Методические указания МУК 4.1.3843-23 "Методика измерений массовой концентрации прегн-4-ен-3,20-диона (прогестерон) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 18 января 2023 г.)

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Методические указания МУК 4.1.3843-23
"Методика измерений массовой концентрации прегн-4-ен-3,20-диона (прогестерон) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 18 января 2023 г.)

Введены впервые

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 205-12/RA.RU.311787/2021.

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) для измерений массовой концентрации прогестерона в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,0025 - 0,030 мг/м ³.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, осуществляющими исследования в области качества и безопасности воздуха рабочей зоны по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

II. Физико-химические и токсикологические свойства

2.1. Физико-химические свойства прогестерона.

Эмпирическая формула: С ₂₁Н ₃₀О ₂.

Молекулярная масса: 314,47.

Регистрационный номер CAS: 57-83-0.

Прогестерон - белый или почти белый, кристаллический порошок или бесцветные кристаллы с температурой плавления плюс 128 - 132 °C, очень мало растворим в воде (менее 1 мг/см ³), растворим в этаноле (63 мг/см ³), в метаноле, трудно растворим в диметилсульфоксиде, в растительных маслах.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.2. Токсикологическая характеристика прогестерона:

- относится к группе женских половых гормонов, подгруппе гестагены (прогестины), применяется при прогестерондефицитных состояниях, для контрацепции и при менопаузальной гормональной (заместительной) терапии у женщин (в сочетании с эстрогенсодержащими препаратами), при подготовке к экстракорпоральному оплодотворению;

- оказывает прогестогенное, антигонадотропное, антиэстрогенное и слабое антиандрогенное действие;

- обладает кожно-резорбтивной и кумулятивной активностью, многочисленными побочными эффектами, потенциальной способностью вызывать фотосенсибилизацию и развитие отдаленных эффектов (мутагенный, канцерогенный, нарушение репродуктивной функции).

III. Метрологические характеристики

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации прогестерона метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности Р = 0,95).

Таблица 1

Метрологические характеристики методики

Диапазон измерений массовой концентрации прогестерона, мг/м 3	Показатель точности (границы относительной погрешности), , %, при Р = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости),  r, %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости),  R, %	Предел повторяемости, r, %, Р = 0,95, n = 2	Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, CD 0,95, % (n 1 = n 2 = 2)
От 0,0025 до 0,030 вкл.	17	3	5	8	12

IV. Метод измерений

4.1 Измерение массовой концентрации прогестерона выполняют методом ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектированием. Метод основан на разделении прогестерона и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом с последующей регистрацией прогестерона с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации прогестерона.

Измерение проводят при длине волны 241 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое содержание прогестерона в анализируемом объеме пробы - 0,02 мкг.

Нижний предел измерений массовой концентрации прогестерона в воздухе - 0,0025 мг/м ³ (при отборе 800 дм ³ воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе прогестерона. Измерению не мешают: оливковое масло, персиковое масло, лецитин соевый.

V. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

5.1. Средства измерений

Хроматограф жидкостной с ультрафиолетовым детектором, термостатом колонки и соответствующей системой сбора данных
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, диапазон взвешивания по шкале 1 - 100 мг, цена деления шкалы 1 мг, погрешность взвешивания по шкале 0,2 мг	ГОСТ OIML R 76-1
Аспирационное устройство, обеспечивающее отбор анализируемого воздуха не менее, чем по 2 каналам с диапазоном расхода 40,0 - 200 дм 3/мин и пределом допустимой погрешности 5 %	ТУ 4215-000-11696625
Колбы мерные, 2-50-2, 2-100-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770
Пипетки 1-1-2-1, 1-1-2-5, 1-2-2-10, 1-2-2-25	ГОСТ 29227
Пробирки мерные с пришлифованными пробками, П-2-10-14/23 ХС	ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 1-250, 1-1000	ГОСТ 1770
Микрошприц для хроматографии вместимостью 0,1 см 3	ТУ 4215-002-84030495

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.2. Реактивы

Прогестерон с содержанием основного вещества не менее 97 % в пересчете на сухое вещество, НД Европейская фармакопея 8.0 (англ. European Pharmacopoeia 8.0)
Ацетонитрил особо чистый	ТУ 6-09-14-2167
Спирт метиловый, химически чистый	ГОСТ 6995
Вода дистиллированная	ГОСТ Р 58144
Вода особо чистая	ТУ 6-09-2502

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Колонка аналитическая, размером 250 мм х 4,6 мм, заполненная сорбентом С18 с размером частиц 5,0 мкм
Аналитические аэрозольные фильтры гидрофобные на основе перхлорвинила с площадью рабочей поверхности 20 см 2	ТУ 95-1892
Фильтродержатели	ТУ 95-1021
Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм	ТУ 9471-002-10471723
Бюксы стеклянные, СН-70/35	ГОСТ 25336
Палочки стеклянные	ГОСТ 25336
Воронки химические	ГОСТ 25336

Примечание. Допускается применение оборудования, вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

VI. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.1.005.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов ¹².

ГАРАНТ:

Нумерация сноски приводится в соответствии с источником

------------------------------

¹²Таблицы 2.1 и 2.2 СанПин 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и/или безвредности для человека факторов среды обитания", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 2 (зарегистрировано в Минюсте России 29.01.2021 регистрационный N 62296).

------------------------------

VII. Квалификация оператора

7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

VIII. Условия измерений

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха плюс	(20 5) °C;
- атмосферное давление	84 - 106 кПа;
- относительная влажность воздуха, не более	80 %.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

IX. Подготовка к выполнению измерений

9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

Приготовление растворов

9.2. Приготовление основного раствора прогестерона: основной раствор прогестерона с массовой концентрацией 500 мкг/см ³ готовят растворением (0,0500 0,0002) г прогестерона в спирте метиловом в мерной колбе вместимостью 100 см ³. Срок хранения раствора 2 недели в холодильнике.

9.3. Приготовление рабочего раствора прогестерона N 1: рабочий раствор прогестерона N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/см ³ готовят разбавлением 10,0 см ³ основного раствора прогестерона спиртом метиловым в мерной колбе вместимостью 50 см ³. Срок хранения раствора 1 неделя в холодильнике.

9.4. Приготовление рабочего раствора прогестерона N 2: рабочий раствор прогестерона N 2 с массовой концентрацией 20 мкг/см ³ готовят разбавлением 10,0 см ³ рабочего раствора прогестерона N 1 спиртом метиловым в мерной колбе вместимостью 50 см ³. Срок хранения раствора 1 сутки в холодильнике.

9.5. Приготовление подвижной фазы: смесь воды особо чистой и ацетонитрила с объемным соотношением (20:80): в мерной колбе вместимостью 1000 см ³ смешивают 200 см ³ воды особо чистой и 800 см ³ ацетонитрила. Перед использованием подвижную фазу фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазируют. Срок хранения раствора 1 месяц в хорошо укупоренной таре, в защищенном от света месте в холодильнике.

Подготовка хроматографа

9.6. Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Установление градуировочной характеристики

9.7. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания прогестерона в анализируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии и контрольного раствора N 0 согласно табл. 2.

Таблица 2

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении прогестерона

Номер градуировочного раствора	Объем рабочего раствора N 1 с концентрацией прогестерона 100 мкг/см 3, см 3	Объем рабочего раствора N 2 с концентрацией прогестерона 20 мкг/см 3, см 3	Содержание прогестерона на фильтре, мкг	Массовая концентрация прогестерона в градуировочном растворе, мкг/см 3	Содержание прогестерона в анализируемом объеме градуировочного раствора, мкг
0 *	0,00	0,0	0,0	0,0	0,00
1	0,00	0,1	2,0	0,2	0,02
2	0,00	0,2	4,0	0,4	0,04
3	0,00	0,4	8,0	0,8	0,08
4	0,12	0,0	12,0	1,2	0,12
5	0,18	0,0	18,0	1,8	0,18
6	0,24	0,0	24,0	2,4	0,24
Примечание: * - контрольный раствор. Градуировочные растворы используют свежеприготовленные.

На аэрозольные фильтры, помещенные в бюксы, пипеткой вместимостью 1 см ³ наносят рабочий раствор прогестерона N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/см ³ и рабочий раствор прогестерона N 2 с массовой концентрацией 20 мкг/см ³ в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре, затем, используя пипетку вместимостью 5,0 см ³, приливают по 5,0 см ³ спирта метилового и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 см ³. Фильтры повторно обрабатывают 5,0 см ³ спирта метилового и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же пробирки и доводят объем до 10,0 см ³ спиртом метиловым. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы. Аналогично обрабатывается чистый аэрозольный фильтр (контрольный раствор).

Инжектируют в хроматограф по 0,1 см ³ каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания прогестерона в анализируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

Условия хроматографирования

9.8. Условия хроматографирования градуировочных растворов и анализируемых проб:

- длина волны детектора	241 нм;
- объем вводимой пробы	0,1 см 3;
- температура колонки	плюс 25 °C;
- расход подвижной фазы	0,8 см 3/мин;
- подвижная фаза: смесь воды особо чистой и ацетонитрила с объемным соотношением (20:80);
- время удерживания прогестерона	не менее (9,4 0,5) мин.

Контроль стабильности градуировочной характеристики

9.9. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа (после ремонта и поверки прибора). Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.7 (соответствующих началу, середине и концу диапазона измерений) и анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где

(1)

S _изм, S _гр - значение площади пика (приборные единицы) прогестерона в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

К _гр - норматив контроля: