Приложение 5. Проведение реакции нейтрализации для выявления антител к полиовирусу

Приложение 5
к МУК 4.2.4064-24

Проведение реакции нейтрализации для выявления антител к полиовирусу

1.1. Готовят панели для микротитрования из расчета одна панель на каждый тип вируса, маркируют их, обозначая номер исследуемой сыворотки, тип вируса, дату постановки опыта.

1.2. Вносят 50 мкл питательной среды во все лунки панели, кроме лунок, предназначенных для контроля культуры клеток (ряды А-Н, колонки 11-12). В эти лунки вносят 100 мкл среды (рис. За).

1.3. Необходимый объем сыворотки, приготовленной для исследования, инактивируют в течение 30 минут при температуре плюс 56 °C.

1.4. Готовят разведение 1:4 каждой исследуемой сыворотки, а также референс-сыворотки в поддерживающей среде с добавлением 2 % сыворотки плодов коровы. Необходимо иметь как минимум 600 мкл разведения 1:4 каждой сыворотки.

1.5. Вносят 50 мкл разведения 1:4 каждой сыворотки в соответствующие лунки колонок 1 и 2 в каждую из трех панелей (рис. За).

1.6. Используя микропипетку с одноразовым наконечником, аккуратно перемешивают содержимое лунки 2 ряда А, отбирают 50 мкл, переносят в лунку 3, вновь перемешивают, отбирают 50 мкл, переносят в лунку 4 и т.д., включая лунку 10. Из лунки 10, соответствующей разведению 1:2048 после перемешивания 50 мкл содержимого отбрасывают (рис. 3б).

1.7. Повторяют вышеописанные процедуры для ряда В. Таким образом получены двукратные разведения от 1:8 до 1:1024 сыворотки 1. Лунки колонки 1 рядов А и В служат для контроля токсичности сыворотки, в них не добавляют вирус.

1.8. Аналогично вышеописанному готовят последовательные разведения второй исследуемой сыворотки и референс-сыворотки. Таким образом, лунки рядов А-F колонок 1-10 предназначены для исследования сывороток.

1.9. При титровании сывороток допускается использование многоканальных микропипеток, которые должны быть регулярно проверены, наконечники - соответствовать типу пипетки, для недопущения ошибок опыта.

1.10. Готовят суспензию нейтрализуемого полиовируса каждого типа с известным заранее титром в поддерживающей среде в количестве, достаточном для исследования намеченного числа сывороток. Разводят каждый вирус так, чтобы в 50 мкл вируссодержащей жидкости содержалось 100 ТЦД ₅₀. Для одной панели необходимо примерно 4,0 мл вируса.

1.11. Пример определения рабочего титра вируса.

При предварительном титровании референс-штаммов на культуре клеток Hep-2 был установлен их титр (конечная точка титрования):

- полиовирус типа 1 - 9,02 lg/мл;

- полиовирус типа 2 - 8,44 lg/мл;

- полиовирус типа 3 - 8,66 lg/мл.

Разведение, которое дает концентрацию 100 ТЦД ₅₀/мл - в 100 раз меньшее разведение, чем конечная точка титрования. Так как в лунку вносят 50 мкл разведения вируса, то его рабочее разведение должно быть в 20 раз меньше (или на 1,3 lg). Рабочее разведение референс-штаммов будет следующим:

- полиовирус типа 1 - 5,72 lg/мл (можно использовать разведение - 6);

- полиовирус типа 2 - 5,14 lg/мл (можно использовать разведение - 5);

- полиовирус типа 3 - 5,36 lg/мл (можно использовать разведение - 5).

1.12. Пример приготовления ряда последовательных разведений референс-штаммов (табл. 1).

Таблица 1

Пример приготовления ряда последовательных разведений референс-штаммов

Разведения	Объем среды для разведения	Объем вирусной суспензии
10 -1	0,9 мл	0,1 мл
10 -2	0,9 мл	0,1 мл
10 -3	0,9 мл	0,1 мл
10 -4	0,9 мл	0,1 мл
10 -5 - рабочее разведение для полиовирусов типов 2 и 3	3,6 мл	0,4 мл
10 -6 - рабочее разведение для полиовируса типа 1	3,6 мл	0,4 мл
10 -7	0,9 мл	0,1 мл
10 -8	0,9 мл	0,1 мл

1.13. Вносят 50 мкл рабочего разведения вируса определенного типа в лунки рядов А2-А10 - F2-F10 соответствующей типу вируса панели. В лунки колонок 1, 11, 12, а также рядов G и Н вирус не добавляют (рис. 3в). Ряды G и Н предназначены для титрования референс-вируса для контроля рабочей дозы. Вносят 50 мкл последовательных разведений вируса, начиная с наибольшего (от - 9 до - 5).

1.14. Панели заклеивают специальной пластиковой пленкой, закрывают крышкой, осторожно постукивают по краю панели для лучшего смешивания ингредиентов в лунках и помещают на 3 часа в термостат при температуре плюс 36 °C.

1.15. Готовят суспензию клеток HEp-2 в ростовой среде в концентрации 1-2 х 105 клеток в 1,0 мл.

1.16. Добавляют по 100 мкл клеточной суспензии во все лунки всех панелей. Заклеивают панели, помещают в термостат при температуре плюс 36 °C на 5 дней. Учет результатов начинают на 3 день, окончательный учет - на 5 день.

1.17. При учете результатов обращают внимание на состояние контролей культуры, токсичность сыворотки, результаты контрольного титрования рабочих разведений референс-вирусов. Для контроля рабочей дозы каждого из использованных в опыте вирусов по формуле Кербера рассчитывают титр вируса (пункт 2.7 приложения 4 к настоящим МУК). Если рабочая доза выходит за пределы 50-200 ТЦД ₅₀, результаты опыта считают недостоверными.

1.18. При учете результатов обращают внимание на воспроизводимость уже известных титров референс-сыворотки. Если в опыте значения титров резко отличаются от ожидаемых, результаты опыта считают недействительными.

1.19. Рассчитывают конечную точку нейтрализации по формуле Кербера (пункт 2.7 приложения 4 к настоящим МУК).

Переводят разведения сыворотки в логарифмические значения (разведение 1:4 = 2, 1:8 = 3, 1:16 = 4 и т.д.). Титром антител в сыворотке считается ее наибольшее разведение, защищающее 50 % тест-культур от действия 100 ТЦД ₅₀ вируса. Титр вируса часто выражают величиной, обратной разведению (например, при разведении 1:256 титр антител выражается как 256).

1.19.1. Пример расчета титра сыворотки (табл. 2, рис. 3г - сыворотка 1), формула (4):

lg ТЦД ₅₀ = L - d (S - 0,5) = 11 - 1 (5,5 - 0,5) = 6 (1 : 64)

(4)

Таблица 2

Пример расчета титра сыворотки

разведение сыворотки (lg)		пропорции тест-объектов
1:8	3	0/2 = 0
1:16	4	0/2 = 0
1:32	5	0/2 = 0
1:64	6	1/2 = 0,5
1:128	7	2/2 = 1
1:256	8	2/2 = 1
1:512	9	2/2 = 1
1:1024	10	2/2 = 1
1:2048	11	2/2 = 1
S = 5,5

Рис. 3. Ход выполнения реакции нейтрализации для определения титра нейтрализующих антител к полиовирусу