Приложение 19. Определение вирулентности исследуемого штамма чумного микроба

Приложение 19
к МУ 3.1/4.2.4065-24

Определение вирулентности исследуемого штамма чумного микроба

Определение величины LD ₅₀ и DCL для морских свинок и белых мышей

1. Величина LD ₅₀ (англ. Lethal dose ₅₀) - минимальное количество микробных клеток, при заражении которыми погибает 50 % зараженных животных.

2. Величина DCL (абсолютно летальная доза, англ. Dosis certae letalis) - минимальное количество микробных клеток, при введении которой наблюдается гибель всех зараженных животных.

3. Испытания проводятся на морских свинках массой 300 - 350 г и на белых нелинейных мышах массой 20 - 25 г.

Животные распределяются на 5 равнозначных групп: при определении величины LD ₅₀ - по 8 животных в группе, при определении DCL - по 3 животных.

4. Морские свинки и белые мыши заражаются подкожно во внутреннюю поверхность бедра дозами 5, 10, 20, 40, 80, 160 м.к. в объеме 0,5 мл для морских свинок, 0,2 мл - для белых мышей.

5. Для заражения используется двухсуточная агаровая культура исследуемого штамма чумного микроба 2 пассажа, выращенная на питательной среде агар Хоттинера pH (7,2 0,1) (или аналогичной) при температуре плюс (28 1) °C. Готовится стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ФСО 3.1.00085 (ОСО 42-28-85) (10 ME) ¹⁴⁸. Затем путем последовательных разведений в 0,9 % растворе натрия хлорида взвесь культуры в 0,9 % растворе натрия хлорида с концентрацией 1 x 10 ⁹ м.к./мл по доводится до концентраций 10, 20, 40, 160 и 320 м.к./мл для заражения морских свинок и до концентраций 25, 50, 100, 200, 400 и 800 м.к./мл для заражения белых мышей. Каждая доза исследуемого штамма чумного микроба вводится 8 (или 3) животным.

------------------------------

¹⁴⁸ Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания.

------------------------------

6. Для определения фактического содержания микробных клеток в заражающей дозе по 0,1 мл взвеси, содержащей 1 x 10 ³ м.к./мл высевается на 3 чашки Петри с питательной средой методом "обкатки" чашки. Посевы инкубируются при температуре плюс (28 1) °C в течение 48 ч, после чего подсчитывается количество выросших колоний.

7. Наблюдение за животными ведется в течение 14 сут. Павшие животные вскрываются, органы и ткани высеваются методом отпечатков на чашки с агаром Хоттингера pH (7,2 0,1). У морских свинок берутся пробы из регионарных паховых лимфатических узлов, места введения, селезенки, печени, легких, сердца, у белых мышей - из селезенки.

8. Посевы инкубируются при температуре плюс (28 1) °C в течение 10 сут, ежедневно просматриваются. Гибель животных от чумы устанавливается на основании патологоанатомической картины и выделения из посевов культуры Y. pestis.

Подсчет LD ₅₀ по методу Кербера

Величина LD ₅₀ вычисляется по формуле (12) ¹⁴⁹:

ГАРАНТ:

Нумерация формулы приводится в соответствии с источником

------------------------------

¹⁴⁹Приложение 2 МУК 4.2.2317-08 "Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий", утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008.

------------------------------

Li - 0,5),#

(12)

где: D - максимальная из испытанных доз;

- логарифм кратности разведений;

Li - отношение количества животных, погибших при введении данной дозы, к общему числу животных, которым эта доза была введена;

- сумма значений Li, вычисленных для всех испытанных доз.

Если при заражении указанными дозами животные не погибнут от чумы в течение 14 сут, то величины DCL и LD ₅₀ определяются в опыте с увеличением заражающих доз исследуемого штамма.

Примеры расчета LD ₅₀

Пример 1:

Дозы (Количество микробных клеток в мл) D	Результат опытов		Отношение числа павших к числу всех животных, которым введена данная доза (Li)	Сумма значений Li, вычисленных для всех испытанных доз
	Число животных, зараженных данной дозой	Пало животных
2 * 10 5 (200000)	8	8	1,0	3,75
2 * 10 4 (20000)	8	8	1,0
2 * 10 3 (2000)	8	8	1,0
2 * 10 2 (200)	8	4	0,5
2 * 10 (20)	8	2	0,25
Примечание: все животные пали по специфическим причинам; каждая доза введена одинаковому количеству животных. Кратность разведений равна 10. - = lg10 = 1 lgLD 50 = lg200000 - Ig10(3,75 - 0,5) = 5,30103 - 1 * 3,25 = 2,05103 LD 50 = 10^2,05103 = 112,4683 113 микробных клеток.

Таким образом, LD ₅₀ в данном примере составляет 63 микробные клетки.

Если не все подопытные животные пали по специфическим причинам, то доля животных, павших от введенной дозы, рассчитывается не по отношению ко всем животным, которым введена данная доза, а по отношению к сумме числа животных, выживших и павших по специфическим причинам.

Пример 2 [26]:

Дозы (количество микробов в 1 мл) D	Результат опытов				Отношение числа павших по специфическим причинам к сумме числа выживших и павших по специфическим причинам (Li)	Сумма значений Li, вычисленных для всех испытанных доз
	Число животных, зараженных данной дозой	Пало по неспецифической причине	Пало по специфической причине	Выжило
2 * 10 5 (200000)	8	0	8	0	1,0	2,395
2 * 10 4 (20000)	8	0	7	1	0,87
2 * 10 3 (2000)	8	3	2	3	0,4
2 * 10 2 (200)	8	0	1	7	0,125
2 * 10 (20)	8	0	0	8	0

Дальнейшие расчеты ведутся аналогично примеру 1.