Приложение 3. Методические указания по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов

Приложение 3

к приказу Минздрава СССР

от 1 декабря 1986 г. N 858

Методические указания
по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов

1. Показания к лабораторному исследованию

Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и ГМ осуществляется бактериологическим методом путем выделения и идентификации возбудителя, серологическим - путем выявления специфических антигенов в жидкостях организма (ликвор, кровь, синусоидальная жидкость и др.) или антител в сыворотке крови *(1). Лабораторное обследование проводят с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям. С диагностической целью обследуют больных с клинически выраженной формой заболевания, стертой формой (назофарингит) и с подозрением на менингококковую инфекцию и менингиты иной этиологии.

По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больными менингококковой инфекцией.

2. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции и других гнойных бактериальных менингитов

В связи с тем, что наряду с менингококками, наиболее частыми этиологическими факторами ГМ могут быть пневмококки, а у детей младшего возраста Н. influenzae и др. возбудители, представляется целесообразным изложение основных дифференциально-диагностических признаков и методов выделения этих микроорганизмов. По классификационной систематике бактерий Bergey (1 том, 1984), менингококи # принадлежат к семейству Neisseriaceae роду Neisseria. Род нейссерий включает два вида патогенных микроорганизмов: N. meningitidis и N. gonorrhoeae, остальные представители этого рода являются резидентной флорой слизистых оболочек. К последним относятся пигментообразующие, объединенные в один вид N. subflava, а также N. sicca, N. mucosa, N. flavescens, N. lactamica. Катаральный диплококк выделен в род Moraxella и обозначен как Moraxella (Branhainella) catarrhalis.

Менингококки требовательны к условиям культивирования. При росте требуют повышенной влажности и 5-10% содержания CO2 в воздухе, чувствительны к малейшим отклонениям температуры. В качестве источника пативного белка рекомендуется применять сыворотку крупного рогатого скота, лошадиную или кровь любого другого животного. Основой для приготовления сред могут служить бульоны на основе гидролизата мяса по Хоттингеру, "эритрит-агар", агар АГВ, сухой питательный агар специального назначения, выпускаемый Дагестанским институтом питательных сред или "Аминопептид для микробиологических питательных сред" (жидкий, производства Ставропольского мясоконсервного комбината, ТУ-92-14/356-80).

Идентификация вида N. meningitidis основана на комплексе морфологических, тинкториальных, культурных и биохимических признаков (табл. 1). При первом выделении клеткам менингококков свойственен полиморфизм, который проявляется в различной величине и разной интенсивности окрашивания микробных клеток. Колонии менингококков имеют маслянистую консистенцию, легко снимаются петлей со среды, что отличает их от колоний непатогенных нейссерий, имеющих крошащуюся или тянущуюся консистенцию. Некоторые штаммы, выделенные из СМЖ, могут обладать слабой ферментативной активностью в отношении глюкозы или мальтозы или обоих углеводов. Большинство непатогенных видов нейссерий, в отличие от патогенных, способны при выращивании на сывороточном агаре с 5% сахарозы образовывать крахмалоподобное вещество (полисахарид), выявляемое с помощью водного раствора Люголя, в виде появления бурого окрашивания культуры.

Менингококки делятся на следующие серогруппы: А, В, С, X, Y, Z, 29Е и 135W. Проведение серологического группирования менингококков является обязательным для практических лабораторий, как одна из мер эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Наличие ферментов оксидазы и каталазы присуще всем нейссериям и М. catarrhalis в отличие от гемофилов и пневмококков, что может служить дифференцирующим признаком при их идентификации в сочетании с другими (табл. 2).

Пневмококки и гемофилы, как и менингококки, являются высокотребовательными к культивированию микроорганизмами. В качестве фактора, способствующего их росту используют кровь различного происхождения. Поэтому универсальной средой для всех возбудителей может служить "шоколадный" агар.

Таблица 1

Культуральные и биохимические свойства нейссерий и М. catarrhalis

/------------------------------------------------------------------------

|              |Отношение к усло-|     |     |

|              |виям культивиро- |Зави-|обра-|Сахаралитическая активность

|Возбудитель   |     вания       |си-  |зо-  |

|              |-----------------|мость|вание|---------------------------

|              |      Рост на    |роста|пиг- |    |     |     |    |

|              |-----------------|от   |мента|глю-|маль-|саха-|лак-|фрук-

|              |сыво-|бес- |среде|СО2  |     |коза|тоза |роза |тоза|тоза

|              |ро-  |сыво-|с    |при  |     |    |     |     |    |

|              |точ- |ро-  |0,2% |пер- |     |    |     |     |    |

|              |ном  |точ- |желчи|вич- |     |    |     |     |    |

|              |агаре|ном  |     |ном  |     |    |     |     |    |

|              |37°С |агаре|     |выде-|     |    |     |     |    |

|              |     |37°С |     |лении|     |    |     |     |    |

|--------------+-----+-----+-----+-----+-----+----+-----+-----+----+-----

|N. gonorrhocae|  +  |  -  |  -  |  +  |  -  | К  |  -  |  -  |  - |  -

|              |     |     |     |     |     |    |     |     |    |

|N. meninitidis|  +  |  -  |  -  |  +  |  -  | К  |  К  |  -  |  - |  -

|N. subflava   |  +  |  +  |  +  |  -  |  +  | К  |  К  |  -  |  - |  -

|              |     | (-) |     |     |     |    |     |     |    |

|perflava      |  +  |  -  |  +  |  -  |  +  | К  |  К  |  К  |  - |  К

|flava         |  +  | (+-)|  +  |  -  |  +  | K  |  K  |  -  |  - |  K

|N.  sicca     |  +  |  +  |  +  |  -  |  +  | k  |  k  |  k  |  - |  K

|              |     | (-) | (-) |     | (-) |    |     |     |    |

|N. mucosa     |  +  |  +  |  +  |  -  |  -  | K  |  K  |  K  |  - |  K

|N. flavescens |  +  |  +  |  +  |  -  |  +  | -  |  -  |  -  |  - |  -

|N. lactamica  |  +  |  +  |  +  |  -  |  +  | K  |  K  |  -  |  K |  -

|              |     |     |     |     |     |    |     |     |    |

|N. (Br.)      |     |     |     |     |     |    |     |     |    |

|catarrhalis   |  +  |  +  |  +  |  -  |  -  | -  |  -  |  -  |  - |  -

|              |     |     |     |     |     |    |     |     |    |

/-------------------------------------\

|              |             |        |

|              | Образование |Редук-  |

|Возбудитель   | полисахарида|ция **  |

|              | на нагаре с |--------|

|              | 5% сахарозы |нит-|ни-|

|              |             |ра- |ра-|

|              |             |тов |тов|

|              |             |    |   |

|              |             |    |   |

|              |             |    |   |

|              |             |    |   |

|              |             |    |   |

|              |             |    |   |

|--------------+-------------+----+---|

|N. gonorrhocae|      -      | -  | - |

|              |             |    |(+)|

|N. meninitidis|      -      | -  | - |

|N. subflava   |             |    |   |

|              |             |    |   |

|perflava      |      +      | -  | + |

|flava         |      -      | -  | + |

|N.  sicca     |      +      | -  | + |

|              |             |    |   |

|N. mucosa     |      +      | +  | + |

|N. flavescens |      +      | -  | + |

|N. lactamica  |      -      | +  | + |

|              |             |    |   |

|N. (Br.)      |             |    |   |

|catarrhalis   |      -      | -  | + |

|              |      -      | -  | + |

Обозначения:

К - образование кислоты; (-) - редко;

** - тест используют как дополнительный при дифференциации непатогенных нейссерий

Примечание: приготовление питательных сред, дифференциально-диагностических (среды с углеводами), приготовление реактивов для исследования редукции нитратов и нитритов, постановка этих реакций и учет. См. приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования".

Таблица 2

Свойства основных возбудителей менингитов, учитываемые через 24 часа от начала бактериологического исследования

/------------------------------------------------------------------------

|                 |Интенсивность |                     |         |      |

|                 |роста на агаре|Изменение цвета      |Обработка|Грам- |

|Морфология клеток|--------------|"шоколадного"        |колонии  |ок-   |

|                 |20% сы-|"шоко-|агара вокруг         |3%  КОН *|раска |

|                 |воро-  | лад- |колонии              |         |      |

|                 |точном | ном" |                     |         |      |

|-----------------+-------+------+---------------------+---------+------+

|Капсульные поли- |  ++++ | ++++ |          -          |     +   |   -  |

|морфные кокки    |       |      |                     |         |      |

|                 |       |      |                     |         |      |

|Мелкие полиморф- |    -  | ++++ |          -          |     +   |   -  |

|ные палочки      |       |      |                     |         |      |

|                 |       |      |                     |         |      |

|Капсульные удли- |  ++++ | ++++ | Желто-зеленый       |     -   |   +  |

|ненные    парные |       |      |                     |         |      |

|кокки            |       |      |                     |         |      |

|                 |       |      |                     |         |      |

|Цепочки и   пары |  ++++ | ++++ | Зеленый             |     -   |   +  |

|из кокков        |       |      |                     |         |      |

|                 |       |      |                     |         |      |

|Мелкие   палочки |  ++++ | ++++ | Зелено-коричневый   |     -   |   +  |

|"частоколом"   и |       |      |                     |         |      |

|под углом        |       |      |                     |         |      |

|                 |       |      |                     |         |      |

|Пары и   цепочки |  ++++ | ++++ |          -          |     +   |   -  |

|коккобактерий    |       |      |                     |         |      |

|                 |       |      |                     |         |      |

/-------------------------------------------------\

|                 |   Наличие **   |              |

|                 |                |              |

|Морфология клеток|----------------|Подозреваемые |

|                 |окси-|ката-|уре-|микроорганизмы|

|                 |дазы |лазы |азы |              |

|                 |     |     |    |              |

|-----------------+-----+-----+----+--------------|

|Капсульные поли- |  +  |  +  |  - |Neisseria     |

|морфные кокки    |     |     |    |meningitidis  |

|                 |     |     |    |              |

|Мелкие полиморф- |  -  |  +  |  + |Naemophilus   |

|ные палочки      |     |     |    |influenzae    |

|                 |     |     |    |              |

|Капсульные удли- |  -  |  -  |  - |Sirepiococcus |

|ненные    парные |     |     |    |preumoniae    |

|кокки            |     |     |    |              |

|                 |     |     |    |              |

|Цепочки и   пары |  -  |  -  |  - |Strepiococci  |

|из кокков        |     |     |    |В. D. viridens|

|                 |     |     |    |              |

|Мелкие   палочки |  -  |  +  |  - |L??????       |

|"частоколом"   и |     |     |    |monocytogenes |

|под углом        |     |     |    |              |

|                 |     |     |    |              |

|Пары и   цепочки |  -  |  +  |  + |Meinetobacter |

|коккобактерий    |     |     |    |calcoacelieum |

|                 |     |     |    |              |

Примечание.

* В каплю 3% раствора КОН вносят петлю (колонию) культуры, эмульгируют. Образование в капле студенистой массы, тянущейся за петлей указывает на наличие грамотрицательной флоры (-), крошащуюся консистенцию образует грамположительная флора (+).

** Постановка реакции на оксидазу, каталазу, уреазу см, приказ МЗ СССР N 535.

3. Бактериологическое исследование спинномозговой жидкости больного

3.1. 1-й день исследования. Спинномозговую жидкость (СМЖ) в количестве 2-5 мл берут у больного сразу же при поступлении в стационар с соблюдением всех правил асептики. Взятие ликвора проводится персоналом в масках.

Первую порцию СМЖ (около 1 мл) берут в отдельную пробирку для проведения общего ликворологического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования, наливают в стерильную центрифужную или агглютинационную пробирку. Касаться руками краев канюли и краев пробирки нельзя. Ватную пробку полагается держать на весу за ее наружную часть. Если немедленно доставить жидкость в лабораторию невозможно, допустимо хранение в течение нескольких часов в термостате при температуре 37° или в термосе. Во время транспортировки СМЖ следует тщательно предохранять от охлаждения (например, доставлять в термосе). СМЖ исследуют немедленно при доставке в лабораторию. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3-0,5 мл материала и по 2-3 капли засевают на поверхность 2 чашек Петри с подогретой питательной средой, растирая шпателем. Одна чашка содержит "шоколадный" агар, вторая - сывороточный. Посевы ставят в термостат при 37° и создают условия повышенного содержания CO2 в воздухе.

Спинномозговую жидкость, оставшуюся в пробирке, используют для посева на среду "обогащения" (полужидкий агар) и одновременно в реакции встречного иммуноэлектрофореза *(2.) (п.11.3).

Оставшийся в пипетке материал используют для приготовления мазков. Отношение к окраске по Граму у нейссерий выражено недостаточно четко, поэтому они окрашиваются метиленовой синью или по Граму в модификации Калины. Прямая микроскопия окрашенных мазков спинномозговой жидкости в известной части случаев позволяет установить наличие бактерий, вызывающих гнойный менингит. Морфология менингокков описана выше. Н. influenzae видна в виде мелких полиморфных грамотрицательных палочек и нитей, окруженных еле заметной нежной капсулой. Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококков и коротких цепочек, образуют капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся всеми анилиновыми красками, при этом капсула остается неокрашенной и заметна только на окрашенном фоне *(3). Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа. При достаточном количестве исследуемого материала рекомендуется 2-3 капли засеять на чашку с питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам.

3.2. 2-й день исследования. Независимо от результатов бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр чашек ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа, лупы МБС. Во внимание принимают все колонии. Чашки с отсутствием роста инкубируют дополнительно одни сутки. Готовят препараты-мазки, окрашивают, ставят реакцию с 3% раствором КОН и биохимические тесты - на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофилам присущ резкий специфический запах, исходящий от посевов.

Морфология менингококковых колоний на сывороточном агаре описана во всех руководствах по микробиологии. На "шоколадном" агаре колонии нежные, сероватого цвета, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую консистенцию, размерами от 0,1 до 3,0 мм. Менингококки не меняют цвета среды. На основании микроскопии мазков из колоний и результатов первичных биологических тестов возможна выдача предварительного ответа. Если в мазках обнаружены грамотрицательные кокки, это дает право отнести их к роду нейссерий и провести дифференциацию видов.

Гемофилы на "шоколадном" агаре дают довольно обильный рост. Колонии серого цвета, плоские диаметром 0,2-2,0 мм, легко снимаются со среды. В мазках, окрашенных по Граму, видны мелкие короткие грамотрицательные палочки с капсулой разной степени выраженности, а также нити разной длины, и короткие цепочки. На сывороточном агаре Н. influenzae не растет *(4). Крупные (3-5 мм) колонии, содержащие грамотрицательные палочки, подозрительны на энтеробактерии. Candida и P. aeruginosa растут обильно на всех средах, не изменяя цвета "шоколадного" агара.

Колонии пневмококков на обеих средах - мелкие (диаметром 0,1-1,0 мм),иногда плоские, с вдавлением в центре. На "шоколадном" агаре они окружены зоной желто-зеленого гемолиза (тип альфагемолиза). По внешнему виду колонии пневмококков на обеих средах трудно отличить от колоний стрептококков группы В, зеленящих стрептококков, энтерококков (S. feacalis), которые в редких случаях могут вызвать менингит, особенно у детей 1 года. В мазках из колоний пневмококки имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде коротких цепочек из 2-3 пар.

Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды, изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительность (табл. 1, 2). Определение чувствительности энтеробактерии и стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для определения чувствительности к антибиотикам менингококков, при добавлении 20% сыворотки, Н. influenzae и пневмококков - при добавлении соответствующего количества крови. Приготовление питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность производится в соответствии с действующими указаниями *(5).

В таблице 2 суммировано минимальное число признаков, достаточное для того, чтобы выделенные из СМЖ бактерии предположительно отнести к тому или иному таксону (от семейства до вида) и избрать дальнейший путь идентификации. На этом этапе возможна выдача предварительного (а для Н. influenzae окончательного) ответа.

Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный сывороточный агар или сектор этой среды в чашке на бессывороточный агар и помещают в термостат при 37°. Колонии, подозрительные на пневмококки и др. стрептококки, отсевают на 2 сектора кровяного агара (с 5% крови) для последующего определения чувствительности к желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.

Если число выросших колоний мало (1-2), то их отсевают на чашку с сывороточным или "шоколадным" агаром для накопления микробной массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки.

При менингитах новорожденных и детей раннего возраста, а также изредка и в других возрастных группах, помимо трех перечисленных видов микроорганизмов этиологическими факторами могут быть энтеробактерии (Е. cjli, S. marcesctns, К. pneumonift, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P. aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes, различные стрептококки гемолитические группы В, "зеленящие" и энтерококки, а также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода Candida.

При подозрении на энтеробактерии *(6), синегнойную палочку *(7), стафилококк *(8) и Ac. calcoaceticum проводят исследования в соответствии с имеющимися методическими материалами +.

При подозрении на листерии в этот день, если число колоний позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к антибиотикам. Для L. monocytogenes помимо признаков, указанных в табл. 2, характерно: подвижность при комнатной температуре, разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту, манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются медленно. L. monocytogenes образуют краевую зону гемолиза на arape с 5% бараньей крови, разлитом слоем 3 мм.

Для идентификации Candida albicans делают посев из подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих из дрожжевых клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100 ME/мл пенициллина и стрептомицина.

Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста колоний, то делается высев на чашки с сывороточным "шоколадным" агаром из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким агаром (среда "обогащения").

При отрицательных результатах высев со среды "обогащения" повторяют через 1-2 дня в течение 7 дней инкубации в термостате.

При получении роста колоний исследование их проводят тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.

3.3. 3-й день исследования. Культуры, отсеянные из отдельных колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3% раствором КОН. Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают. При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков, проводят идентификацию (см. табл. 1), серогруппирование идентифицированной культуры (п. 11), а также используют эту культуру для определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были сделаны на 2-й день).

Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме пневмококков и стрептококков).

Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных стрептококков (энтерококков) после микроскопии чистых культур на секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших колоний и ставят дополнительно пробы *(9) (см. табл. 3).

На одних из двух секторов кровяного агара с ростом колоний накладывают диск из фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором желчи (на физиологическом растворе), после чего чашку помещают при 37° на 1-2 часа. По истечении этого времени вокруг диска колонии пневмококков лизируются, образуя зону отсутствия роста шириной 1-2 мм, в то время как рост прочих стрептококков остается интактным. При положительной пробе чувствительности к желчи, при условии типичной морфологии клеток и колоний, можно дать положительный ответ о выделении пневмококков. Рост культуры на 2-м секторе кровяного агара используют для постановки пробы на чувствительность к лекарственным препаратам (если это не было сделано ранее).

При отрицательных результатах пробы на чувствительность к желчи, рост на 2-м секторе используют не только для испытания чувствительности к химиопрепаратам, но и для постановки ряда тестов, дифференциирующих # стрептококки (см. табл. 3).

Таблица 3

Дифференцирующие свойства стрептококков, вызывающих менингит

Виды Свойства	S, pneumoniae	S. faecalis (гр. Д)	S. agalactiae (гр. В)	"Зеленя- щие"*
Гемолиз на 5% кровяном агаре САМР-тест** Лизис на кровяном агаре вокруг диска с 20% жел- чью Рост после прогрева при 60° С, 30 мин. Разложение маннита Примечание * В группу "зеленя изученных стрептококко ** Приказ МЗ СССР N микробиологических (ба применяемых в лечебно-профилактическ	альфа - + - + или - их" стреп . 535 от 2 териологич клиник х учрежден	альфа, бет- та, гамма - - + + ококков от апреля 1 ских) -диагностич й".	бетта + - - - осятся 9 в 85 г. "Об у етодов исс ских лаб	альфа - - - - дов мало ификации едования, раториях

В этот же день ставят пробы для идентификации других возможных возбудителей, а также тест на лекарственную чувствительность (если это не было сделано на 2-й день).

3.4. 4-й день исследования. Учитывают результаты посевов с целью дифференциации менингококков от непатогенных нейссерий и М. catarrhalis и чувствительности к химиопрепаратам (если это не было сделано на 3-й сутки). Возможна выдача положительного ответа. Культуру менингококков, выросшую на сывороточном агаре при температуре 37, можно использовать для серологической идентификации менингококков в реакции агглютинации или в реакции пренинитации в агаре, а также для определения лекарственной устойчивости.

Учитывают результаты проб на лекарственную чувствительность и прочие свойства у других возбудителей, выдают окончательный положительный ответ.

При выделении возбудителя только с помощью метода обогащения окончательный положительный ответ выдается позднее (в зависимости от длительности инкубации "обогащенных" посевов в термостате.

4. Бактериологические исследования крови

При подозрении на менингококцемию или сепсис проводят бактериологическое исследование крови. В качестве экспресс-метода диагностики рекомендуется приготовление мазка толстой капли из крови, взятой из вены или пальца.

В препарате "толстой капли" менингококки имеют преимущественно такую же морфологию, как в спинномозговой жидкости, но чаще располагаются поодиночке, имеют более круглую форму. В мазке, имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно-синий цвет лейкоциты и между ними множество мелких, темно-синих, располагающихся кучками, парно и по одному, кокков. Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа.

Несколько капель крови, взятой стерильно из вены, засевают на чашки с выше указанными питательными средами, а затем на 0,1% полужидкий агар в отношении 1:10, т.е. 1-2 мл крови можно посеять в пробирку с 7-10 мл полужидкого агара или 5-10 мл крови засеять во флакон с 50 мл среды. После суточной инкубации материал высевают на сывороточный агар и "шоколадный" в чашки Петри. При отрицательном результате рекомендуется инкубация в течение недели с ежедневным или через день высевами. Выделение и идентификацию гемокультур проводят так же, как при исследовании спинномозговой жидкости.

5. Бактериологическое исследование экссудата из петехий

При менингококкцемии иногда удается обнаружить менингококки непосредственно в эксудате кожных петехий. Для этого вначале обтирают кожу вокруг петехий 70% спиртом. В случае образования некроза в центре петехий эксудат можно взять прокаленной и остуженной бактериологической петлей из некротизированных участков. При неповрежденной коже эксудат берут стерильной тонкой иглой, соединенной со шприцем, в котором имеется 0,1-0,2 мл физиологического раствора. Физраствор вводят в толщу петехий и отсасывают обратно.

Посев эксудата производят в чашки Петри с сывороточным агаром, содержащим антибиотики ристомицин или линкомицин (п.п.10.1, 10.2) для подавления кожной флоры. Из остатка эксудата готовят препараты-мазки. Мазки из содержимого петехий можно приготовить в виде отпечатков. Для этого стерильной петлей осторожно скарифицируют поверхность петехий, затем прикладывают несколькими местами предметное стекло (стерильное), фиксируют пламенем горелки, окрашивают. На основании данных микроскопии возможна выдача предварительного ответа.

Засеянные чашки инкубируют при 37° 24 часа (в случае отсутствия роста - 48 часов); подозрительные на менингококки колонии отсевают и изучают по описанной схеме (п.3).

6. Бактериологическое исследование носоглоточной слизи на менингококки

1-й день исследования. Исследуемый материал - слизь с задней стенки глотки - берут натощак или через 3-4 часа после еды стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке. Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень языка. Тампон вводят концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2-3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не должен касаться зубов, слизистой щек, языка и язычка.

Материал может быть засеян на месте его взятия на чашку Петри с питательной средой, или погружен в пробирку с транспортной средой, или средой обогащения *(10), или взят смоченным тампоном, который затем доставляют в лабораторию (п.10.4). При посеве на чашку материал втирают по поверхности небольшого участка (1х2 см) среды всеми сторонами тампона, затем этим же тампоном засевают штрихами (с отрывом) по всей площади, отведенной для посева.

Используют сывороточный агар с добавлением в него антибиотиков, подавляющих рост грамположительных кокков. Для этой цели применяются ристомицин или линкомицин в оптимальной концентрации (п.п.10.1, 10.2). На одну чашку можно засеять две пробы. Однако встречаются отдельные штаммы менингококков, более чувствительные к линкомицину, поэтому те же пробы одновременно засевают на половину чашки с сывороточным агаром без линкомицина.

При отсутствии линкомицина или ристомицина можно использовать диски с этими антибиотиками. Диски (не более 2-х) накладывают непосредственно на поверхность засеянного сывороточного агара. В этом случае на 1 чашку сеют только одну пробу. Через 1 сутки вокруг диска, в зоне 1 см, рост грамположительной флоры будет подавлен, что увеличивает возможность выделения колоний нейссерий.

Засеянные чашки доставляют в лабораторию, тщательно защищая их от охлаждения, в зимнее время применяя грелки (35-40°) и немедленно помещают в термостат при температуре 37°.

Тампоны с исследуемым материалом, погруженные в полужидкую или транспортную среду, доставляют в лабораторию, также тщательно защищенными от охлаждения. Тампоны в 0,1 % полужидком агаре (обогащения) помещают в термостат для подращивания флоры. Смоченные тампоны или тампоны в транспортной бульонной среде засевают на чашку с сывороточным агаром, лишенным ингибитора, без предварительного подращивания. Посев делают отжатым тампоном, как описано выше. Засеянные чашки помещают в термостат.

При транспортировке материала на короткие расстояния (1-2 часа езды до лаборатории) применение транспортных сред не рекомендуется. При транспортировке в течение 2-4 часов уместно применение тампонов, смоченных питательной средой. При транспортировке в течение 3-х часов и более тампоны перевозят погруженными в транспортную среду.

Полужидкая среда обогащения может использоваться независимо от сроков транспортировки.

2-й день исследования. Просматривают чашки, засеянные накануне, визуально и под лупой-микроскопом МБС, подозрительные колонии отсевают на секторы чашки с сывороточным агаром (не менее 3-5 колоний). Внешний вид колоний менингококков описан выше (п.3). На средах с ингибиторами вырастают только грамотрицательные бактерии, преимущественно представители нейссерий. При отсутствии роста в чашках с антибиотиками проводят повторный просмотр из через 40-48 часов после посева. В эти же сутки делают высев из полужидкой (0,1%) среды обогащения на чашку с сывороточным агаром без ингибитора.

3-й день исследования. Изучают рост чистых культур, отсеянных из отдельных колоний в предыдущий день. Культуры, колонии которых имеют желтый пигмент различной интенсивности, а также характеризующиеся "сухим" ростом, отбрасывают. Следует иметь в виду, что на сывороточном агаре колонии менингококков могут выглядеть желтоватыми из-за оттенка среды. Поэтому для обнаружения пигмента их необходимо просматривать при дневном освещении.

Для дальнейшего исследования на менингококки оставляют только непигментированные культуры, дающие нежный влажный рост. Из них готовят мазки, проводят микроскопию чистой культуры. В первых генерациях для менинигококков # характерны полиморфизм и вариабельность окраски, что не наблюдается у непатогенных нейссерий. После микроскопии дальнейшую идентификацию культур проводят по выше описанным тестам (п.3.1).

Если рост культуры из отсеянных колоний достаточно обильный, то в эти сутки ставят реакцию агглютинации с группоспецифическими сыворотками (п.11).

4-й день исследования. Просматривают посевы, сделанные в предыдущий день. Учитывают результаты роста на бессывороточном желчном агаре (при температуре 37°), сахаролитическую активность, ставят реакцию с водным раствором Люголя на продукцию полисахарида, проводят окончательную серологическую идентификацию менингококков по реакции агглютинации.

В этот же день выдают окончательный положительный или отрицательный ответ. Результаты бактериологического исследования с полужидкой среды соответственно будут получены на сутки позднее.

7. Исследование трупного материала

Патологоанатомическое вскрытие желательно проводить в наиболее ранние сроки после смерти. Для бактериологического исследования направляют кровь, ликвор, кусочки головного мозга (или гной, взятый тампоном с мягкой мозговой оболочки, в случаях менингококкцемии - из печени, селезенки, легкого, надпочечников и т. д.). Кровь берут стерильно из правого сердца, после вскрытия скальпелем, с помощью стерильной пипетки с грушей в количестве 7-10 мл. Из них 2-3 мл засевают в 25 мл 0,1% полужидкого агара, а оставшиеся 5-7 мл используют для других исследований (серологических, в ВИЭФ и т. д.). Для посевов можно использовать также сгустки крови из крупных сосудов.

Ликвор берут стерильной пипеткой из околооболочечного пространства (во время извлечения головного мозга из полости черепа), в стерильную пробирку в количестве 3-5 мл и немедленно высевают на чашки с питательными средами. В количестве 0,1 мл исследуемый материал наносят в центр чашки и распределяют по ее поверхности покачиванием, растирать шпателем не рекомендуется. Бактериологическое исследование ликвора и крови проводят в соответствии с п.п.3.1 и 3.2. Надо иметь в виду, что рост на чашках может быть смешанным из-за попадания непатогенной микрофлоры, поэтому к общепринятому набору питательных сред следует добавить чашку сывороточного агара с антибиотиком (ристомицин, линкомицин) (п.п.10.1, 10.2).

Гной с мозговых оболочек берут стерильным ватным тампоном и засевают газоном или штрихами на чашки с шоколадным сывороточным агаром и в пробирку со средой обогащения, делают 2 мазка на предметных стеклах, один из которых красят метиленовым синим, другой - по Граму.

Для взятия материала из мозга и других органов к месту разреза прикасаются раскаленным шпателем, материал берут из глубины разреза стерильным ватным тампоном. Посев производят обычным способом на те же плотные и жидкие питательные среды. Выросшие культуры дифференцируют в соответствии с п.п.3.1 и 3.4.

Помимо посевов из мозга, целесообразно проводить изучение мазков отпечатков с поверхности мягких мозговых оболочек. После подсушивания и фиксации над пламенем горелки (при длительном хранении - в ацетоне) мазки окрашивают и просматривают.

8. Сохранение и транспортировка выделенных культур

Идентифицированные культуры уничтожают или передают по требованию в сециализированные # НИИ или опорные базы.

N. meningitidis, Str. pneumoniae быстро гибнут во внешней среде. Их можно сохранить в течение 5-6 недель методом посева на столбики из оптимальных для каждого микроорганизма питательных сред: для N. rneningitidis - сывороточный агар, для Str. pneumoniae - кровяной агар. Культуру засевают уколом в столбики и ставят в термостат при температуре 37° С. Через 24 часа при появлении роста культуры по ходу укола и в виде бляшки на поверхности среды в пробирку наливают 1,5-2 мл стерильного вазелинового масла и в таком виде хранят, транспортируют, не допуская охлаждения. Засеянный материал из одной пробирки можно использовать многократно для пересева. Для сохранения культуры пневмококков ее засевают на скошенный кровяной агар, без инкубации при 37°, и держат в течение 4-6 дней при температуре от +4° до +22°. Для получения свежей культуры с поверхности засеянного агара делают соскоб петлей и пересевают на свежую среду такого же состава, ставят в термостат на сутки при температуре 37° С.

Группоспецифическая активность менингококков сохраняется в течение 2-х недель, а пневмококков - 1 недели.

Н. influenzae также быстро гибнет. Жизнеспособность гемофилов можно продлить до 1 месяца, для чего делают обильный посев на скошенный "шоколадный" агар и после суточной инкубации создают полную герметизацию. Такую культуру для пересева используют только однократно. Дегерметизация приводит к гибели субкультуры.

9. Сроки выдачи ответов и их формулировка

9.1. При бактериологическом обследовании ликвора и крови сроки выдачи и формулировка ответов таковы:

на 1-й день на основании прямой бактериоскопии ликвора и толстой капли крови дают предварительный ответ, в зависимости от результата формируется в трех вариантах:

а) при наличии в мазках большого числа морфологически типичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) или прямой бактериоскопии обнаружены грамотрицательные кокки (или грамположительные кокки, или грамотрицательные палочки), сходные по морфологии с менингококками, или пневмококками, или Н. influenzae. Исследование продолжается";

б) при наличии в мазках единичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) или прямой бактериоскопии обнаружены единичные (или парные) клетки кокков (или палочек и т. д.). Исследование продолжается";

в) при отсутствии каких-либо бактериальных клеток пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) или при прямой бактериоскопии бактерий не обнаружено".

На основании реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) ликвора дают ответ, который в зависимости от результата формируют в трех вариантах:

а) при наличии линий преципитации с одной из группоспецифических антименингококковых сывороток пишут: "В спинномозговой жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) выявлен специфический антиген серогруппы А (или другой серогруппы)";

б) при наличии линий преципитации с несколькими группоспецифическими антименингококковыми сыворотками пишут: "В спинномозговой жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) выявлены менингококковые антигены";

в) при отсутствии линий преципитации пишут: "В спинномозговой жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) специфические менингококковые антигены не выявлены".

На 2-й день выдают ответ также предварительного характера, который в зависимости от результатов бактериологического исследования формулируют следующим образом:

а) при росте бактерий, типич