Приложение 1. Питательные среды, применяемые для выделения и идентификации менингококка, пневмококка, гемофильной палочки

Приложение 1
к МУК 4.2.4067-24

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МЕНИНГОКОККА, ПНЕВМОКОККА, ГЕМОФИЛЬНОЙ ПАЛОЧКИ

1. Все питательные среды, используемые для культивирования, транспортирования, выделения, идентификации и определения чувствительности возбудителей к АМП при лабораторной диагностике МИ и ГБМ готовятся в соответствии с документами по стандартизации ⁴⁸, которые распространяются как на коммерческие питательные среды, так и среды, приготовленные в лаборатории.

------------------------------

⁴⁸ГОСТ Р 70393-2022.

------------------------------

1.1 КК питательных сред. Каждая партия питательной среды, приготовленная в лаборатории или полученная от производителя, должна быть протестирована с использованием надлежащих стандартных штаммов на предмет стерильности, способности поддерживать рост целевого(-ых) микроорганизма(-ов) и(или) способности обеспечивать нужные биохимические реакции. Должен вестись журнал КК для всех питательных сред, приготовленных в лаборатории или полученных из коммерческих источников, с фиксацией, в том числе дат приготовления или приобретения и результатов КК. Регистрации подлежат любые необычные характеристики среды, такие как цвет или структура, или медленный рост стандартных штаммов.

1.2 . Все плотные среды должны готовиться с соблюдением стерильности и разливаться в чашки Петри. После разлива чашки следует подержать при комнатной температуре (плюс 25 °C) несколько часов для предотвращения избыточной конденсации пара на крышках. Для оптимального роста чашки должны быть помещены в стерильный пластиковый пакет и до использования храниться в перевернутом состоянии при (плюс 5 3) °C. Все жидкие питательные среды до использования следует хранить в надлежащих емкостях при температуре плюс (5 3) °C.

1.3 ТСА.

ТСА - питательная среда общего предназначения, используемая с добавлением крови или без таковой для выделения и культивирования ряда микроорганизмов. Данная питательная среда должна иметь палевый цвет (от желтоватого до золотистого). ТСА также используется для определения потребности Н. influenzae в гемине (фактор X) и НАД (фактор V).

Приготовление питательной среды:

1) приготовьте необходимый объем ТСА в колбе, следуя инструкциям производителя;

2) автоклавируйте при температуре плюс 121 °C в течение 20 минут;

3) охладите до температуры плюс 50 °C на водяной бане и разлейте в чашки Петри. Дайте питательной среде затвердеть, а конденсату подсохнуть;

4) поместите чашки в пластиковые пакеты и храните до использования при температуре плюс (5 3) °C.

КК среды:

1) вырастите штамм Н. influenzae, используемый для КК, в течение 18 - 24 ч на ША при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа;

2) приготовьте умеренно густую клеточную суспензию (сопоставимую со стандартом мутности 1 по шкале МакФарланда) из культуры, выращенной на ША, в подходящем бульоне (триптиказо-соевый, с сердечной вытяжкой или пептонный), и хорошо перемешайте ее на лабораторном вихревом смесителе (вортексе);

3) инокулируйте половину чашки с ТСА 10 мкл клеточной суспензии, используя стерильную бактериологическую петлю или тампон и дайте суспензии подсохнуть;

4) поместите бумажные диски или полоски, пропитанные гемином, НАД и гемином/НАД, на инокулированную чашку после подсыхания суспензии микроорганизмов;

5) осторожно переверните чашки и инкубируйте в течение 18 - 24 часов при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа;

6) наблюдайте за ростом бактерий на чашке с ТСА вокруг дисков/полосок фильтровальной бумаги;

7) в качестве теста на стерильность инкубируйте неинокулированную чашку в течение 48 часов при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа.

Критерии прохождения КК:

- рост Н. influenzae должен наблюдаться только вокруг дисков с гемином/НАД;

- после 48 часов инкубирования чашка, использовавшаяся в тесте на стерильность, должна оставаться чистой.

1.4. Полужидкий 0,1 % СА. В качестве основы используют мясопептонный бульон, перевар Хотгингера, рыбный гидролизат, Мартеновский бульон. К 4,0 мл 0,1 % полужидкого питательного агара, pH 7,4, добавляют 1,0 мл предварительно инактивированной сыворотки. Пробирки ставят на сутки в термостат для контроля.

1.5. СА. Основой служит 1,2 - 1,5 % агар (pH 7,4), приготовленный на бульоне из рыбного гидролизата, из бульона на переваре Хотгингера (аминный азот 150 - 180 мг/мл) или на сухом питательном агаре специального назначения (АВС, ТСА); менингоагар (только для выделения). К 80,0 мл расплавленного и остуженного до 50 °C агара добавляют 20,0 мл инактивированной при температуре плюс 56 °C в течение 30 минут лошадиной или бычьей сыворотки, консервированной хлороформом или без консерванта. После перемешивания среду разливают в чашки.

1.6. Сывороточная среда с линкомицином. К 80,0 мл расплавленного и остуженного агара добавляют 20,0 мл сыворотки и 0,5 мл раствора линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл. Конечная концентрация АМП в среде - 5 мкг/мл.

1.7. КА. Основой агара служит, например, колумбийский агар, ТСА, АМХ, агар для бруцелл, эритрит-агар, агар Гивенталя-Ведьминой, pH 7,2 - 7,4. КА используется в качестве универсальной кровяной агаризированной питательной среды. Она используется для выращивания и тестирования N. meningitidis и S. pneumoniae. Среда должна иметь ярко красный цвет. Если среда имеет темно-красный цвет, то она либо старая, либо кровь была добавлена к слишком горячему агару. Чашки с подобной средой следует утилизировать надлежащим образом и приготовить новую партию.

Приготовление питательной среды:

1) приготовьте необходимый объем основы КА в колбе по инструкциям, изложенным на этикетке упаковки коммерческой питательной среды. Питательная среда должна быть нагрета до полного растворения порошка. Перед началом автоклавирования остатки порошка на стенках сосуда должны отсутствовать;

2) автоклавируйте при температуре 121 °C в течение 20 минут;

3) охладите до температуры плюс 60 °C;

4) добавьте 5 % стерильной дефибринированной крови барана, лошади, крупного рогатого скота (к 100 мл агара может быть добавлено 5 мл крови). Если готовится другой объем основной питательной среды, количество крови должно быть надлежащим образом скорректировано до 5 % (например, 50 мл крови в расчете на 1 литр среды). Кровь человека не используется;

5) разлейте полученную среду по 20 мл в чашки Петри 15 x 100 мм. Дайте питательной среде затвердеть, и подсохнуть конденсату;

6) поместите чашки в стерильные пластиковые пакеты и храните при температуре плюс (5 3) °C до использования.

КК среды:

1) вырастите тест-штаммы S. pneumoniae или N. meningitidis, рекомендованные нормативными документами или инструкциями по применению производителей питательных сред для КК, в течение 18 - 24 часов на КА при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа;

2) рассмотрите чашки КА для выявления колоний со специфической морфологией и признаков гемолиза;

3) в качестве теста на стерильность инкубируйте неинокулированную чашку в течение 48 часов при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа.

Критерии прохождения КК:

- колонии тест-штаммов S. pneumoniae должны быть мелкими серыми/серо-зелеными, окруженными отчетливым зеленым ореолом (альфа-гемолиз);

- колонии тест-штаммов N. meningitidis должны быть крупными, округлыми, гладкими, влажными, блестящими и выпуклыми, серого цвета с четко различимым краем;

- после 48 часов инкубирования чашка, использовавшаяся в тесте на стерильность, должна оставаться чистой.

1.8. ША. Основой агара служит колумбийский агар, ТСА, агар Мюллера-Хинтон, агар для бруцелл, эритрит-агар, агар Гивенталя-Ведьминой. ША - это питательная среда, которая содержит особые факторы роста (гемин и НАД), необходимые для выделения прихотливых микроорганизмов, таких как Н. influenzae, при инкубировании в среде с 5 - 10 % углекислого газа при температуре плюс 35 - 37 °C.

Приготовление питательной среды:

1) к 100 мл растопленной стерильной основе (pH 7,4) небольшими порциями прибавьте 5 - 10 мл дефибринированной крови барана, лошади, крупного рогатого скота, тщательно перемешивают и подогревают на водяной бане при температуре плюс 70 - 80 °C, постоянно встряхивая, пока цвет агара не станет шоколадным;

2) разлейте примерно по 20 мл в чашки Петри и(или) по 4 - 5 мл в пробирки в зависимости от размера. Дайте питательной среде затвердеть, и подсохнуть конденсату. Пробирки перед затвердением питательной среды разместите под углом для получения скошенного агара;

3) поместите чашки и пробирки с ША в стерильные пластиковые пакеты и храните до использования при температуре плюс (5 3) °C;

4) в качестве теста на стерильность инкубируйте неинокулированную чашку в течение 48 часов при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа.

КК среды:

1) вырастите тест-штаммы N. meningitidis, S. pneumoniae и Н. influenzae, рекомендованные нормативными документами или инструкциями по применению производителей питательных сред в течение 18 - 24 часов на ША при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа.

2) рассмотрите чашки с ША для выявления колоний со специфической морфологией и гемолиза.

Критерии прохождения КК:

- колонии тест-штаммов N. meningitidis и Н. influenzae на ША должны быть крупными, округлыми, гладкими, выпуклыми, бесцветными/серыми, непрозрачными, не изменяющими цвет питательной среды;

- колонии тест-штаммов S. pneumoniae на ША должны быть мелкими, серыми/зелеными, с зеленоватой зоной вокруг колоний;

- после 48 часов инкубирования чашка, использовавшаяся в тесте на стерильность, должна оставаться чистой.

1.9. Модифицированный агар Тайера-Мартина (англ. Modified Thayer-Martin [agar], далее - МТМ).

МТМ - селективная питательная среда, которая используется для улучшения первичного выделения N. meningitidis из образцов, содержащих смешанную бактериальную и(или) грибковую флору. МТМ - это ША, содержащий ванкомицин, колистин, нистатин и триметоприма лактат.

Приготовление питательной среды:

1) растворите в колбе 7,2 г основы питательной среды для выделения гонококка (GC агар) в 100 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешайте, нагрейте с частым размешиванием и доведите до кипения на 1 мин для полного растворения порошка;

2) автоклавируйте колбу при температуре плюс 121 °C в течение 15 минут;

3) охладите до температуры плюс 50 °C.

4) добавьте 100 мл теплой дистиллированной воды к 2 г растворимого порошка гемоглобина. Смешайте порошок с 5 - 10 мл дистиллированной воды до образования однородной пасты. Постепенно добавляйте остатки воды до получения гомогенного раствора. Непрерывно перемешивайте раствор по мере добавления воды. В качестве альтернативы, возможно использование 100 мл готового 2 % стерильного раствора гемоглобина, подогретого до 50 °C;

5) автоклавируйте раствор при температуре плюс 121 °C в течение 15 минут;

6) охладите до температуры плюс 50 °C;

7) растворите лиофилизированную ростовую добавку, содержащую НАД и гемин, добавив к ней, соблюдая стерильность, 10 мл прилагающегося разбавителя с помощью стерильного шприца с иглой. Встряхните раствор, чтобы гарантировать полное растворение порошка. Приготовленный раствор следует использовать немедленно или можно хранить до 2 недель при температуре плюс (5 3) °C;

8) соблюдая стерильность, добавьте 100 мл стерильного раствора гемоглобина и ростовой добавки к 100 мл основы GC агара, приготовленной по п. 1. Тщательно, но осторожно перемешайте, чтобы не допустить образования в агаре пузырьков;

9) затем добавьте следующие ингредиенты: 3,0 мкг/мл ванкомицина, 7,5 мкг/мл колистина, 12,5 ед/мл нистатина, 5,0 мкг/мл триметоприма лактата;

10) разлейте в чашки Петри. Дайте питательной среде затвердеть, а конденсату подсохнуть;

11) поместите чашки в стерильные пластиковые пакеты и храните до использования при температуре плюс (5 3) °C.

КК среды:

1) вырастите тест-штамм N. meningitidis, рекомендованные нормативными документами или инструкциями по применению производителей питательных сред, в течение 18 - 24 часов на чашке с МТМ при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа;

2) рассмотрите чашку с МТМ для выявления колоний со специфической морфологией;

3) в качестве теста на стерильность инкубируйте неинокулированную чашку в течение 48 часов при температуре плюс 35 - 37 °C в атмосфере 5 - 10 % углекислого газа.

Критерии прохождения КК:

- колонии N. meningitidis на чашке с МТМ должны быть крупными, округлыми, гладкими, выпуклыми, бесцветными/серыми, непрозрачными, не изменяющими цвет питательной среды.

- после 48 часов инкубирования чашка, использовавшаяся в тесте на стерильность, должна оставаться чистой.

1.10. Двухфазная питательная среда. Плотная фаза (ША) - приготовьте простой питательный агар (на основе триптического перевара Хотгингера, ТСА, колумбийского агара), разлейте во флаконы по 50 мл, автоклавированные при температуре плюс 121 °C в течение 20 минут. В горячий флакон с агаром добавьте по 3,0 - 5,0 мл крови, перемешайте и прогрейте при температуре плюс 65 - 80 °C в течение 10 минут двукратно. Среду скосите. Жидкую фазу приготовьте из сахарного бульона на переваре Хотгингера, добавив в объеме 50 мл в каждый флакон. Для приготовления сахарного бульона требуются 200 г перевара Хотгингера, 800 мл воды, 10 г глюкозы и 5 г хлорида натрия (NaCl). Далее стерилизуйте при 0,5 атм в течение 30 минут, pH 7,3 - 7,4. Готовую двухфазную среду хранят при температуре плюс (5 3) °C в холодильнике, перед посевом патологического материала согревают в термостате.

1.11. Плотные среды с углеводами. Готовят на той же питательной основе, что и сывороточные среды. К 75 мл агаровой основы добавьте 0,9 г одного из углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, фруктоза) и 3,9 мл раствора индикатора фенолового красного. Стерилизуйте текучим паром 3 дня по 30 минут или при 0,5 атм в течение 30 минут. Индикатор феноловый красный получают, смешивая 0,4 г порошка фенолового красного рот с 16,0 мл 0,1 N раствора гидроксида натрия (NaOH). Затем раствор доведите до объема 200 мл дистиллированной водой, разлейте во флаконы и стерилизуйте при 1 атм в течение 20 минут.

1.12. ЦТА с 1 % углеводов (полужидкая питательная среда).

Приготовление питательной среды:

1) Следуя инструкциям производителя, определите количество ЦТА, которое должно быть растворено в 900 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешайте, нагрейте с частым размешиванием и доведите до кипения на 1 минуту для полного растворения порошка.

2) Автоклавируйте колбу при температуре плюс 121 °C в течение 15 минут.

3) Охладите до температуры плюс 50 °C.

4) Приготовьте 10 % раствор глюкозы, добавив 10 г глюкозы к 100 мл дистиллированной воды. Простерилизуйте через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм.

5) Соблюдая стерильность, добавьте 100 мл 10 % раствора глюкозы, приготовленного на шаге 4, к 900 мл питательной среды ЦТА, чтобы получить раствор с конечной концентрацией глюкозы 1 %.

6) Соблюдая стерильность, разлейте по 7 мл питательной среды в стеклянные пробирки.

7) Повторите данную процедуру с 3 другими углеводами (мальтоза, лактоза и сахароза).

8) Храните при температуре плюс (5 3) °C, нагревая перед использованием до комнатной температуры (плюс 20 - 25 °C).

КК среды:

1) вырастите штаммы N. meningitidis, N. lactamica и N. sicca, рекомендованные нормативными документами или инструкциями по применению производителей питательных сред для контроля качества, в течение 18 - 24 часов на КА при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа.

2) дайте пробиркам с ЦТА и углеводами (глюкозой, мальтозой, лактозой или сахарозой) нагреться до комнатной температуры (плюс 20 - 25 °C), и промаркируйте пробирки, указав на них название штамма для КК.

3) возьмите 3 - 5 колоний с выросшей культурой на КА с помощью 1 мкл одноразовой бактериологической петли.

4) произведите посев уколом, вводя петлю в верхние 10 мм питательной ЦТА с разными углеводами. Используйте отдельные одноразовые иглы для инокуляции каждого тестируемого углевода.

5) неплотно закройте крышки пробирок и поместите пробирки в термостат при температуре плюс 35 - 37 °C без углекислого газа. Инкубируйте пробирки с ЦТА и сахарами на протяжении, по меньшей мере, 72 часов (и до 5 дней) перед тем, как отбросить их, констатировав отрицательный результат.

6) наблюдайте за ЦТА с сахарами на предмет помутнения и окрашивания в желтый цвет.

Критерии прохождения КК:

- заметное помутнение и пожелтение верхней части питательной среды указывает на рост бактерий и выработку кислоты, и классифицируется как положительный результат теста;

- N. meningitidis должны утилизировать глюкозу и мальтозу, но не лактозу или сахарозу;

- N. lactamica должны утилизировать глюкозу, мальтозу и лактозу, но не сахарозу;

- N. sicca должны утилизировать глюкозу, мальтозу и сахарозу, но не лактозу;

ГАРАНТ:

Нумерация подпунктов приводится в соответствии с источником

1.12. АМХ.

Питательная среда должна соответствовать документам по стандартизации ⁴⁹ по содержанию ионов двухвалентных металлов (кальция, магния, марганца и цинка) и тимидина.

------------------------------

⁴⁹ГОСТ Р 59786-2021.

------------------------------

Приготовление питательной среды:

1) приготовьте АМХ из коммерческой сухой среды, следуя инструкциям производителя.

2) после автоклавирования охладите среду до температуры плюс 45 - 50 °C на водяной бане или на воздухе.

3) разлейте среду в стерильные стеклянные или пластиковые чашки Петри, находящиеся на ровной горизонтальной поверхности, таким образом, чтобы толщина слоя агара составляла 4,0 0,5 мм (приблизительно 25 мл в круглую чашку диаметром 90 мм, 31 мл - в круглую чашку диаметром 100 мм, 71 мл - в круглую чашку диаметром 150 мм, 40 мл - в квадратную чашку размером 100 x 100 мм). Использование большего или меньшего количества агара повлияет на результаты оценки чувствительности.

4) дайте питательной среде затвердеть, а конденсату подсохнуть.

5) pH должен составлять 7,2 - 7,4.

6) поместите чашки в пластиковые пакеты и храните до использования при температуре (5 3) °C. Перед использованием необходимо убедиться, что поверхность агара сухая. На поверхности агара или на внутренней стороне крышки не должно быть видимых капель влаги. При необходимости чашки следует подсушить при температуре плюс 20 - 25 °C в течение 16 - 20 часов или при температуре плюс 35 °C с открытыми крышками в течение 15 минут. Чашки нельзя пересушивать.

КК среды:

1) вырастите тест-штаммы Е. coli, S. aureus, Р. aeruginosa, Е. faecalis, рекомендованные нормативными документами или инструкциями по применению производителей питательных сред для контроля качества, в течение 18 - 20 часов на чашке со средой N 1 ГРМ или ГРМ-агаром с АМХ при температуре плюс 35 - 37 °C в присутствии 5 - 10 % углекислого газа (в эксикаторе, газогенерирующем пакете или в сосуде со свечой).

2) посейте штрихом на АМХ в трех направлениях каждый тест-штамм для определения ростовых свойств среды.

3) для контроля показателя чувствительности тест-шт