Приложение 3. Выделение вирусов на культурах клеток

Приложение 3
к МУК 4.2.4063-24

Выделение вирусов на культурах клеток

1.1. Для выделения полиовирусов из проб используют перевиваемые линии культур клеток RD и L20B. Использование комбинации этих двух клеточных линий обеспечивает высокую чувствительность и специфичность выявления полиовирусов. Схема выделения вирусов на культурах клеток представлена на рис. 1. Поддержание клеточных культур выполняют в соответствии с руководством по лабораторным исследованиям ⁷¹.

Рис. 1. Схема проведения вирусологического исследования

1.2. RD - клетки рабдомиосаркомы человека чувствительные к полиовирусам, вирусам группы ECHO, некоторым вирусам группы Коксаки А (CVA), за исключением CVA1, CVA19, CVA22, энтеровирусам EV-A71, EV-D68.

------------------------------

⁷¹ ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

------------------------------

Вирусы группы Коксаки В могут проявлять цитопатический эффект (далее - ЦПЭ) на клетках RD.

1.3. L20B - линия мышиных клеток (L-клеток), способная экспрессировать рецептор полиовируса. Клетки L20B избирательно чувствительны к полиовирусам, которые вызывают в них характерный ЦПЭ. Ряд вирусов, не относящихся к энтеровирусам (аденовирусы, реовирусы), могут вызывать ЦПЭ в клетках L20B. Но вызываемый ЦПЭ отличается от ЦПЭ, свойственного полиовирусам.

1.4. Использование культуры клеток НЕр-2 (Cincinnati), чувствительной к полиовирусам и вирусам Коксаки В, является факультативным.

1.5. НЛДП получает культуры клеток по запросу из лабораторий Глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ, РЦ ПОЛИО/ОВП - из НЛДП, учреждения, обеспечивающие деятельность территориальных органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор) - в РЦ ПОЛИО/ОВП, за которым они закреплены.

1.6. После получения клеточного материала РЦ ПОЛИО/ОВП создают банк клеток. Лаборатории учреждений, обеспечивающих деятельность органов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), закрепленные за РЦ ПОЛИО/ОВП, создают банк клеток при наличии возможностей. Запас каждой линии культуры клеток составляет не менее 12 ампул, которые используются по мере необходимости для создания рабочей линии клеток.

1.7. Для сохранения чистоты, аутентичности и стабильности клеточных культур следует заменять рабочую линию после 3-х месяцев или 15 пассажей культивирования в лаборатории.

1.8. Все действия с культурами клеток фиксируют в рабочих записях обозначая тип клеток, номер пассажа, дату получения, дату посева и все смены среды, наименования использованных реактивов, их серии и сроки годности.

1.9. Все работы с неинокулированными культурами клеток проводятся в БМБ 2 класса в отдельном боксированном помещении, расположенном в "заразной зоне" лаборатории.

1.10. Для предотвращения перекрестной контаминации между различными типами клеточных культур не допускается проводить работу с несколькими культурами клеток одновременно.

1.11. Все неинокулированные культуры клеток следует считать потенциально опасными, поэтому после окончания работы все культуральные жидкости и культуры обеззараживают в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ⁷², а также методическими документами ⁷³.

------------------------------

⁷²Глава IV, таблица 7 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.

⁷³МУ-287-113.

------------------------------

1.12. Для контроля чувствительности культур клеток к полиовирусам проводят ежеквартальное титрование референс-штаммов каждого типа на каждой культуре клеток после 8-10 пассажей (приложение 4 к настоящим МУК).

1.12.1. Если титр не отличается от установленного ранее или отличается в пределах 0,5 lg, чувствительность клеток не изменилась.

1.12.2. Превышение ожидаемого значения на 0,5 lg или более может быть связано с погрешностями в приготовлении разведений вируса.

1.12.3. Снижение титра по сравнению с ожидаемым на 0,5 lg или более может указывать на снижение чувствительности клеток. В этом случае выполняют титрование новой порции референс-штамма. Одновременно проверяют возможные изменения в условиях культивирования клеток. Если низкий титр воспроизводится при титровании новой порции, а изменений в условиях культивирования клеток не выявлено, используемые клетки необходимо заменить из клеточного банка лаборатории или получить по запросу в НЛДП или РЦ ПОЛИО/ОВП.

1.13. Инокулирование культур клеток проводят в день обработки пробы или в течение 24 часа после завершения обработки.

1.14. Для исследования одного элюата используют по 1 флакону (50,0 мл, 25 см ² клеточной поверхности в каждом) каждой культуры или по 2 пробирки на один пассаж. Оптимально использовать для заражения одной пробы 5 флаконов с культурой клеток L20B и 1 флакон с культурой клеток RD. Такой подход увеличивает вероятность выделения вирусов.

1.15. Использование микропланшетов для выделения вирусов не допускается.

1.16. После замены ростовой среды на 7,5 мл поддерживающей среды в каждый флакон вносят 0,5 мл обработанной пробы. Все использованные клеточные культуры следует инокулировать одновременно. Оставляют по одному незараженному контрольному флакону каждой культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре плюс 36 °C. Ежедневно, обычно в течение 5-7 дней, проверяют культуры на наличие ЦПЭ. Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в рабочих записях. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями не менее 75 % клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при температуре не выше минус 20 °C для следующего пассажа на той же культуре клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы не объединяют. Для пассажа могут быть использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый "слепой" пассаж в той же культуре клеток. При отсутствии ЦПЭ в течение 5-7 дней культуры отбрасываются как негативные.

1.17. При наличии ЦПЭ в клетках L20B пробу следует считать содержащей полиовирусы. В случае обнаружения признаков ЦПЭ в клетках RD необходимо провести последовательный пассаж в клетках L20B. В случае получения признаков характерного ЦПЭ в клетках L20B считают пробу предположительно содержащей полиовирусы.

1.18. Изоляты, которые проявили ЦПЭ на культуре клеток RD, но без признаков ЦПЭ при пассаже с RD на L20B, следует считать содержащими НПЭВ.

1.19. При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 10 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.

1.20. Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1-2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры замораживают при температуре не выше минус 20 °C, оттаивают и выполняют пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то возвращаются к исходной пробе, разводят ее фосфатно-солевым буфером (далее - ФСБ) 1:10 и повторяют заражение. В случае бактериальной контаминации возвращаются к исходной пробе, обрабатывают ее хлороформом и повторяют процедуры заражения.

1.21. Для предупреждения перекрестной контаминации во время процедур заражения и пассирования не допускается сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры.

1.22. При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Необходимо избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование). Используют посуду с завинчивающимися крышками.

1.23. Применение метода адсорбции исследуемого материала на культуре клеток может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ. При использовании этого метода в результате дополнительных открываний крышек возрастает вероятность перекрестной вирусной или бактериальной контаминации.

1.24. При использовании метода адсорбции из флакона и (или) пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ или культуральной средой, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре плюс 36 °C в течение 1 часа. Таким образом, создаются лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон и (или) пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды.