Приложение 17. Контроль качества питательных сред для выделения, культивирования и идентификации возбудителя чумы

Приложение 17
к МУ 3.1/4.2.4065-24

Контроль качества питательных сред для выделения, культивирования и идентификации возбудителя чумы

1. Исследования по контролю качества питательных сред организуются и проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями ¹⁴⁰.

------------------------------

¹⁴⁰Глава IV СанПиН 3.3686-21.

------------------------------

Биологические показатели, применяемые для оценки питательных сред

1.1. Чувствительность среды - максимальное разведение культуры, обеспечивающее визуально обнаруживаемый рост колоний искомого штамма в течение определенного времени и температуры на всех засеянных чашках (пробирках) с питательной средой. По этому показателю оцениваются диагностические среды для выделения и дифференциальные.

1.2. Показатель прорастания - процент выросших колоний микроорганизмов от числа засеянных клеток. По этому показателю оцениваются питательные среды для культивирования.

1.3. Эффективность - выход микробных клеток с 1 мл питательной среды. По этому показателю контролируются питательные среды для культивирования и среды, используемые в производстве иммунобиологических лекарственных препаратов и диагностических препаратов.

1.4. Показатель стабильности основных свойств микроорганизмов при выращивании на испытуемой среде - отношение числа атипичных по морфологии, биохимическим, серологическим, фаголизабельным и другим свойствам колоний к числу выросших на агаровых пластинках колоний тест-штаммов. Определяются для всех сред.

1.5. Дифференцирующие свойства - выраженность отличительных видовых и других признаков патогенных микроорганизмов от непатогенных видов и естественных ассоциантов. Определяются для дифференциальных сред и сред для идентификации.

1.6. Показатель ингибиции - степень подавляющего воздействия на рост и (или) проявление типичных свойств сопутствующей микрофлоры; выражается количеством микробов-ассоциантов, которое не растет на среде или числом сформировавшихся колоний микробов-ассоциантов, не препятствующих выделению возбудителя. Контролируются среды для выделения, дифференциальные и для накопления.

1.7. Показатель скорости роста - минимальное время инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечивается отчетливый видимый невооруженным глазом рост культуры (помутнение, наличие пленки, осадка, роста по уклону и др.) во всех засеянных пробирках с жидкими (полужидкими) питательными средами или формирование типичных, легко дифференцируемых колоний на чашках (пробирках) с плотной средой. Определяются для диагностических сред.

Организация проведения контроля

ГАРАНТ:

Нумерация пунктов приводится в соответствии с источником

1.9. Для лабораторной диагностики возбудителей особо опасных инфекций используются коммерческие питательные среды или среды лабораторного приготовления. В качестве препаратов сравнения (контроль) используются ранее проверенные питательные среды (аналоги по назначению), соответствующие требованиям настоящих МУ.

Для коммерческих питательных сред бактериологическому контролю подлежит первая варка от каждой серии, а также все варки серии при изменении условий ее хранения или приготовления.

Для питательных сред лабораторного приготовления контролируется каждая варка.

Срок годности готовых коммерческих питательных сред определен инструкцией по применению каждой конкретной среды. Срок хранения агара лабораторного приготовления не более 2 месяцев, после чего проводится переконтроль среды для продления срока годности еще на 1 месяц.

Питательные среды хранятся в темном месте при постоянной температуре плюс 4 - 20 °C (перепады температуры снижают качество питательных сред).

Тест-штаммы ¹⁴¹

------------------------------

¹⁴¹ Примечание: тест-штаммы получаются из Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" ФКУН Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора или исследовательской коллекции ФКУЗ "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора.

------------------------------

1.10. Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для культивирования и выделения возбудителя чумы, используются тест-штаммы: Y. pestis EV линии НИИЭГ; Y. pestis Р-1680 - для Закавказского горного очага и Y. pestis И-2377 - для Горно-Алтайского очага.

В качестве тест-штамма при контроле ингибиторов посторонней микрофлоры используется Proteus vulgaris 19.

При бактериологическом контроле ЦДС используются тест-штаммы: Y. pestis EV линии НИИЭГ и Yersinia pseudotuberculosis И-199.

Хранение тест-штаммов

1.11. Тест-штаммы Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377, Р. vulgaris 19 и Y. pseudotuberculosis И-199 хранятся в лиофилизированном состоянии при температуре плюс (5 1) °C. Рабочие субкультуры хранятся в 0,4 % агаре Хоттингера pH (7,2 0,1) под слоем стерильного вазелинового масла или на скошенном агаре Хоттингера pH (7,2 0,1) в запаянных пробирках при температуре плюс (5 1) °C. Пересевы культур проводятся не менее 1 раза в 3 мес, но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывается новая ампула с культурой.

Характеристика тест-штаммов

1.12. Используются штаммы Y. pestis EV линии НИИЭГ, Р-1680 и И-2377 обладающие типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами, способные лизироваться чумным бактериофагом Л-413С. По морфологии - грамотрицательные палочки, на агаре образовывают колонии R-формы, в бульоне - рыхлый осадок с прозрачной надосадочной жидкостью. По биохимическим свойствам - ферментирующие глюкозу, маннит и мальтозу, штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ - не разлагающий глицерин и рамнозу; штаммы Р-1680 и И-2377 - ферментирующие рамнозу и глицерин. Штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ при температуре выращивания плюс (28 1) °С нуждается в аминокислотах - фенилаланине, метионине, треонине и цистеине; Y. pestis И-2377 - в фенилаланине, цистеине, аргинине и лейцине; Y. pestis Р-1680 - в фенилаланине, метионине и тиамине (витамин В1). При работе с тиамин-зависимыми штаммами Р-1680 Закавказского горного очага в питательные среды добавляется витамин В1 (0,0001 мг на 100 мл среды) или среду 199 (3 мл на 100 мл среды).

Используется штамм Y. pseudotuberculosis И-199 обладающий типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами, способный лизироваться псевдотуберкулезным бактериофагом, ферментирующий глюкозу, арабинозу, маннит, рамнозу, мочевину; не расщепляющий лактозу, сахарозу; обладающий подвижностью. На агаровых средах при температуре плюс (28 1) °С тест-штамм псевдотуберкулезного микроба растет в виде бугристых хромогенных колоний, в бульоне - равномерное помутнение; в мазках - грамотрицательные палочки.

Используется штамм Р. vulgaris 19 обладающий типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствам, ферментирующий с образованием кислоты и газа глюкозу, маннозу, сахарозу и не расщепляющий маннит и арабинозу. В бульоне через 18 - 24 ч роста при температуре плюс (37 1) °C - равномерное помутнение с пленкой на поверхности, на агаровых средах - в виде мутных сероватых роящихся колоний. В мазках - грамотрицательные палочки.

Подготовка тест-штаммов

1.13. Культуры каждого тест-штамма из ампулы или со среды хранения пересеваются в пробирку с бульоном Хоттингера pH (7,2 0,1) и на чашки Петри с агаром Хоттингера pH (7,2 0,1). Посевы с культурами штаммов Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377 и Y. pseudotuberculosis И-199 инкубируются при температуре плюс (28 1) °C в течение (48 1) ч; посевы с Р. vulgaris 19 - при температуре плюс (36 1) °C в течение (24 1) ч. Выросшие на питательном агаре культуры каждого штамма проверяются визуально на чистоту роста и пересеваются на скошенный в пробирках питательный агар. В случае отсутствия роста на питательной среде для последующего пассажа используется культура, выращенная на питательном бульоне. После инкубации посевов Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377 и Y. pseudotuberculosis И-199 при температуре плюс (28 1) °C и Р. vulgaris 19 - при температуре плюс (36 1) °C в течение (24 1) ч культуры используются для контроля питательных сред.

Для посева на испытуемые среды используются культуры тест-штаммов не более 3 - 4 пассажей на питательных средах.

Из суточных агаровых культур тест-штаммов готовится взвесь в 0,9 % растворе натрия хлорида pH (7,1 0,1) концентрацией 1 x 10 ⁹ м.к./мл Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Р. vulgaris по стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ФСО 3.1.00085 (ОСО 42-28-85) (10 ME) ¹⁴², делаются 10-кратные последовательные разведения, перенося 0,5 мл взвеси в 4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида до разведения 10 ^-7 (1 x 10 ² м.к./мл), тщательно перемешивая и меняя стерильную пипетку после переноса квоты каждого разведения.

------------------------------

¹⁴² Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания.

------------------------------

Определение показателя прорастания и чувствительности плотных и жидких питательных сред и скорости роста на них возбудителя чумы

1.14. При контроле жидких питательных сред культура из разведений 10 ^-5 (1 х 10 ⁴ м.к./мл) и 10 ^-6 (1 x 10 ³ м.к./мл) вносится по 0,1 мл в 3 пробирки с 10 мл жидкой питательной среды. Контролем служит заранее отконтролированный бульон.

Жидкие питательные среды считаются пригодными для использования в диагностических целях, если через 24 ч в бульоне появляется видимый рост культуры, а через 48 ч - интенсивный рост чумного микроба во всех пробирках при высеве 1 x 10 ³ м.к. на 10 мл среды (разведение 10 ^-5) и в одной из пробирок при посеве 1 x 10 ² м.к. на 10 мл среды (разведение 10 ^-6).

1.15. При контроле плотных сред культура из разведения 10 ^-6 (1 х 10 ³ м.к./мл) и 10 ^-7 (1 x 10 ² м.к./мл) наносится по 0,1 мл на 3 свежеприготовленные и хорошо подсушенные агаровые пластинки. Взвесь распределяется по поверхности агара покачиванием чашки Петри. Контролем должен служить заранее отконтролированный агар.

Плотные питательные среды должны обеспечивать рост чумного микроба через 48 ч инкубации на всех агаровых пластинках при высеве 10 м.к., показатель прорастания при высеве 100 м.к. должен быть не менее 50 %. Начальный рост чумного микроба ("кружевные платочки") должен быть через 24 ч инкубации; типичные колонии диаметром не менее 1 мм - через 48 ч. Морфология микробов - грамотрицательные биполярные полиморфные палочки.

Определение показателя эффективности

1.16. При контроле жидких питательных сред из суточной агаровой культуры штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ готовится взвесь из разведений 10 ^-5 (1 x 10 ⁴ м.к./мл) и 10 ^-6 (1 х 10 ³ м.к./мл). По 1 мл взвеси из каждого разведения вносится в 3 пробирки с 10 мл жидкой испытуемой среды. Исходное число засеянных клеток чумного микроба в 1 мл среды будет составлять соответственно 1 х 10 ³ и 1 х 10 ² м.к. Параллельно делается высев по 0,1 мл взвеси из разведения 10 ^-6 на 3 агаровые пластинки в чашках Петри для определения числа жизнеспособных клеток в посевной дозе (n ₀). Через 48 ч инкубации посевов при температуре плюс (28 1) °C из каждой пробирки производится высев по 0,1 мл на чашки с питательным агаром (n _t). В случае обильного роста культуры в жидкой среде она перед высевом на чашки разводится. Степень разведения учитывается при обсчете результатов. Прирост (J) числа микроорганизмов после инкубации посевов проводится по формуле (11):

ГАРАНТ:

Нумерация формулы приводится в соответствии с источником

-n0nt x 100

(11)

1.17. При контроле плотных питательных сред готовится взвесь штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ из суточной агаровой культуры с концентрацией 5 x 10 ⁸ м.к./мл, эквивалентная 5 единицам стандартного образца мутности бактериальных взвесей ФСО 3.1.00086 (ОСО 42-28-86) (5 ME) ¹⁴³. По 0,1 мл этой взвеси засевается на 2 пробирки с 5 мл скошенного испытуемого агара (в нижней части пробирки не должно быть столбика). Через 48 ч инкубации при температуре плюс (28 1) °C культура смывается с поверхности агара 2,5 мл 0,9 %-го раствора натрия хлорида. К 0,5 мл полученной взвеси мерно добавляется 0,9 %-й раствор натрия хлорида до концентрации 1 х 10 ⁹ м.к./мл по стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ФСО 3.1.00085 (ОСО 42-28-85) (10 ME) ¹⁴⁴. Например, к 0,5 мл взвеси, смытой со скошенного агара, было добавлено 3,2 мл растворителя. Всего объем взвеси составил 3,7 мл, концентрация бактерий в 1 мл среды - 3,7 х 10 ⁹ м.к.

------------------------------

¹⁴³ Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания.

¹⁴⁴ Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания.

------------------------------

Определение стабильности морфологических свойств культур при выращивании на контролируемых питательных средах

1.18. При определении стабильности морфологических свойств чумного микроба оценивается:

- характер роста культур в жидкой среде (хлопьевидный осадок, прозрачная надосадочная жидкость),

- форма, структура, характер роста колоний и их величина на плотной среде (шероховатые колонии не менее 1 мм в диаметре с кружевной периферией); количество атипичных колоний тест-штаммов должно составлять не более 1 %.

- морфология микробов - грамотрицательные биполярные полиморфные палочки.

Определение дифференцирующих свойств питательных сред

1.19. Дифференцирующие свойства питательной среды ЦДС, применяемой для идентификации чистых культур возбудителей чумы и псевдотуберкулеза, определяются с использованием тест-штаммов: Y. pestis EV линии НИИЭГ и Y. pseudotuberculosis И-199 по признаку ферментации углеводов и мочевины.

Для проведения контроля среды используются культуры тест-штаммов, выращенные при температуре плюс (28 1) °C в течение (23 1) ч на скошенном в пробирках агаре Хоттингера pH (7,2 0,1). По одной бактериологической петле N 2 по Чаплевскому (d = 2 мм) культуры штаммов Y. pestis EV линии НИИЭГ и Y. pseudotuberculosis И-199 вносятся "уколом" в столбик с 5 мл питательной среды, затем той же петлей производится посев "штрихом" на скошенную поверхность среды. Одна пробирка со средой остается незасеянной (контроль). Посевы инкубируются в течение 48 ч при температуре плюс (28 1) °C. Определяется наличие роста тест-штаммов и изменение цвета среды визуально. В последнем случае контролем служит пробирка со стерильной средой.

При росте Y. pestis EV линии НИИЭГ столбик среды окрашивается в красно-оранжевый цвет, скошенная поверхность в сине-зеленый; при росте Y. pseudotuberculosis И-199 - столбик и скошенная поверхность среды окрашиваются в синий цвет.

Контроль ингибирующих свойств питательных сред

1.20. При выделении возбудителя чумы из биологического материала или объектов внешней среды для подавления сопутствующей микрофлоры применяются среды с генцианвиолетом, кристаллвиолетом или питательная среда для выделения чумного микроба. Для приготовления рабочего раствора генцианвиолета готовится насыщенный спиртовой раствор: 1 г сухого препарата заливается 10 мл 96 % этилового спирта и остается на сутки при температуре плюс (22 1) °C. При необходимости срочного приготовления раствора он выдерживается в термостате при температуре плюс (37 1) °C в течение 2 - 3 ч. После соответствующей экспозиции 1 мл спиртового насыщенного раствора генцианвиолета добавляется к 99 мл дистиллированной воды и получается спиртово-водный рабочий раствор (1:1000).

1.21. Ингибирующие свойства среды определяются как по отношению к чумному микробу, так и по отношению к микробам-ассоциантам. Для выбора доз генцианвиолета испытываются следующие конечные концентрации препарата в агаре: 1:100000, 1:150000, 1:200000, 1:250000, 1:300000, 1:400000, для чего к 100 мл расплавленного агара добавляется соответственно 1,0; 0,66; 0,5; 0,4; 0,3; 0,25 мл рабочего раствора генцианвиолета.

Испытание ингибирующих свойств генцианвиолета проводится на отконтролированных питательных средах с проверенными стимуляторами роста (гемолизированная кровь, сульфит натрия), при необходимости - с добавлением витамина В1.

Для определения показателя ингибиции готовится смесь путем соединения 1 мл взвеси, содержащей 1 x 10 ³ м.к./мл штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ и 1 мл взвеси, содержащей 1 x 10 ⁶ м.к./мл Р. vulgaris. Из указанной смеси производится высев по 0,1 мл на агаровые пластинки с испытуемой средой - по 3 чашки на каждое разведение генцианвиолета и 3 чашки с агаром без ингибитора. Одновременно засеваются по 3 чашки с теми же средами культурой чумного микроба в дозе 1 x 10 ² м.к. Учет результатов проводится через 48 ч.

Для работы выбираются разведения генцианвиолета, резко тормозящие ползучий рост Р. vulgaris и не угнетающие рост чумного микроба. Допускается рост изолированных колоний Р. vulgaris 19 без тенденции кроению.

При посеве смеси чумного микроба и протея на плотную питательную среду без генцианвиолета должен быть сплошной рост протея. При посеве чумного микроба на агар без генцианвиолета среднее число колоний должно быть не менее 50, а на агар с генцианвиолетом - не менее 30.

1.22. В целях ингибиции посторонней микрофлоры можно использовать кристаллвиолет в той же концентрации после соответствующего контроля и определения оптимальных доз.

Контроль стимуляторов роста чумного микроба

1.23. Для стимуляции роста чумного микроба на питательных средах используется сульфит натрия ¹⁴⁵ и кровь гемолизированная.

------------------------------

¹⁴⁵ГОСТ 195-77 "Натрий сернистокислый. Технические условия", введенный постановлением Госстандарта СССР от 11.01.1977 N 58.

------------------------------

1.23.1. Раствор сульфита натрия готовится ex temporae. Навеска препарата (0,25 г) растворяется в 10 мл стерильной дистиллированной воды и подогревается на пламени горелки до кипения. Раствор в количестве 1 мл добавляется к 100 мл расплавленного агара, хорошо перемешивается и разливается по чашкам Петри. К 10 мл питательного бульона добавляется 0,1 мл (2 капли) раствора сульфита натрия.

Перед использованием сульфита натрия проводится проверка его качества. К агару, утратившему свою биологическую активность, дающему рост чумного микроба при посеве 1 x 10 ² м.к. в виде единичных колоний (1 - 4) или при отсутствии его роста, добавляется испытуемый раствор сульфита натрия в концентрациях 1:8000, 1:4000, 1:2000, 1:1000. Контролем служит тот же агар без добавления стимулятора, а также заранее отконтролированный агар. Сульфит натрия считается годным в той наименьшей концентрации, при которой он обеспечивает рост не менее 50 колоний тест-штамма чумного микроба.

Сульфит натрия проверяется через 2 - 3 месяца, т.к. при неправильном хранении (в негерметичной посуде, на свету) препарат окисляется до сульфата натрия, который не стимулирует роста чумного микроба.

1.23.2. Кровь гемолизированная выпускается в ампулах по 5 мл, хранится при температуре плюс 2 - 10 °C в защищенном от света месте, срок годности - 5 лет. Для определения степени стимуляции гемолизированной крови используется агар Хоттингера pH (7,2 0,1) с низким содержанием аминного азота (35 10) мг %#, хлоридов не выше 0,5 %, агара микробиологического 2,0 - 2,3 %, на котором при посеве 1 х 10 ² м.к. чумного микроба отсутствуют или вырастают единичные колонии (1 - 4). В агар, разлитый по 100 мл, расплавленный и остуженный до температуры плюс (46 1) °C, добавляется 1 мл крови гемолизированной, которая перемешивается со средой путем легкого покачивания флакона. Агар разливается в чашки Петри, контролем служит эта же агаровая среда без добавления стимулятора. На все агаровые пластинки засевается суточная культура вакцинного штамма чумного микроба по 1 x 10 ² м.к. в 0,1 мл взвеси в 0,9 % растворе натрия хлорида. Посевы помещаются в термостат при температуре плюс (28 1) °C на 2 - 3 сут, затем подсчитывается число выросших колоний. Стимулятор считается пригодным для работы в том случае, если на среде с гемолизированной кровью вырастает не менее 30 колоний, а на среде без него рост отсутствует или вырастают единичные колонии.