Приложение 4. Приготовление и титрирование референс-штаммов полиовирусов (вакцинных штаммов Сэбина)

Приложение 4
к МУК 4.2.4064-24

Приготовление и титрирование референс-штаммов полиовирусов
(вакцинных штаммов Сэбина)

1. Приготовление рабочих запасов референс-штаммов ⁶²

1.1. Готовят флакон площадью 25 см ² с культурой клеток HEp-2 (Cincinnati), сформировавшей сливной здоровый монослой в течение 2-3 дней. Маркируют флакон, указывая вид культуры, дату инокуляции, лабораторный номер референс-штамма.

1.2. Сливают ростовую среду и ополаскивают клеточный слой ФСБ.

1.3. Вносят во флакон 0,2 мл вируссодержащей жидкости из пробирки с прототипным референс-штаммом, полученным в НЛДП. Оставшееся количество прототипного референс-штамма хранят при температуре не выше минус 20 °C.

1.4. Инкубируют культуру при температуре плюс 36 °C в течение 1 часа, периодически осторожно покачивая флакон для лучшей адсорбции вируса.

1.5. Добавляют поддерживающую среду (около 10 мл), содержащую 5 % сыворотки плодов коровы. Флакон помещают в термостат при температуре плюс 36 °C.

1.6. Культуру просматривают ежедневно. После распространения ЦПЭ на 75-100 % клеточного монослоя, флакон трижды замораживают и оттаивают для разрушения клеток.

1.7. Содержимое флакона переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют при 1500 g 20 минут. Перерасчет ускорения свободного падения (g) в число об/мин проводят по формуле (1). Надосадочную жидкость по 0,5 мл переносят в пробирки, предназначенные для хранения референс-штамма, с этикетками, на которых указывают тип клеток, вирусный штамм, дата приготовления. Приготовленные лабораторные референс-штаммы хранят при температуре не выше минус 20 °C.

1.8. Определяют титр референс-штамма (см. п.п. 2.1-2.7).

1.9. Данные запасы вируса могут быть использованы для приготовления нужных объемов для проведения исследований, для проведения процедуры контроля чувствительности клеточных культур. Вирус на культуре HEp-2 пассируют не более 3-х раз.

------------------------------

⁶² ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

------------------------------

2. Определение титра референс-штаммов ⁶³

2.1. Готовят разведение 10 ^-1 исследуемого вируса: 0,1 мл вируса вносят в пробирку, содержащую 0,9 мл среды.

2.2. Готовят ряд последовательных разведений от 10 ^-2 до 10 ^-8. В маркированные соответствующим образом пробирки разливают по 9,0 мл среды, в первую вносят 1,0 мл разведения 10 ^-1 исследуемого вируса. Новой пипеткой перемешивают содержимое пробирки, переносят 1,0 мл в следующую, меняют пипетку, вновь перемешивают и переносят 1,0 мл, и т.д.

2.3. Переносят по 100 мкл разведения вируса из пробирок в лунки рядов А-Н колонок 1-10 панели для микротитрования (рис. 2а). Для получения статистически достоверных результатов определения титра референс-штамма используют разведения 10 ^-5 - 10 ^-8, каждое разведение вносят в 20 лунок.

2.4. Вносят по 100 мкл поддерживающей среды в лунки колонок A11-Н рядов 11-12 для контроля клеток.

2.5. Готовят суспензию клеток в концентрации 1-2 х 105 клеток / 1,0 мл, вносят по 100 мкл во все лунки панели. Заклеивают панель пленкой и помещают в термостат при температуре плюс 36 °C.

2.6. Ежедневно микроскопируют панель, наблюдая за появлением ЦПЭ, окончательно учитывают результаты на 5-7 день. Тест считают действительным при образовании в лунках контроля сплошного монослоя нормальных клеток.

2.7. Расчет титра вируса проводят по формуле Кербера (2):

log ТЦД ₅₀= L - d (S - 0,5)

(2)

где: L = log наименьшего разведения сыворотки в опыте;

d = разница между lg последовательных разведений;

S = сумма пропорций тест-объектов (лунок с культурой клеток), давших положительный результат (ЦПЭ) в каждом разведении.

В примере на рис. 2б титр вируса равен 10 ^6,6 ТЦД ₅₀/0,1 мл, рассчитан по формуле (3):

log ТЦД ₅₀ = -5 - 1 (2,1 - 0,5) = -6,6

(3)

------------------------------

⁶³ ВОЗ. Руководство по лабораторным исследованиям на полиовирусы, 2004.

------------------------------

Рис. 2. Определение титра референс-штамма