Приложение 2. Концентрирование проб сточных вод

Приложение 2
к МУК 4.2.4063-24

Концентрирование проб сточных вод

1. Метод двухфазного разделения

1.1. Объем осветленной центрифугированием сточной воды смешивают с выбранными объемами двух полимеров - декстрана и полиэтиленгликоля (далее - ПЭГ). Гомогенную смесь этих ингредиентов, полученную путем энергичного встряхивания, оставляют на ночь при температуре плюс 4 °C в делительной воронке. Это позволяет полимерам разделиться и сформировать в воронке два отчетливых слоя (две фазы). Энтеровирусы накапливаются в меньшем нижнем слое или на границе двух фаз (интерфаза). Нижний слой и интерфазу собирают капельным способом. Осадок, полученный после первоначального центрифугирования, вносят в этот концентрат, взвесь обрабатывают хлороформом и подвергают исследованию. Таким образом проба концентрируется в 50-100 раз.

1.2. Подготовка реактивов (для двух проб по 1,0 л):

- 22 % декстран (по весу) - 40 г декстрана Т40, 142 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при температуре плюс 4 °C.

- 29 % ПЭГ 6000 (по весу) - 363 г ПЭГ 6000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при температуре плюс 4 °C. Раствор можно автоклавировать (15 минут при температуре 45 °C).

150 мл (примерно) 5М NaCl.

1N ⁶⁶ NaOH и 1N HCl для установки pH.

1.3. Концентрирование пробы (0,5 л):

Жидкость пробы центрифугируют в течение 10 минут при 1000 g (если это необходимо, пробу делят на несколько порций), надосадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейера емкостью 1,0 л. Осадок хранят при температуре плюс 4 °C.

Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1):

g = (11,7 x 10 ^-7) x RN ²

(1)

где: g - ускорение свободного падения;

R - радиус в мм ротора центрифуги (от его оси до конца пробирки), мм;

N - скорость, об/мин.

------------------------------

⁶⁶Примечание: N - нормальный.

------------------------------

Доводят pH надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0-7,5). Для этого по каплям вводят 1N раствора NaOH. Измеряют конечный объем надосадочной жидкости.

К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22 % раствора декстрана, 287 мл 29 % раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5 N раствора NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 час при температуре плюс 4 C, используя прибор горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.

Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов так, чтобы не закрыть в них отверстие. Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Приготовленную смесь переливают в воронку и оставляют на ночь при температуре плюс 4 °C.

На следующее утро осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают в стерильную пробирку ее нижний слой и промежуточную фазу (5-10 мл от каждой пробы объемом 0,5 л).

К жидкости, собранной в пробирке добавляют осадок, хлороформ (20 % от объема образовавшейся взвеси), встряхивают в течение 1 минуты. Центрифугируют 20 минут при 1500 g, отбирают водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл, соответственно) ⁶⁷. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1).

Одну часть полученного концентрата (1 мл) хранят при температуре не выше минус 20 °C (или при температуре не выше минус 70 °C, если есть возможность) для повторного исследования при необходимости. Вторую часть концентрата используют для проведения исследований.

2. Метод фильтрации ⁶⁸

2.1. Для фильтрования используют приборы напорного, вакуумного фильтрования.

Для фильтрования всех видов воды с малым количеством взвешенных частиц используют только микропористые мембраны с диаметром пор не более 0,2 мкм для осаждения вирусных частиц.

------------------------------

⁶⁷ Примечание: одну часть полученного концентрата (1 мл) хранят при температуре не выше минус 20 °C (или при температуре не выше минус 70 °C, если есть возможность) для повторного исследования при необходимости. Вторую часть концентрата используют для проведения исследований.

⁶⁸ ВОЗ. Руководство по исследованиям объектов окружающей среды на полиовирусы, 2015 (англ. Guidelines on environmental surveillance for detection of poliovirus, 2015 - polioeradication.org/tools-and-library/policy-reports/gpln-publications (в свободном доступе).

------------------------------

При фильтровании сточной или речной воды для освобождения от большого количества взвешенных частиц, затрудняющих фильтрацию, применяют дисковый предфильтр, который накладывают на селективную мембрану. Элюцию вирусных частиц проводят с селективной мембраны. Если использовался предфильтр, его сбрасывают в дезинфицирующий раствор или автоклавируют.

После окончания фильтрации мембрану разрезают стерильными (фламбированными) ножницами на тонкие полоски, помещают в стерильный флакон (50-100 мл с широким горлышком) и добавляют 10 мл ⁶⁹ элюента. В качестве элюента используют 0,9 % раствор NaCl. Флакон с элюентом с плотно закрытой крышкой тщательно встряхивают в течение 10 минут с помощью шейкера.

Далее смыв с поверхности фильтра переносят в стерильные пробирки:

- для исследования вирусологическим методом 8-9 мл элюата отбирают в стерильную пробирку, добавляют стерильной пипеткой 1 мл хлороформа. Интенсивно встряхивают пробирку в течение 20 минут с помощью шейкера, затем центрифугируют 20 минут при температуре плюс 4 °C при 1500 g ⁷⁰. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1);

- для исследования методом ОТ-ПЦР отбирают 1 мл элюата в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10000 g в течение 10 минут. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1).

------------------------------

⁶⁹Приложение 2 МУ 1.3.2569-09.

⁷⁰Примечание: после центрифугирования надосадочную жидкость отбирают стерильной пипеткой, не захватывая хлороформ. Одну часть полученного концентрата (1 мл) хранят при температуре не выше минус 20 °C (или при температуре не выше минус 70 °C, если есть возможность) для повторного исследования при необходимости. Вторую часть концентрата используют для заражения культур клеток.

------------------------------