.

2.30. Использованная посуда, отходы из "заразной" зоны собираются в закрывающиеся емкости. Указанные объекты подвергаются обеззараживанию с применением паровой стерилизации (приложение 1 к настоящим МУ). Сбор, хранение и утилизация отходов осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³¹.

------------------------------

³¹Пункт 212 главы IV СанПиН 3.3686-21; глава X СанПиН 2.1.3684-21.

------------------------------

2.31. Перенос производственных штаммов фиксированного вируса бешенства и использованной посуды для обеззараживания осуществляется в плотно закрытых емкостях.

2.32. Хранение, учет, передача, транспортирование и уничтожение производственных штаммов фиксированного вируса бешенства проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическим требованиями ³².

------------------------------

³²Пункты 484 - 535 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.33. Вынос из лаборатории (например, оборудования, лабораторной или хозяйственной посуды, инструментов) производится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³³.

------------------------------

³³Пункт 208 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

2.34. Экспериментальные и производственные работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства рекомендуется проводить в одном помещении при разделении этих работ во времени и проведения текущей дезинфекции после каждого цикла работ. Не рекомендуется совместное хранение материалов для производственных и экспериментальных работ. Для проведения производственных и экспериментальных работ при необходимости проводится инактивация производственного штамма вируса бешенства (приложение 2 к настоящим МУ).

2.35. В помещениях "чистой" зоны лаборатории предусматриваются следующие виды работ:

- проведение подготовительных работ (например, обработка и стерилизация посуды, приготовление питательных сред);

- ведение производственной документации;

- хранение чистой посуды, уборочного и вспомогательного инвентаря, СИЗ;

- хранение питательных сред, диагностических препаратов, дезинфицирующих средств, медицинской аптечки.

III. Штаммы фиксированного вируса бешенства

3.1. Культивирование штаммов фиксированного вируса бешенства осуществляется на лабораторных животных или клеточных культурах с регистрацией истории пассажей. Для культивирования определенного штамма фиксированного вируса бешенства рекомендуется использовать один и тот же вид животного или клеточной культуры.

3.2. Для обеспечения безопасности работ и качества получаемого лекарственного препарата рекомендуются следующие характеристики штаммов фиксированного вируса бешенства:

- минимальная вирулентность для лабораторных животных при экстраневральном введении - не более 10 ^-1,5 LD ₅₀/мл при внутримышечном и подкожном путях заражения белых мышей [1];

- антигенная специфичность и иммуногенная активность.

Количество пассажей для производственного вируса бешенства регламентируется в соответствии с инструкцией по применению ИЛП [1];

Фиксированный вирус бешенства при воспроизводстве на животных имеет следующие основные признаки:

- короткий инкубационный период (4 - 6 дней);

- патогенность для животных (кроликов, белых мышей) при интрацеребральном заражении;

- способность вызывать паралитическую форму бешенства;

- высокую тропность к ЦНС и низкую тропность к внутренним органам.

Каждый производственный штамм вируса бешенства имеет паспорт, в котором отражается история его выделения, видовая идентификация, наличие посторонних агентов, ведущие биологические свойства, условия хранения, условия пассирования (культуральные свойства), условия получения посевного вирусного материала (число пассажей). Паспорт на контрольный штамм вируса бешенства содержит информацию, отражающую результаты его аттестации. Производственные штаммы фиксированного вируса бешенства органо-тканевой и культуральной природы нейтрализуются иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади и не нейтрализуются сывороткой крови крупного рогатого скота нормальной. Индекс нейтрализации составляет не менее 100 [1].

Рекомендуемый титр производственных штаммов вируса бешенства - не менее 10 ^-6 LD ₅₀/мл при интрацеребральном заражении беспородных белых мышей или мышей любой инбредной линии соответствующих возраста и массы, обозначенных в НД на лекарственный препарат. При этом учитывается, что лабораторные животные могут быть нечувствительны к вирусу, пассируемому на культуре клеток экстраневрального происхождения. В этом случае активность вируса рекомендуется исследовать на культуре клеток, чувствительной к данному штамму вируса бешенства.

Производственные штаммы вируса бешенства способны обеспечивать иммуногенные свойства, достаточные для образования защитных антител. Рекомендуемая активность составляет не менее 1,0 ME [2].

3.3. Производство ИЛП для профилактики бешенства основано на системе посевных материалов (англ. seed lot system), включающей главный посевной материал и рабочий посевной материал производственных штаммов фиксированного вируса бешенства. Главный посевной материал - вируссодержащий материал (органо-тканевого или культурального происхождения), полученный от исходного вируса, расфасованный в ампулы в процессе одной операции таким образом, чтобы обеспечить однородность, стабильность и предупредить контаминацию чужеродными микроорганизмами. Рабочий посевной материал - вируссодержащий материал (органо-тканевой или на культуре клеток), полученный из главного посевного материала и предназначенный для использования в производстве. Главный и рабочий посевной вирусный материал не содержит бактерий, в том числе микобактерий туберкулеза, посторонних вирусных агентов, грибов и микоплазм.

3.4. Для проверки идентичности штаммов вируса, поддерживаемых в отдельных лабораториях и используемых в производстве антирабических препаратов, могут использоваться моноклональные антитела и метод геномного определения последовательности аминокислотных остатков в белках [3, 4].

IV. Работа с объектами, содержащими фиксированный вирус бешенства

4.1. Работы по вскрытию ампул с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства проводятся в условиях БМБ не ниже II класс ³⁴. Ампулы с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства вскрываются стерильно над подносом или лотком с марлевой салфеткой, пропитанной дезинфицирующим раствором. Верхний конец ампулы нагревается над пламенем горелки, снимается парафин, затем кусочком стерильной ваты, смоченным в стерильной воде, осторожно прикасаются к оттянутому концу ампулы для образования трещины, затем обводят вокруг носика ампулы. После образования круговой (или не полностью круговой) трещины конец ампулы накрывается марлевой салфеткой или ватой и обламывается пинцетом. После отделения верхнего конца в ампулу добавляется 1 мл стерильной воды очищенной, содержащей сыворотку крови лошади нормальную инактивированную в конечной концентрации 2 % и осторожно перемешивается. Полученная суспензия, содержащая фиксированный вирус бешенства, используется для заражения лабораторных животных ³⁵.

------------------------------

³⁴Пункт 333 главы IV СанПиН 3.3686-21.

³⁵Пункт 38(23) приложения 2 приказа Минпромторга России от 14.06.2013 N 916; ГОСТ 33215 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными Правила оборудования помещений и организации процедур", введенный приказом Госстандарта от 09.11.2015 N 1732-ст.

------------------------------

4.2. Манипуляции с фиксированным вирусом бешенства на лабораторных животных осуществляются в соответствии с приложением 3 к настоящим МУ.

4.3. Применение клеточных культур для производства и контроля ИЛП основано на системе создания главного и рабочего банков клеток, охарактеризованных в соответствии с положениями государственной фармакопеи Российской Федерации [5].

Главный банк клеток - запас клеток, полученных из одного посевного пула клеток, сохраняемых в контейнерах в равных частях однородного состава на определенном уровне пассажа при температуре не выше минус 70 °C. Главный банк клеток предназначен для последующего создания рабочего банка клеток.

Рабочий банк клеток - запас клеток однородного состава, полученных из главного банка клеток на определенном уровне пассажа, сохраняемых в контейнерах в равных частях при температуре не выше минус 70 °C. Клетки рабочего банка используются для получения производственной клеточной культуры.

4.4. Работа с фиксированным вирусом бешенства на первичных клеточных культурах осуществляется в соответствии с приложением 4 к настоящим МУ.

4.5. Работа с фиксированным вирусом бешенства на клетках перевиваемых линий.

Клеточная перевиваемая культура, используемая для репродукции фиксированного вируса бешенства, имеет типичную морфологию для данной линии, обладает высокой чувствительностью к заражению вирусом бешенства, сохраняет стабильность биологических свойств. Для выполнения работ по культивированию вируса бешенства на перевиваемых клеточных линиях экстраневрального происхождения (например, Vero) предварительно проводят адаптацию вируса к клеткам данных линий на протяжении не менее 20 - 30 пассажей до достижения необходимого уровня инфекционного титра. Следует отметить, что культуры клеток, полученные из мозговой ткани различных животных, например, культура клеток Neuro-2a, не требует предварительной адаптации к ней аттенуированного вируса бешенства.

В качестве перевиваемой линии клеток обычно используют культуру клеток Vero или любую другую чувствительную культуру клеток (см. табл.), полученную из официальной коллекции клеточных культур с приложением паспорта.

Культивирование фиксированного вируса бешенства на клетках перевиваемых линий осуществляют несколькими методами: стационарным, суспензионным, псевдосуспензионным (на микроносителях), роллерным. Указанные методы с использованием клеток перевиваемых линий в настоящее время применяются при проведении экспериментальных исследований, осуществляемых в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³⁶.

------------------------------

³⁶Глава IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Для наработки монослойной клеточной культуры используют хранящиеся в жидком азоте ампулы рабочего банка клеток. Для формирования монослоя клетки перевиваемой линии после размораживания вносят в культуральный флакон с ростовой питательной средой, рекомендуемой паспортом на используемую клеточную культуру.

Заражение вирусом клеток перевиваемой линии осуществляют в монослой или в суспензию (приложение 4 к настоящим МУ). При инокуляции вируса в клеточную суспензию клетки перевиваемой линии предварительно открепляют от поверхности флакона с помощью раствора версена и трипсина (соотношение 2:1) и суспендируют в питательной среде. Оптимальная концентрация клеток составляет (0,5 - 1,0) х 10 ⁶ кл/мл. К клеточной суспензии добавляют вируссодержащую жидкость в инфицирующей дозе от 0,1 до 1 ИД ₅₀ на 1 клетку.

Сроки и условия культивирования фиксированного вируса бешенства в клетках перевиваемых линий могут отличаться в зависимости от используемых штаммов вируса бешенства и клеточной культуры. На протяжении срока инкубации следует ежедневно оценивать состояние клеточной культуры. Об окончании культивирования вируса бешенства судят по деградации монослоя после его истощения при исследовании методом микроскопии. После завершения культивирования вируссодержащую жидкость центрифугируют при 500 g в течение 5 мин для удаления остатков клеток и используют для дальнейших манипуляций.

V. Использование средств индивидуальной защиты

5.1. Сотрудники лаборатории для проведения работ в "заразной" зоне обеспечиваются рабочей одеждой (пижамами (комбинезонами), медицинскими халатами, шапочками, сменной рабочей обувью) и СИЗ в зависимости от характера выполняемых работ в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³⁷.

------------------------------

³⁷Приложение 3 СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

5.2. Рабочая одежда и обувь являются индивидуальными, соответствуют размерам работающих сотрудников и хранятся отдельно от личной одежды. Смена рабочей одежды проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³⁸.

------------------------------

³⁸Пункт 235 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

5.3. При проведении работ, связанных с заражением животных производственными штаммами, используются противочумный халат и шапочка или защитный комбинезон с капюшоном, фартук из прочного водонепроницаемого материала, медицинские перчатки, защитные щитки (экраны), респиратор не ниже FFP2 класса защиты. Работы по вскрытию черепной коробки проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ³⁹.

------------------------------

³⁹Приложение 3 СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

5.4. Перед сдачей в стирку защитная одежда многоразового применения обеззараживается путем погружения в 3 % раствор хлорамина Б на 30 мин или 1 % раствор хлорамина Б на 1 ч ⁴⁰ или физическими методами в соответствии с приложением 1 к настоящим МУ.

------------------------------

⁴⁰Примечание: допускается использование дезинфицирующих средств с аналогичными или лучшими характеристиками.

------------------------------

VI. Обеззараживание материала и уборка помещений

6.1. Обеззараживание защитной одежды, лабораторной посуды, инструментов, отходов, поверхностей мебели, помещений проводится физическим или химическим методом. Методы и средства обеззараживания определяются в зависимости от характера обеззараживаемого объекта ⁴¹.

------------------------------

⁴¹Пункт 3 главы I СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

6.2. Обеззараживание защитной одежды, лабораторной посуды, инструментов, отходов, поверхностей мебели, помещений физическим методом проводится согласно режимам, указанным в приложении 1 к настоящим МУ.

6.3. Обеззараживание защитной одежды, лабораторной посуды, инструментов, отходов, поверхностей мебели, помещений химическим методом проводится согласно инструкции по применению дезинфицирующих средств, представленных производителем.

Для химической дезинфекции рекомендуется использовать следующие хлорактивные и кислородактивные соединения, спирты и щелочи:

1) хлорактивные соединения:

- хлорамин (содержание активного хлора не менее 24 %) - 1 - 4 % (по препарату) растворы; 0,5 %, 1,5 % (по препарату) активированные растворы хлорамина (в качестве активаторов хлорных препаратов могут использоваться аммонийные соли (хлорид, сульфит или нитрат аммония) в соотношении с хлорным препаратом 1:1 или 1:2 или аммиак в соотношении с хлорактивным средством 1:8);

- гипохлорит кальция (содержание активного хлора 45 - 54 %): 15 %-е осветленные растворы, содержащие не менее 5 % активного хлора;

- дезинфицирующие средства на основе натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты (таблетки, гранулы);

- дезинфицирующие средства на основе трихлоризоциануровой кислоты (например, таблетки, гранулы).

2) кислородактивные соединения:

- водорода перекись (содержание перекиси водорода не менее 30 %) - 3, 6 и 10 %-е растворы (по перекиси водорода);

- водорода перекись медицинская с моющим средством (3, 6 и 30 %-й раствор перекиси водорода с 0,5 % моющего средства) - 3, 6 и 30 %-й (по перекиси водорода) раствор.

3) спирты:

- спирт этиловый (не менее 70 % по массе).

4) щелочи:

- гидроксид натрия натр едкий (4 %-й водный раствор).

Не рекомендуется совместное использование перекись- и хлорсодержащих дезинфицирующих растворов для проведения работ с ПБА, а также их хранение в одном помещении и слив с накоплением в одной емкости.

6.4. Дезинфекцию изделий медицинского назначения и лабораторной посуды проводят способом погружения в раствор дезинфицирующего средства. Разъемные изделия дезинфицируются в разобранном виде. Каналы и полости изделий заполняются дезинфицирующим раствором.

6.5. Дезинфекция металлических ящиков, садков, бачков из-под вскрытых животных проводится способами протирки в соответствии с режимами, рекомендованными для обеззараживания поверхностей, или способом погружения.

Не рекомендуется обеззараживание биологических отходов (тушек лабораторных животных) СВЧ-излучением.

6.6. При хранении дезинфицирующих средств непосредственно в помещении для работы с ПБА не рекомендуется превышать их количество больше необходимого для непрерывного обеспечения текущей работы.

6.7. Контроль концентрации рабочих растворов дезинфицирующих средств осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁴².

------------------------------

⁴²Пункт 223 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

6.8. Перенос растворов дезинфицирующих веществ внутри подразделения производится в специальных емкостях с плотно прилегающими крышками.

6.9. Емкости с приготовленным дезинфицирующим раствором маркируются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁴³.

------------------------------

⁴³Пункт 222 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

6.10. Текущая и генеральная уборка осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁴⁴. Заключительная дезинфекция помещений проводится по завершении производственного цикла работ перед периодом отпусков. Дезинфекции, в том числе с применением аэрозольного метода, подвергаются поверхности лабораторной мебели, приборов, оборудования, стен, потолка. После заключительной дезинфекции в помещениях проводится влажная уборка с применением моющих средств. После влажной уборки включаются бактерицидные лампы.

------------------------------

⁴⁴Пункт 229 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

6.11. Уборочный инвентарь маркируется отдельно для "чистой" и "заразной" зон, не рекомендуется перенос его из зоны в зону. Уборочный инвентарь для помещений "заразной" зоны маркируется в соответствии с назначением, используется и хранится раздельно для каждого помещения "заразной" зоны.

6.12. Обработка бактерицидных ламп осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁴⁵.

------------------------------

⁴⁵Пункт 231 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

VII. Мероприятия при локализации и ликвидации последствий аварий ⁴⁶

------------------------------

⁴⁶Пункты 270 - 292 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

7.1. Для проведения мероприятий по ликвидации последствий аварии в подразделении, проводящем работу с фиксированным вирусом бешенства, в специально отведенном месте хранится аварийная аптечка, комплекты рабочей одежды для переодевания находившихся в зоне аварии сотрудников, комплекты защитной одежды для аварийной бригады, гидропульт, аварийный запас дезинфицирующего средства, активного в отношении фиксированного вируса бешенства, запас воды.

Места нахождения аварийных комплектов маркируются различимой надписью.

Аварийная аптечка укомплектовывается в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁴⁷. В лаборатории, где проводится работа с фиксированным вирусом бешенства, имеется в наличии интерферон или индуктор интерферона ⁴⁸.

------------------------------

⁴⁷Пункт 271 главы IV СанПиН 3.3686-21.

⁴⁸Пункт 272 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Объем мероприятий по ликвидации аварии зависит от характера выполняемой работы, вида и свойств возбудителя, масштабов аварии.

7.2. План ликвидации аварий при работе с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства разрабатывается в соответствии с санитарно-эпидемиологическим требованиями ⁴⁹.

------------------------------

⁴⁹Пункт 147 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

В случае аварии сотрудники, работающие с фиксированным вирусом бешенства, действуют в соответствии с разработанным планом ликвидации аварии и санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁵⁰.

------------------------------

⁵⁰Пункты 276, 277, 278, 279, 284, 285 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Дальнейшие мероприятия по локализации аварии и устранению ее последствий и принятие решений о возобновлении работ с фиксированным вирусом бешенства так же осуществляются в соответствии с разработанным планом ликвидации аварии и санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁵¹.

------------------------------

⁵¹Пункты 286 - 294 главы IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

7.3. При авариях с ранением или попаданием вируссодержащей жидкости на слизистые оболочки проводят профилактическую вакцинацию против бешенства. Курс иммунизации с использованием антирабической вакцины и, при необходимости, антирабического иммуноглобулина, проводится согласно инструкциям по их применению.

Нормативные и методические документы

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Федеральный закон от 30.12.2020 N 492-ФЗ "О биологической безопасности в Российской Федерации".

3. Федеральный закон от 04.05.2011 N 99-ФЗ "О лицензировании отдельных видов деятельности".

4. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

5. СанПиН 2.1.3684-21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению населения, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий".

6. Приказ Минздрава России от 06.12.2021 N 1122н "Об утверждении национального календаря профилактических прививок, календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям и порядка проведения профилактических прививок".

7. Приказ Минздрава России от 28.01.2021 N 29н "Об утверждении порядка проведения обязательных предварительных и периодических медицинских осмотров работников, предусмотренных частью четвертой статьи 213 трудового кодекса Российской Федерации, перечня медицинских противопоказаний к осуществлению работ с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также работам, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры".

8. Приказ Минтруда России и Минздрава России от 31.12.2020 N 988н/1420н "Об утверждении перечня вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные медицинские осмотры при поступлении на работу и периодические медицинские осмотры".

9. Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 N 916 "Об утверждении Правил надлежащей производственной практики".

10. Р 3.5.1904-04 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях".

11. МУ 1.3.3103-13 "Организация работы лабораторий, использующих методы электронной и атомно-силовой микроскопии при исследовании культур микроорганизмов I - IV групп патогенности".

12. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности".

13. ГОСТ 26075 "Животные. Методы лабораторной диагностики бешенства".

14. ГОСТ 33215 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур".

Библиографические ссылки

1. ФС.3.3.1.0038.15 Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4; 2018.

2. ФС.3.3.1.0025.15 Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4; 2018.

3. World Health Organization. Expert Consultation on Rabies. Technical Report Series 1012, Geneva, Switzerland; 2018.

4. Игнатьев Г.М. Молекулярно-генетическое исследование стабильности и подтверждение подлинности штамма Внуково-32, применяемого для производства вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной сухой / Г.М. Игнатьев, А.С. Океании, Л.П. Антонова, Т.Г. Самарцева, С.В. Мосолова, К.М. Мефед, Л.В. Гмыль, Н.А. Нетесова // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020. Т. 20. N 2. С. 107 - 115.

5. ОФС 1.7.2.0011.15 Требования к клеточным культурам - субстратам производства биологических лекарственных препаратов. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2; 2018.

6. Методы лабораторных исследований по бешенству. 3-е изд. ВОЗ. Женева, 1975.

7. Laboratory techniques in rabies. 1st Edition. WHO, 1954.

8. Laboratory techniques in rabies. 4th Edition. WHO, 1996.

9. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2022.

10. Laboratory techniques in rabies. 5th Edition. WHO, 2019.