Приложение 15. Постановка биологической пробы

Приложение 15
к МУ 3.1/4.2.4065-24

Постановка биологической пробы

1. Постановка биологической пробы не только увеличивает вероятность выделения культуры, но и необходима при ее идентификации. Для биологических проб используются морские свинки и белые мыши. Можно использовать диких грызунов, обладающих высокой чувствительностью к чуме. Дикие грызуны используются только в том случае, если они после отлова выдержаны в карантине не менее 30 сут до заражения и серологический анализ на наличие антител к F1 чумного микроба в сыворотке крови был отрицательный. Рекомендуется, чтобы грызуны были выловлены в тех же местах, откуда производится забор материала для исследования.

Пунктаты бубона, везикул, пустул, кровь, суспензию органа(ов), костного мозга, мокроту и другой материал вводятся лабораторным животным подкожно: 0,5 мл морским свинкам и 0,2 мл белым мышам или для ускорения гибели подопытного животного - внутрибрюшинно. При внутрибрюшинном заражении морским свинкам вводится материал в объеме 0,5 - 1,0 мл, а белым мышам - 0,3 - 0,5 мл. Если имеется предположение, что во вводимом материале возбудитель чумы находится в незначительном количестве, заражающая доза увеличивается: морской свинке вводится подкожно в паховую область 1,5 - 2 мл, белой мыши - 0,5 - 1,0 мл под кожу спины.

Если в исследуемом материале предполагается наличие банальной микрофлоры или гнилостных микробов, пользуются методом втирания материала в кожу животного. Для этого у биопробного животного выщипывается в области живота участок кожи (у морских свинок размером 2 x 3 см, у белых мышей 1 x 2 см). Свободный от шерсти участок кожи и шерсть вокруг него смачивается стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида. Кожа скарифицируется скальпелем до появления гиперемии и небольших поверхностных кровоизлияний. Материал наносится на этот участок в виде густой взвеси и тщательно втирается плоской поверхностью скальпеля. Во избежание разбрызгивания втирание материала производится под прикрытием большой воронки или крышки от чашки Петри.

Если исследуемые трупы имеют признаки разложения, то животные заражаются раздельно суспензиями из органов и костного мозга. Заражение одновременно двумя методами (суспензией органов - накожно, суспензией костного мозга - подкожно или внутрибрюшинно) в ряде случаев помогает сократить сроки установления диагноза и избежать риска гибели животного от посторонней микрофлоры.

Кусочки паренхиматозных органов и лимфатических узлов для постановки биологической пробы растираются в ступке со стерильным кварцевым песком. Затем добавляется небольшое количество 0,9 % раствора натрия хлорида, бульона Хоттингера или 1 % пептонной воды, тщательно перемешивается и через тонкий слой стерильной ваты суспензия набирается в шприц. Слизь из зева или вязкая мокрота эмульгируется в 0,9 % растворе натрия хлорида в стерильной чашке Петри.

1.1. Из паренхиматозных органов (печень, селезенка, легкое), лимфатических узлов и крови биопробных животных, погибших после заражения, делаются посевы на твердые и жидкие питательные среды, а мазки-отпечатки - на предметные стекла. Суспензия, приготовленная из тканей внутренних органов, исследуется серологическим методом на присутствие F1. Оставшиеся в живых после заражения животные умерщвляются на 5 - 7 сутки и производится патологоанатомическое, бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое исследования.

У животных, погибших от чумы в результате подкожного или накожного заражения, в месте введения материала обнаруживаются полнокровие, серозно-геморрагическое пропитывание тканей, нагноение, некроз. Лимфатические узлы увеличены, гиперемированы, нередко инфильтрированы геморрагическим экссудатом, могут быть плотными или размягченными, окружающие ткани пропитаны студневидной серозно-геморрагической или гнойно-геморрагической жидкостью. В тканях узла могут быть очаги некроза и нагноения. В селезенке, печени, легких наблюдаются единичные или множественные от мелкоточечных до величины булавочной головки узелки сероватого цвета. Вокруг некоторых из них, особенно в легких, определяются венчики гиперемии. В легких могут быть очаги кровоизлияния и участки уплотнения темно-красного или серовато-красного цвета (очаги пневмонии). Селезенка, печень, надпочечники увеличены, полнокровны с участками некроза. В некоторых случаях в брюшной полости обнаруживается вязкий экссудат.

При накожном заражении на месте введения можно обнаружить мелкие везикулы (пузырьки), окруженные зоной гиперемии, или язвочки. При внутрибрюшинном методе заражения развивается экссудативный перитонит с образованием фибринозно-гнойных пленок на капсуле селезенки и печени.

В том случае, когда рост возбудителя чумы в прямом посеве исследуемого материала отсутствует, а биопробное животное погибает, суспензия его органов вводится второму биопробному животному и засевается на питательные среды. Исследование второго животного проводится так же, как и первого.

2. Ускоренному установлению диагноза чумы может способствовать поэтапное исследование биопробных животных. Для этого одновременно подкожно и внутрикожно заражаются несколько лабораторных животных - морские свинки и белые мыши. Последовательно через 1, 2, 3 сут умерщвляются по одному животному и подвергаются исследованию по общепринятой методике. Особое внимание обращается на посевы из места введения материала и регионарных лимфатических узлов. При этом материал, подлежащий исследованию, высевается параллельно на две агаровые пластинки для одновременной постановки на одной из них пробы с чумным бактериофагом.

Введение куриного желтка или гидрокортизона лабораторным животным снижает их резистентность к чуме и позволяет ускорить постановку диагноза в случаях малой заражающей дозы или сниженной вирулентности возбудителя. Для постановки биопробы стерильно взятый желток куриного яйца смешивается с 8 мл 0,9 % раствора хлорида натрия, тщательно эмульгируется. Полученная эмульсия желтка одновременно с исследуемым материалом вводится животным в объеме 0,5 мл для белой мыши, 1 мл - для морской свинки. Гидрокортизон вводится лабораторным животным до заражения в дозе 5 мг в объеме 0,5 мл 0,9 % раствора хлористого натрия под кожу области бедра.

3. Ускорить получение результата биологического исследования позволяет метод определения антигенурии у лабораторных и диких грызунов (прижизненное определение в моче грызунов F1 в системе однонаправленных серологических реакций (РНГА-РНАт). Этот подход можно использовать при постановке биологических проб на белых мышах, морских свинках и диких грызунах при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы (антигенурия у отловленных грызунов). Наличие антигенурии отмечается на 2 - 3 сутки после заражения животного чумой.

Для отбора проб мочи животные помещаются в зависимости от их размера в 2 - 10-литровые банки или клетки с фиксирующимися крышками. В банки (клетки) предварительно настилаются 2 листа фильтровальной бумаги, вырезанные по размеру дна, и дается корм: ячмень, пшеница, кукуруза; для стимуляции диуреза - морковь, капуста. Банки (клетки) ежедневно меняются. Участки подстилки с пятнами мочи вырезаются, помещаются в пробирки и заливаются 4 - 6 мл 0,1 М фосфатного буфера с 2 % раствором формалина. Через 12 - 24 ч содержимое пробирки уплотняется металлической палочкой, надосадочная жидкость исследуется в системе РНГА-РНАт. Обнаружение в пробе капсульного антигена свидетельствует о наличии чумы у животного.