Приложение 14. Методы индикации и идентификации возбудителя чумы

Методы индикации и идентификации возбудителя чумы

Метод флуоресцирующих антител

1. МФА относится к экспресс-методам обнаружения возбудителя чумы. Является одним из наиболее специфичных методов и позволяет обнаружить F1 возбудителя чумы через 1 - 2 ч после начала исследования. Однако положительный результат может быть получен лишь при наличии сравнительно высокой концентрации микробных клеток в исследуемом материале - не менее 1 х 10⁵ м.к./мл.

В целях повышения специфичности результата целесообразно применять МФА с контрастированием неспецифического свечения микрообъектов с помощью альбумина, меченого родамином.

Мазки из мокроты, содержимого бубона и крови, а также мазки-отпечатки из органов животных готовятся на обезжиренных предметных стеклах по общепринятой методике. Наличие на предметных стеклах кусочков тканей органов недопустимо. Предметные стекла для мазков маркируются простым карандашом. Нельзя применять для надписей на стеклах восковые карандаши, так как воск, растворяясь в фиксаторе, образует на стеклах пленку, препятствующую люминесцентной "окраске" бактерий.

Мазки фиксируются в течение 30 мин в 96 % этиловом спирте. До окончания фиксации препараты из материала, подозрительного на зараженность возбудителем чумы, считаются заразными. В процессе фиксации не допускается слипания между собой отдельных предметных стекол. После окончания фиксации препараты высушиваются на воздухе.

На поверхность фиксированного и высушенного мазка, помещенного во влажную камеру (чашка Петри с кусочком смоченной в воде ваты), наносится капля иммуноглобулинов диагностических чумных флуоресцирующих в рабочем разведении в соответствии с инструкцией производителя.

При "окраске" мазков с контрастированием неспецифического свечения на фиксированные мазки наносится смесь иммуноглобулинов диагностических чумных флуоресцирующих с альбумином, меченым родамином (1:1), разведенных до половины рабочего титра. Окраска производится в течение 20 мин при комнатной температуре.

Мазки ополаскиваются дистиллированной водой и промываются двух-трехкратно (по 3 - 5 мин) 0,9 % раствором натрия хлорида. После этого препараты вновь ополаскиваются дистиллированной водой и высушиваются на воздухе.

Микроскопия мазков проводится с помощью люминесцентного микроскопа, применяя специальное не люминесцирующее иммерсионное масло.

Степень яркости люминесценции бактерий, "окрашенных" флуоресцирующими иммуноглобулинами, принято оценивать по следующей шкале:

- 4+ - яркая флуоресценция микробной клетки с четко выраженным ободком по периферии;

- 3+ - умеренная флуоресценция микробной клетки с четко выраженным ободком по периферии;

- 2+ или 1+ - слабая равномерная флуоресценция микробной клетки без выраженного ободка.

Специфическим считается изумрудно-зеленое свечение по периферии бактериальных клеток с яркостью 4+ или 3+, свечение с яркостью 2+ или 1+ принято считать неспецифическим. Обнаружение специфического свечения хотя бы у 2 - 5 клеток в каждом поле зрения свидетельствует о наличии в исследуемом материале чумного микроба.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

2. Применение иммуноферментного метода позволяет выявлять антиген F1 возбудителя чумы в концентрации 4 нг/мл; чувствительность метода составляет 1 х 10⁶ м.к./мл. Постановка реакции и учет результатов осуществляется в соответствии с инструкцией производителя. Время анализа составляет 2 - 4 ч. Возможен визуальный и инструментальный учет результатов.

Молекулярно-генетический анализ

3. Для индикации и идентификации чумного микроба используются тест-системы различных производителей, зарегистрированные в установленном порядке¹³³. Препараты предназначены для выявления ДНК чумного микроба в пробах биологического материала и из объектов окружающей среды. Чувствительность метода 1 х 10³ м.к/мл, время выполнения анализа - 2 - 5 ч.

------------------------------

¹³³Часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

------------------------------

Детекция чумного микроба основана на амплификации нуклеотидной последовательности фрагментов генов видоспецифичных плазмид pFra и pPst или видоспецифичных участков хромосомы возбудителя.

С целью обеззараживания материала к исследуемым образцам добавляется мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01 %) с последующим прогреванием их при температуре плюс 56 °C в течение 30 мин. После прогревания 100 мкл образца переносится в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляется лизирующий раствор на основе 6 М гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к тест-системе, и инкубируется 15 мин при температуре плюс 65 °C. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным.

Выделение ДНК, проведение амплификации и учет результатов осуществляется в соответствии с инструкциями по применению тест-систем.

Гемагглютинационные тесты

4. Гемагглютинационные тесты - РНГА, реакции торможения непрямой гемагглютинации (далее - РТНГА), реакции нейтрализации антител (далее - РНАт) или антигена (далее - РНАг).

4.1. Для индикации антигена F1 возбудителя чумы, в тех случаях, когда выделение возбудителя затруднено или маловероятно, применяются РНГА и другие гемагглютинационные тесты с использованием эритроцитарного чумного иммуноглобулинового диагностикума. Для выявления специфических антител, используется эритроцитарный чумной антигенный диагностикум.

Постановка гемагглютинационных реакций для выявления капсульного антигена F1 чумного микроба или антител к нему проводится в соответствии с инструкциям по применению эритроцитарных диагностикумов.

Используются макро- или микрометод постановки указанных реакций.

Гемагглютинационные тесты можно применять на всех этапах исследования материала (нативный материал, после подращивания, при исследовании биопробных животных и идентификации культуры). Результат учитывается через 2 - 4 ч предварительно, через 24 ч - окончательно. Нецелесообразно проводить поиск антигена F1 в сыворотке крови больных людей в системе РНГА-РНАт из-за малого количества этого антигена в крови больных.

Обеззараженный исследуемый материал объемом 150 мкл переносится в пластиковые микропробирки объемом 1,5 мл. Для проведения термической обработки проб или бактериальных взвесей используется водяная баня (ультратермостат), оснащенная контактным термометром, или твердотельный термостат, прогретые до температуры плюс (75 2) °C. Исследуемые образцы в пробирках выдерживаются при этой температуре 30 мин. После термообработки пробы в случае необходимости (выпадение большого количества денатурированного белка или других хлопьевидных примесей), центрифугируются при 1000 об/мин в течение 2 - 3 мин. Для дальнейшей работы используется супернатант. Подготовленный таким образом материал исследуется в системе взаимно контролируемых реакций РНГА-РНАт по обычной методике в объеме 0,025 мл.

По сравнению со стандартной термоинактивацией при температуре плюс 56 °C в течение 30 мин после термообработки материала в предлагаемом режиме (температура плюс (75 2) °C в течение 30 мин) титр в РНГА обычно повышается на 1 - 2 разведения. В РНАт серологическая активность антигена F1 Y. pestis относительно стабильна при более широком диапазоне термоинактивации.

4.2. Обнаружение специфических антител к антигену F1 чумного микроба относится к ретроспективной диагностике чумы. Иммуносуспензионные реакции для обнаружения антител к антигену F1 используются в системе мероприятий по эпизоотологическому обследованию природных очагов чумы.

Сыворотки крови людей и верблюдов получают обычным способом и инактивируют при температуре плюс 56 °C в течение 30 мин в присутствии мертиолята натрия в конечной концентрации 1:10000. Сыворотки перед исследованием адсорбируются 50 % взвесью формалинизированных эритроцитов барана в соотношении 1:10 с целью устранения возможных неспецифических результатов реакции. Смесь выдерживается 15 мин в термостате при температуре плюс 37 °C. Затем центрифугируется при 1000 - 2000 об/мин в течение 3 - 5 мин. Надо садочная жидкость отбирается и используется для постановки реакций.

Для исследования допускается использовать высушенные образцы крови и сыворотки, для чего фильтровальная бумага (2 x 2 см), обработанная 0,1 % раствором мертиолята натрия и высушенная, пропитывается 0,2 мл крови. После высыхания образцы помещаются в маркированную пробирку, а перед исследованием заливаются 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, что соответствует разведению сыворотки 1:10. После 40-минутной экспозиции надосадочная жидкость готова для серологического исследования.

Приготовление "смыва" из грудной полости мелких млекопитающих начинается с сепарирования кожи от грудины животного, надреза окологрудинных костей, удаления грудины и легких. Затем рассекаются крупные сосуды и сердце и в грудную полость вносится небольшое (0,5 - 1,0 мл) количество 0,9 % раствора натрия хлорида с мертиолятом натрия, в разведении 1:4000. После перемешивания вся образовавшаяся жидкость отбирается и переносится в пробирку, добавляется 0,9 % раствор натрия хлорида с мертиолятом натрия в разведении 1:8000 в объеме согласно табл. П14.1 приложения 14 к настоящим МУ, для получения разведения "смыва", соответствующего разведению сыворотки 1:10.

Таблица П14.1

Схема расчета объемов разводящей жидкости для приготовления "смыва"

Вид животного (взрослые особи)	Объем разводящей жидкости, вливаемый в грудную полость (мл)	Объем разводящей жидкости, необходимый для разведения "смыва" (мл)
Большая песчанка	1,0	3,0
Полуденная песчанка	0,5	1,0
Краснохвостая песчанка	1,0	2,0
Гребенщиковая песчанка	1,0	2,0
Суслики (разных видов)	1,0	3,0
Полевка обыкновенная	0,5	1,0
Полевки (других видов)	0,5	0,5
Пищухи (разных видов)	1,0	1,5
Сурки, добытые методом отстрела	1,0	3,0
Сурки и другие крупные млекопитающие (заяц-толай, степной хорь, корсак, лиса), добытые методом отлова	Целесообразно использовать цельную сыворотку крови, которую можно получить, помещая в пробирку сгустки крови из сердца (сыворотку из сгустков крови можно получить в течение суток после умерщвления животного).
Примечание: для разведения "смывов", полученных от молодых особей, следует брать половинный объем разводящей жидкости.

"Смывы", а также высушенные образцы крови в качестве материала для серологического исследования уступают сывороткам по результативности.

Антитела к чумному микробу выявляют с помощью РНГА с антигенным и РНАг с иммуноглобулиновым диагностикумами. В первом случае при положительном результате наблюдается агглютинация эритроцитов, во втором - осаждение эритроцитов на дно лунки в виде пуговки или колечка с ровным краем.

Выявление антигена F1 Y. pestis с использованием ИХА

5. ИХА для выявления возбудителя чумы используется при исследовании проб из объектов окружающей среды и идентификации культуры Y. pestis. Специфической мишенью является капсульный антиген F1 Y. pestis. Данный тест позволяет выявлять его в концентрации 0,01 мг/мл. Чувствительность метода составляет 1 х 10⁷ м.к./мл. Тест-система не позволяет выявлять бескапсульные штаммы возбудителя чумы.

Для проведения идентификации культура возбудителя суспендируется в 0,01 % натрий-фосфатном буфере, pH 7,4 - фосфатно-буферном растворе (далее - ФБР) по стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ФСО 3.1.00085 (ОСО 42-28-85) (10 ME)¹³⁴, что соответствует концентрации 1 х 10⁹ м.к./мл, и прогревается на водяной бане при температуре плюс 56 °C в течение 30 мин. Затем полученная микробная взвесь доводится с помощью фосфатного буферного раствора (далее - ФБР) до концентрации 1 х 10⁷ м.к/мл.

------------------------------

¹³⁴ Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания.

------------------------------

Для выявления возбудителя чумы из объектов окружающей среды, с целью концентрирования микробных клеток, проводится предварительная подготовка исследуемой пробы с соблюдением санитарно-эпидемиологических требований. Панель теста помещается в горизонтально установленную чашку Петри и в лунку для образца пипеткой вносится 0,1 мл подготовленного материала, а через 3 мин в - 0,1 мл ФБР. Результат теста (наличие или отсутствие видимых красных линий) учитывается через 15 - 20 мин в соответствии с таблицей интерпретации результатов, представленной в инструкции к набору.

ИХА для серодиагностики чумы

6. ИХА используется для исследования сывороток крови человека и грызунов на наличие специфических иммуноглобулинов G (далее - IgG) к антигену возбудителя чумы F1. В пробу сыворотки, разведенной 1:100 ФБР с 0,5 % Твин 80, погружается диагностический стрип нижним концом. Разведенная сыворотка впитывается в сорбционную подушечку, после чего начинается миграция IgG, содержащихся в сыворотке, вверх по стрипу. При наличии в сыворотке специфических антител они связываются с антигеном F1 - формируется нижняя полоса розового цвета. Неспецифические иммуноглобулины мигрируют выше по стрипу, взаимодействуют с адсорбированным бычьим сывороточным альбумином (далее - БСА), образуя верхнюю контрольную полосу розового цвета, которая свидетельствует об эффективности миграции.

Результаты реакции регистрируются визуально через 15 - 20 мин: согласно прилагаемой инструкции появление на стрипе только верхней (контрольной) розовой полосы является отрицательным результатом исследования и свидетельствует о корректной работе тест-системы. Положительная реакция (наличие в исследуемой сыворотке специфических IgG) характеризуется наличием контрольной верхней и нижней (рабочей) полос розового цвета.

Тест-система позволяет выявлять специфические IgG к антигену F1 возбудителя чумы в исследуемых сыворотках с титром не менее 1:3200 и не выявляет антитела к антигенам близкородственных микроорганизмов (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica).

Определение морфологии бактериальных клеток в мазках

7. Для приготовления мазка кровь, пунктат или отделяемое бубона, содержимое везикулы, пустулы, пунктат из плотных частей карбункула наносится на предметное стекло с помощью петли (пастеровской пипетки с узким капилляром или с использованием автоматического дозатора) и осторожно растирается платиновой (одноразовой) петлей, не допуская разбрызгивания. При приготовлении мазков из мокроты, стерильным пинцетом или петлей захватывается комочек с прожилками крови и растирается на стекле. При приготовлении мазков из отделяемого зева, используется тампон, одной стороной которого проводят по предметному стеклу. Мазки из крови можно готовить по методике, используемой в клинических лабораториях, с помощью предметных стекол со шлифованным краем.

При исследовании трупного (секционного) материала (от людей или животных) делаются мазки-отпечатки. Для этого от каждого кусочка органа стерильными ножницами отрезается небольшая часть и поверхностью свежего среза делаются отпечатки на предметном стекле. Чтобы получить более тонкие отпечатки, следует вначале сделать несколько оттисков на фильтровальной бумаге, а затем уже на стекле. На одном предметном стекле делаются отпечатки из всех органов, располагая их поперек длины стекла в следующем порядке: из лимфатического узла наносятся на стекло 4 отпечатка, селезенки - 3, легкого - 2, печени - 1, крови - длинный мазок поперек стекла.

Приготовленные мазки высушиваются на воздухе, после чего фиксируются погружением в 96 % этиловый спирт или смесь Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира) на 30 мин с последующим высушиванием на воздухе.

При обнаружении первых случаев заболеваний с подозрением на чуму, или трупа человека, погибшего от чумы, готовятся не менее 6 - 8 мазков. Один окрашивается 1 % водным раствором метиленовой синьки, второй - по Граму, третий обрабатывается иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими. Остальные мазки оставляются неокрашенными для повторных исследований.

В мазках возбудитель чумы - мелкая (1 - 3 x 0,5 - 0,7 мкм) прямая или овоидная, бочкообразная грамотрицательная палочка, отличающаяся полиморфизмом - наряду с обычными палочками и короткими коккобактериями встречаются и более длинные клетки (в мазках из органов грызунов, материала от человека и бульонных культур хорошо выявляется биполярное окрашивание клеток, при окраске мазка иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими наблюдается специфическое свечение клетки по периферии).

Определение характера роста на питательных средах

8. Для посевов используются высокопитательные, предварительно проверенные на ростовые качества, среды: Хоттингера и Мартена, LB, кровяной агар или агар из настоя бычьего сердца и соответствующие бульоны, казеиново-дрожжевой агар и др. (pH 7,2). Инкубация при температуре плюс 28 °C или в ряде случаев при температуре плюс 37 °C.

Жидкая мокрота с примесью крови наносится на поверхность агара платиновой (2 - 3 петли) либо одноразовой полимерной (на 10 мкл) петлями или с использованием автоматического дозатора, растирается шпателем или рассевается частыми штрихами петлей и далее осуществляется посев с "истощением" на вторую и третью пластинки агара. Если мокрота вязкая, то ее комочек с прожилками крови стерильным пинцетом или толстой платиновой (крученой) или полимерной одноразовой петлей переносится на поверхность агара и тщательно растирается шпателем по поверхности агара или расштриховывается петлей сначала в первой, затем переносом во второй чашках.

Слизь из зева забирается стерильным ватным тампоном, засевается на питательный агар с добавлением генцианвиолета, тампон с остатками материала помещается в 2 мл бульона Хоттингера, LB или Мартена с добавлением генцианвиолета.

Сгусток крови из пробирки осторожно переносится в чашку Петри. Стерильными препаровальными иглами нарушается его целостность и максимально высвобождается от фибрина жидкая кровь. Кровь набирается в пипетку, засевается во флаконы с бульоном, а 0,1 мл - на поверхность агаровой пластинки и распределяется шпателем. Остатки крови используются для заражения биопробных животных.

Пунктат из бубона, везикулы (если материала мало, то его разводят в 0,3 - 0,5 мл бульона) петлей, пастеровской или автоматической пипеткой засевается: на поверхность агара в чашке Петри и распределяется шпателем или частыми штрихами платиновой или одноразовой полимерной петлей; 0,1 мл материала вносится в пробирку с бульоном. Оставшийся материал используется для заражения лабораторных животных. Материал из вскрывшегося бубона, язвы, карбункула засевается на поверхность агаровых пластинок с генцианвиолетом и сульфитом натрия или лизированной кровью.

Другие материалы (например, спинномозговая жидкость) в соответствии с характером материала засеваются в бульон и (или) на поверхность агаровых пластинок по изложенной выше методике.

При исследовании материала от человека с подозрением на заболевание чумой или секционного материала от трупа человека посев каждой пробы производится на индивидуальную чашку с агаром.

При выращивании возбудителя чумы в бульоне наблюдается порошковидный или хлопьевидный осадок, легко распадающийся при встряхивании, сам бульон - прозрачен. Иногда образуется нежная пленка, которая в дальнейшем огрубевает, и на нижней ее поверхности могут появляться нити.

На пластинках питательного агара через 12 ч роста возбудителя чумы формируются прозрачные микроколонии в виде "битого стекла", а через 18 - 24 ч - мелкие, плоские, полупрозрачные колонии - "кружевные платочки", морфология которых имеет диагностическое значение. В дальнейшем (24 - 48 ч) "кружевные платочки" превращаются в типичные желтовато-коричневые колонии диаметром 1,5 - 2 мм с выпуклым более темным мелкозернистым центром и плоским волнистым фестончатым краем (характерный для возбудителя чумы R-тип колоний). По мере старения колоний (48 - 72 ч) центр становится более грубым, непрозрачным, приобретает серовато-коричневатый оттенок. При выращивании при температуре плюс 28 °C колонии относительно сухие, хорошо снимаются петлей; при температуре плюс 37 °C - вязкие и труднее снимаются с поверхности агара.

На скошенном агаре Y. pestis растет в виде прозрачного, сероватого, вязкого, нежного влажного налета.

На агаре Мак-Конки при температуре плюс 37 °C через 24 ч наблюдается слабый рост, едва различимый невооруженным глазом.

При выращивании на дезоксихолатно-цитратном агаре через 48 ч при температуре плюс 37 °C вырастают немногочисленные колонии красноватого оттенка величиной с булавочную головку.

На пластинке желатина формируются сероватые плоские колонии с зернистым краем; в столбике желатина наблюдается рост на поверхности и в глубине по уколу, среда не разжижается.

На кровяном агаре возбудитель чумы вырастает в виде зернистых колоний с маленькой "кружевной" зоной или без нее.

Определение чувствительности к бактериофагам

9. Постановка тестов чувствительности к бактериофагам с использованием коммерческих препаратов проводится в соответствии с инструкциями производителя.

9.1. Метод стерильного пятна. На подсушенную поверхность агара Хоттингера, Мартена, казеиново-дрожжевого, мясопептонного или LB (pH 7,2 - 7,3) бактериологической петлей наносится 18 - 20-часовая (логарифмическая фаза) исследуемая агаровая культура и равномерно распределяется по поверхности. Чашка делится на 3 сегмента и в центр каждого сегмента наносится по одной капле (10 - 20 мкл) или одной петле (диаметр 2 мм) чумного диагностического Покровской, чумного Л413-С и псевдотуберкулезного диагностического бактериофагов. Агаровые пластинки подсушиваются, чашки переворачиваются и ставятся в термостат на 15 - 18 ч при температуре плюс 28 °C.

Если исследуемая культура относится к возбудителю чумы, то на месте нанесения бактериофагов рост отсутствует, образуется "стерильное пятно" - что считается положительным результатом.

9.2. Двухслойный метод. В пробирку с 2,5 - 4,5 мл 0,7 % агара (на любой питательной основе), расплавленного и остуженного до температуры плюс 45 °C, добавляется 0,1 мл 1 х 10⁹ м.к. 18-ти часовой агаровой культуры и выливается на агаровую пластинку (1,5 %) в чашку Петри. Чашки с полуприкрытыми крышками подсушиваются при комнатной температуре 20 - 30 мин. Затем наносятся диагностические бактериофаги как указано выше. Посевы инкубируются в термостате при температуре плюс 28 °C. Результаты учитываются через 18 ч, в экстренных случаях - через 12 ч. Чашки просматриваются в проходящем свете.

Наличие лизиса в виде одного "стерильного" или четко контурированного "мутного" пятна или группы мелких пятен на месте нанесения бактериофагов оценивается как положительный результат.

9.3. Метод диагностических рабочих разведений. Дифференциальный рабочий титр (далее - ДРТ) бактериофага чумного - наибольшее разведение фага, одна капля которого способна образовывать "стерильное пятно" на газоне со штаммами возбудителя чумы и не образовывать со штаммами псевдотуберкулезного микроба.

Для постановки теста берется приготовленный на любой питательной основе 1,5 % агар (pH 7,2). На дне чашки вычерчиваются 8 квадратов в 2 ряда. В пробирку с 4,5 мл расплавленного и остуженного до температуры плюс 45 °C 0,7 % агара добавляется 0,1 - 0,2 мл 18 - 20-ти часовой бульонной культуры испытуемого штамма и после равномерного перемешивания выливается на поверхность агара. После застывания нанесенного слоя агара с культурой по расчерченным квадратам наносится по одной капле (10 - 20 мкл) или одной петле (диаметр 2 мм) чумного бактериофага цельного и в разведениях 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7. После подсыхания капель чашки переворачиваются и инкубируются при температуре плюс 28 °C в течение 18 - 20 ч.

Исследуемая культура относится к возбудителю чумы, если она лизируется цельным бактериофагом Л-413С. Пробы с диагностическими бактериофагами чумным Покровской (отличающимся от бактериофага Л-413С по механизму специфического действия и обладающим меньшей специфичностью) и псевдотуберкулезным ставятся только в том случае, если культура, подозрительная на принадлежность к возбудителю чумы, не лизируется бактериофагом Л-413С.

При использовании бактериофага Покровской исследуемая культура относится к чумному микробу, если она лизируется бактериофагом в ДРТ и выше. Если исследуемая культура лизируется в разведении ниже ДРТ, то вопрос о принадлежности ее к чумному или псевдотуберкулезному микробам решается с помощью других дифференциальных тестов.

Определение ферментации мочевины

10. Способность разлагать мочевину является одним из основных тестов, позволяющих дифференцировать чумной и псевдотуберкулезный микробы. Большинство штаммов возбудителя чумы не проявляют уреазной активности. Штаммы псевдотуберкулезного микроба расщепляют (ферментируют) мочевину. Используются питательные среды для идентификации чумного и псевдотуберкулезного микробов по признаку ферментации углеводов и мочевины (например, среда Кристенсена, среда цветная диагностическая Л.А. Тимофеевой (далее - ЦДС), среда Т.Н. Ленской).

10.1. На скошенную поверхность агара Кристенсена засевается двухсуточная агаровая культура изучаемого штамма и инкубируется при температуре плюс 28 °C. Штаммы возбудителя чумы не изменяют цвета среды. Штаммы псевдотуберкулезного микроба в процессе роста окрашивают среду в розовый или малиновый цвет.

10.2. На ЦДС возбудитель чумы через 24 ч инкубации при температуре плюс 28 °C изменяет исходную темно-зеленую окраску среды до красно-оранжевой (столбик) и сине-зеленой (косячок) вследствие полной или неполной ферментации глюкозы в анаэробных и аэробных условиях, соответственно. Псевдотуберкулезный микроб вызывает изменение окраски как столбика, так и косячка в синий цвет за счет ферментации мочевины.

10.3. По методу Г.Н. Ленской к 100 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида стерильно добавляются 2 % кристаллическая мочевина и 1 % спирто-воводный раствор фенолфталеина. Раствор доводится до кипения, но не подвергается кипячению, чтобы не снижать интенсивность реакции, затем разливается по 4 мл в стерильные пробирки. Легкая опалесценция, наступающая после добавления фенолфталеина, обычно исчезает через несколько часов. Двух-, трех суточная культура, выращенная при температуре плюс 28 °C, растирается петлей непосредственно в пробирке со средой до концентрации 1 - 2 x 10⁹ м.к./мл. Культуры псевдотуберкулезного микроба, обладающие уреазной активностью, окрашивают среду в розовый или малиновый цвет. В пробирках с посевами культур возбудителя чумы цвет среды не меняется (ферментация мочевины отсутствует). Используется только свежеприготовленная среда.

Определение способности синтезировать антиген F1

11. Обнаружение антигена F1 возбудителя чумы проводится:

- в случаях, когда затруднено бактериологическое исследование, а выделение культур чумного микроба маловероятно или невозможно;

- в целях экспресс- и ускоренной диагностики при исследовании нативного материала;

- после накопления возбудителя в организме лабораторных (биопробных) животных и на питательных средах для идентификации выделенной культуры.

Объектами исследования являются трупы и выделения людей, верблюдов, других крупных и мелких животных, грызунов, погадки хищных птиц и фекалии наземных хищников, костные остатки, блохи и другие эктопаразиты, культуры на плотных и жидких питательных средах, заросшие посторонней микрофлорой.

У трупов без признаков загнивания исследуются селезенка и печень, у загнивших - костный мозг, головной мозг. У мумифицированных трупов берутся пробы крупных трубчатых костей и кожи для приготовления суспензии. При наличии кожной язвы, характеризующей кожную форму чумы у больного или трупа, серологическому исследованию подлежит корочки (струп) вокруг язвы. Материал измельчается, экстрагируется в 1 - 2 % растворе формалина на 0,9 % растворе натрия хлорида.

Из погадок хищных птиц при помощи 1 % раствора формалина (лучше на 0,1 М фосфатно-солевом буфере, pH 7,2 - 7,4) готовятся в ступке суспензии костных и кожных остатков. Перед исследованием их можно объединить, дать отстояться, отобрать надосадочную жидкость. Экскременты наземных хищников (ласка, хорь, волк, лисица) заливаются 1 %-м раствором формалина, растираются и оставляются до следующего дня, после чего исследуются. Костные остатки (с определением видовой принадлежности или без такового) исследуются индивидуально или группами по 20 - 25 шт, измельчаются в ступке и заливаются 1 % раствором формалина на 0,9 % растворе натрия хлорида, из расчета 10 частей на 1 часть веса костей.

Культуры возбудителя чумы с плотных питательных сред, заросших посторонней микрофлорой, выдерживаются 24 ч в термостате при температуре плюс 37 °C, затем обеззараживаются добавлением в чашку Петри со средой 3 - 4 мл 2 % раствора формалина. Через 12 ч надосадочная жидкость исследуется на наличие F1. Кроме этого можно приготовить суспензию выросших микроорганизмов в пробирке в 0,9 % растворе натрия хлорида, снимая культуру с разных секторов посева. Затем суспензия обеззараживается добавлением раствора формалина до концентрации 2 %, а через 12 ч исследуется на наличие F1.

Молекулярно-генетический анализ для ускоренной идентификации культур чумного микроба

12. Для подтверждения принадлежности выделенных культур к виду Y. pestis, а также дифференциации авирулентных штаммов возбудителя чумы от вирулентных и выявления маркеров плазмид используются диагностические препараты, зарегистрированные в установленном порядке¹³⁵. Определение видовой принадлежности исследуемых культур проводится на основании амплификации специфичных для Y. pestis генов или их фрагментов: хромосома (например, yihN, 3а), плазмида pFra (например, caFI), плазмида pPst (например, pla). Дифференцирование авирулентных штаммов возбудителя чумы от вирулентных осуществляется на основании выявления генов ybt региона (остров высокой патогенности хромосомной области пигментации), hms локуса (хромосомной области пигментации), плазмиды pCad (например, IcrV). Обеззараживание проб, выделение ДНК, постановка ПЦР или изотермической амплификации, учет результатов реакции проводятся в соответствии с инструкциями к тест-системам.

------------------------------

¹³⁵Пункт 1126 СанПиН 3.3686-21; часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

------------------------------

Дополнительные тесты, применяемые для окончательной идентификации возбудителя чумы

Молекулярно-генетический анализ для внутривидовой дифференциации Y. pestis

13. Для дифференциации штаммов основного и неосновных подвидов используются тест-системы, зарегистрированные в установленном порядке¹³⁶. Обеззараживание проб, выделение ДНК, постановка ПЦР или изотермической амплификации, учет результатов реакции проводятся в соответствии с инструкциями к тест-системам.

------------------------------

¹³⁶Пункт 1126 СанПиН 3.3686-21; часть 4 статьи 38 Федерального закона от 21.11.2011 N 323-ФЗ; постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416.

------------------------------

Для дифференциации подвидов штаммов чумного микроба возможно применение метода мультилокусной ПЦР или изотермической амплификации на основе выявления и определения вариабельности участков генома (например, гены terC, ilvN, inv, AK38_1327). В случае дифференциации биоваров основного подвида методом мультилокусной ПЦР или изотермической амплификации используются хромосомные участки генома (например, гены med24, glpD, pCKF, Phage, Med70).

Ферментация глицерина

14. С помощью признака ферментации глицерина дифференцируются штаммы восточного биовара основного подвида, неспособные ферментировать глицерин от других биоваров основного подвида и от других подвидов возбудителя чумы. Отношение к глицерину изучается на пластинках агара Коля-Белькура или Касаткина. Одна петля 1 - 2 сут испытуемой агаровой культуры (стационарная фаза роста) наносится на агаровую пластинку среды в виде полоски. Среды с посевами инкубируются при температуре плюс 28 °C. Результаты учитываются через 1 - 3 сут. Штаммы возбудителя чумы, циркулирующие в природных очагах, где основными носителями являются сурки, суслики, полевки, пищухи (античного и средневекового биоваров, неосновных подвидов), ферментируют глицерин и растут на агаре Коля-Белькура в виде красной полосы, часто окрашивая и толщу агара вокруг посева. Штаммы, выделяющиеся в очагах, где основными носителями являются крысы (восточного биовара), не ферментируют глицерин и растут на агаре Коля-Белькура в виде серовато-белой полоски. Изучать ферментацию глицерина в жидкой среде не рекомендуется, так как расщепление его в такой среде запаздывает, что может привести к ошибочным выводам.

В среду Касаткина глицерин вносится до 2 % концентрации. На агаровые пластинки высеваются 100 - 200 м.к. 24 - 48-часовой агаровой культуры возбудителя чумы. При ферментации глицерина вырастают красно-оранжевые колонии, при отсутствии - колонии цвета среды.

Ферментация рамнозы

15. Свойство культур чумного микроба разлагать рамнозу используется для определения внутривидовой систематической принадлежности исследуемого штамма. Испытания проводятся с использованием коммерческих биохимических тестов, на среде Гисса с рамнозой, на среде по Безсоновой.

Штаммы Y. pestis основного подвида не ферментируют рамнозу и не изменяют цвет среды, а штаммы неосновных подвидов ферментируют рамнозу и окрашивают среду в красный цвет.

Ферментация арабинозы

16. Испытания проводятся с использованием коммерческих биохимических тестов или на среде Гисса с арабинозой. Штаммы Y. pestis основного подвида и неосновных подвидов, кроме центрально-азиатского, ферментируют арабинозу; штаммы Y. pestis центрально-азиатского подвида не ферментируют арабинозу и не изменяют цвет среды.

Нитрифицирующая и денитрифицирующая способность

17. Нитрифицирующая и денитрифицирующая способность служат критериями дифференциации штаммов средневекового биовара от штаммов античного и восточного биоваров. Способны образовывать нитриты штаммы биоваров antiqua и orientalis, штаммы бивара medievalis нитриты не образуют.

Для испытания нитрифицирующей способности одна петля испытуемой одно- или двухсуточной агаровой культуры засевается в 1 мл бульона Хоттингера или Мартена (pH 7,2), а для выявления денитрифицирующей способности штамма он засевается в 1 мл той же серии бульона, но с добавлением 0,1 % азотнокислого калия (KNO₃). Бульон предварительно проверяется на отсутствие нитритов путем прибавления к 1 мл бульона 0,5 мл реактива Грисса (бульон не должен менять цвет).

В качестве отрицательного контроля используются штаммы чумного микроба средневекового биовара, в качестве положительного - штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ.

Посевы помещаются в термостат при температуре плюс 28 °C и через 3 сут в обе пробирки вносится по 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях сразу появляется окрашивание от розового до малинового цвета, что указывает на наличие в среде нитритов (в первом случае они образовались за счет аммиака, во втором из солей азотной кислоты).

Определение подвижности

18. Определение подвижности возбудителя чумы осуществляется методами: микроскопии - просмотр в препарате "висячая капля"; по Пешкову - посевом культуры в столбик 0,3 % полужидкого агара (Хоттингера, Мартена).

Возбудитель чумы не обладает подвижностью, поэтому растет только по ходу укола петли. Для дифференциации возбудителя чумы от подвижных бактерий возбудителя псевдотуберкулеза, которые диффундируют в питательную среду в виде облачка, культура выращивается при температуре плюс 20 - 22 °C и выдерживается в течение 48 - 72 ч (в отдельных штаммах псевдотуберкулезного микроба активно подвижных клеток может быть мало и необходимо время для их накопления и диффузного распределения в толще агара).

Определение чувствительности к пестицину

19. Определение чувствительности к пестицину (далее - Pst) проводится методом отсроченного антагонизма. На поверхность агаровой пластинки в центре чашки с помощью петли наносится бляшкой одно-двухсуточная культура продуцента пестицина (штамм Y. pestis, имеющий плазмиду пестициногенности) и выращивается в термостате при температуре плюс 28 °C в течение 48 ч. Затем выросшие макроколонии стерилизуются в парах хлороформа (кружки фильтровальной бумаги вкладываются в крышку чашки Петри, на них наносится хлороформ, а чашки помещаются в эксикатор на 2 ч или на ночь). После стерилизации в парах хлороформа фильтровальная бумага удаляется и посевы выдерживаются при комнатной температуре с приоткрытыми крышками чашек до полного исчезновения запаха хлороформа. Затем на поверхность агаровой пластинки выливается 4,5 мл расплавленного и остуженного до температуры плюс 45 °C 0,75 % агара, содержащего 0,5 мл 4-часовой бульонной культуры исследуемого штамма. Посевы инкубируются при температуре плюс 28 °C. Если исследуемый штамм проявляет чувствительность к пестицину, вокруг колонии-продуцента образуется зона задержки роста этого штамма.

Определение признака пигментсорбции

20. Признак пигментсорбции (далее - Pgm) определяется на синтетической среде Джексона-Берроуза с гемином. Культура исследуемого штамма выращивается на агаре при температуре плюс 28 °C в течение 18 - 24 ч. Готовится микробная взвесь в 0,9 % растворе натрия хлорида, содержащая в 1 мл 5 x 10³ м.к., полученная путем последовательных разведений взвеси 1 x 10⁹ м.к. по стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ФСО 3.1.00085 (ОСО 42-28-85) (10 ME)¹³⁷. На синтетическую среду с гемином высевается 0,1 мл подготовленной суспензии (посевная доза 500 КОЕ) и распределяется шпателем по поверхности агара. Посевы инкубируются при температуре плюс 28 °C в течение 5 - 10 сут. В качестве контроля используется штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ (Pgm-).

------------------------------

¹³⁷ Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания.

------------------------------

Вирулентные бактерии чумы вырастают в виде небольших черно-бурых колоний (Pgm+), а бактерии, утратившие вирулентность, образуют более крупные бесцветные колонии (Pgm-).

Признак пигментсорбции можно выявить на обычном агаре Хоттингера, содержащем в качестве красящего вещества конго красный. Рекомендуемыми условиями для проявления пигментсорбции этим методом являются содержание в среде 0,05 мг/мл конго красного и выращивание изолированных колоний в течение 1 - 2 сут при температуре плюс 28 °C с последующим выдерживанием их при температуре плюс 4 °C в течение 2 - 3 сут. Вирулентные бактерии чумы вырастают в виде красных колоний (Pgm+), а бактерии, утратившие вирулентность, образуют бесцветные колонии (Pgm-).

Для определения признака пигментации у штаммов возбудителя чумы разработана цветная дифференциально диагностическая полусинтетическая среда HmsD (локус хранения гемина, англ. hemin storage) (0,75 % Casaminoacids, DifcoLaboratories; 0,15 % сульфита натрия; 1,35 % Difcoagar, DifcoLaboratories, 1 мкг бромида тиамина, 3 мг конго красного, pH 7,2) (далее - среда HmsD). Наличие пигментации определяется, при высеве на поверхность среды HmsD, 0,1 мл взвеси односуточной агаровой культуры исследуемого штамма, содержащей 5 x 10³ м.к./мл, полученной путем последовательных разведений взвеси 1 х 10⁹ м.к. по стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ФСО 3.1.00085 (ОСО 42-28-85) (10 ME)¹³⁸) (посевная доза 500 м.к.). Чашки с посевами выдерживаются в термостате при температуре плюс 28 °C в течение 2 сут. Через 2 сут большинство штаммов Y. pestis вырастают в виде пигментированных колоний розового цвета (разной интенсивности в зависимости от подвидовой принадлежности штамма) и непигментированных бесцветных колоний. Штаммы некоторых подвидов Y. pestis (улегейский подвид) вырастают на 3-и сутки.

------------------------------

¹³⁸ Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания.

------------------------------

В качестве отрицательного контроля используется штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ (Pgm-) в качестве положительного - штамм возбудителя чумы, обладающий признаком пигментсорбции (Pgm+).

Зависимость роста от ионов кальция при температуре плюс 37 °C

21. Для исследования культура испытуемого штамма выращивается в течение 18 - 24 ч при температуре плюс 28 °C. Из выросшей культуры готовятся взвеси в 0,9 % растворе натрия хлорида, содержащие 1 x 10³, 1 х 10⁴ и 5 х 10⁵ м.к./мл. Из каждого разведения по 0,1 мл высевается на чашки Петри с агаром Хигучи-Смита (магниево-оксалатный агар), посевы инкубируются при температуре плюс 37 °C. Через 48 ч проводится подсчет выросших колоний, развивающихся из авирулентных клеток (кальций-независимые). Дальнейшее их выращивание осуществляется при температуре плюс 28 °C. Через 24 ч проводится учет выросших кальций-зависимых колоний, развивающихся из клеток, стойко сохраняющих вирулентные свойства.

В качестве положительного контроля на агаровые пластинки с 5 % нативной крови высеваются такие же дозы (1 х 10², 1 х 10³ и 5 х 10⁴ м.к. в 0,1 мл) штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, в качестве отрицательного контроля - штамм чумного микроба, у которого отсутствует признак кальций-зависимости.

Определение пестициногенной активности

22. Для определения пестициногенности поверхность чашки с агаром делится на несколько секторов и в центре каждого из них делается посев 1 - 2-суточной агаровой культуры исследуемых штаммов таким образом, чтобы получить бляшку диаметром 0,5 см. Для положительного контроля на один из секторов засевается заведомо пестициногенный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ.

Посевы инкубируются при температуре плюс 28 °C в течение 48 ч. Затем выросшие "макроколонии" стерилизуются в парах хлороформа (кружки фильтровальной бумаги вкладываются в крышку чашки Петри, на нее наносится хлороформ, чашки помещаются в эксикатор на 2 ч или на ночь). После стерилизации фильтровальная бумага удаляется, посевы выдерживаются при комнатной температуре с приоткрытыми крышками чашек до исчезновения запаха хлороформа. Затем на поверхность агаровой пластинки выливается 4,5 мл расплавленного и остуженного до температуры 45 °C 0,75 % агара, содержащего 0,5 мл 4-часовой бульонной культуры индикаторного штамма. В качестве индикаторных штаммов используются культуры псевдотуберкулезного микроба I серотипа или штамм возбудителя чумы кавказского подвида. Посевы инкубируются при температуре плюс 37 °C. Учет результатов осуществляется через 24 и 48 ч.

Положительный результат - способность образовывать пестицин - отмечается в том случае, если "макроколонии" исследуемых культур окружены зоной полного или частичного торможения роста индикаторного штамма. Культуры, не обладающие пестициногенной активностью, не подавляют рост штамма-индикатора. Для определения пестициногенности штаммов применяются агар Хоттингера (pH 7,2) с 1 % сухого пептона или агар LB.

Определение фибринолитической активности

23. Определение фибринолитической активности возбудителя чумы проводится с использованием плазмы крови, для чего плазма цитратная кроличья разводится 0,9 % раствором натрия хлорида до разведений 1:8 или 1:10 и разливается по 0,5 мл в пробирки. Затем готовятся взвеси бактерий из односуточных культур, содержащих по 1 х 10⁹ м.к./мл. По 0,25 мл взвеси исследуемого штамма вносится в пробирку с плазмой, перемешивается и добавляется 0,1 мл 0,5 % стерильного раствора кальция хлорида.

В качестве контролей используются 0,5 мл плазмы в таком же разведении, 0,25 мл 0,9 % раствора натрия хлорида и 0,1 мл 0,5 % раствора кальция хлорида; 0,5 мл плазмы, 0,25 мл миллиардной взвеси 1 - 2-суточной агаровой культуры штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ и 0,1 мл 0,5 % стерильного раствора кальция хлористого (для контроля свертывания плазмы). Посевы инкубируются при температуре плюс 37 °C. Через 40 - 60 мин после помещения в термостат проверяется образование сгустка. Если за 60 мин сгусток не образовался, реакция повторяется.

Учет результатов производится через 18 - 20 ч и оценивается следующим образом: 4+ - полное растворение сгустка; 3+ - почти полное растворение сгустка, на поверхности плазмы очень маленькая пленка; 2+ - небольшой сгусток плавает в большом количестве плазмы; 1+ - очень небольшое количество жидкой плазмы при хорошо сформированном сгустке, минус - сгусток без жидкой плазмы.

23.1. При необходимости дать количественную характеристику фибринолитической активности штамма готовятся взвеси, содержащие различные концентрации микробных клеток (1 x 10⁹ - 1 х 10⁴), и 0,25 мл каждого разведения вносится в пробирки с плазмой. Остальные манипуляции осуществляются как описано выше. Так как не каждая порция плазмы в разведении 1:10 пригодна для реакции фибринолиза, перед опытом она оттитровывается в разведениях 1:4, 1:6, 1:8 и 1:10 с культурой штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ и выбирается разведение, дающее полное растворение сгустка фибрина. Методика работы такая же, как в опыте.

23.2. Признак фибринолитической активности может быть определен на специально сконструированной плотной питательной среде. Растворы препаратов фибриногена и тромбина готовятся ex tempore. Для этого содержимое флакона с препаратом фибриногена растворяется в дистиллированной воде до концентрации 10 мг/мл. Препарат тромбина также растворяется в дистиллированной воде так, чтобы в 1 мл раствора содержалось 50 ед. тромбина. При необходимости растворы фибриногена и тромбина можно хранить 2 - 3 сут при температуре плюс 4 °C.

Приготовленные растворы последовательно вносятся в 100 мл расплавленного и остуженного до температуры плюс 45 °C 1,2 % агара Хоттингера (pH 7,2): добавляется 20 мл матричного раствора фибриногена, перемешивается, затем вносится 1,0 мл раствора тромбина. Содержимое флакона аккуратно перемешивается и разливается по 25 - 30 мл в чашки Петри.

Все манипуляции необходимо осуществлять предельно быстро, особенно после добавления раствора тромбина, так как реакция превращения фибриногена в фибрин под воздействием тромбина происходит интенсивно. Правильное приготовление среды позволяет получить слегка мутные с беловатым оттенком пластинки агара, содержащие фибрин.

На среду с фибрином высев разведений микробной взвеси производится с таким расчетом, чтобы выросли изолированные колонии. Для этого на агаровую пластинку наносится 0,1 мл взвеси, содержащей 100 - 1000 м.к., которая затем шпателем распределяется по всей поверхности. Посевы инкубируются в течение 48 ч при температуре плюс 28 °C, а затем еще 24 ч при температуре плюс 37 °C, для более четкого проявления признака фибринолитической активности.

На 2 - 3 сутки инкубации вокруг колоний, обладающих фибринолитической активностью, за счет лизиса фибрина формируются четкие прозрачные зоны, которые легко определяются в проходящем свете.

Определение плазмокоагулирующей способности

24. Для определения плазмокоагулирующей способности цельная цитратная кроличья плазма разливается по 0,5 мл в пробирки и затем в каждую из них засевается полная петля диаметром 1 мм 1 - 2-суточной культуры исследуемых штаммов. В качестве контролей используются: 0,5 мл плазмы и петля агаровой культуры штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ; 0,5 мл плазмы без каких-либо добавлений. Посевы инкубируются при температуре плюс 28 °C.

Учет результатов производится через каждый час после начала инкубации, начиная с просмотра контрольных пробирок: плазма без культуры должна быть жидкой, а в пробирке с культурой штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ через 1 - 2 ч образуется сгусток. Как правило, через 2 ч инкубации большинство исследованных культур дают положительные результаты.

Если через 2 - 3 ч сгусток не образовался, наблюдение продолжается до срока образования полного или частичного сгустка и далее до уменьшения в размерах сформировавшегося сгустка, свидетельствующего о начале фибринолиза. Полное его растворение может быть зарегистрировано не позднее, чем через 24 ч. Если в течение 24 ч наблюдения (через каждый час) сгусток сформировался, проба на плазмокоагулазную активность считается отрицательной.

Результаты оцениваются следующим образом: 4+ - образование плотного сгустка, заполняющего всю пробирку и с трудом отделяющегося от стенок пробирки; 3+ - образование довольно плотного сгустка, легко отделяющегося от стенок пробирки, и небольшое количество жидкости; 2+ - хорошо сформированный сгусток и небольшое количество жидкости в пробирке; 1+ - небольшой сгусток, плавающий в плазме; - еле заметная пленка; минус - наличие жидкой плазмы в пробирке.

24.1. Можно заменить плазму крови на очищенный препарат фибриногена (исключается влияние неспецифических для данной реакции факторов свертывающей и антисвертывающей системы крови, уменьшается время проведения реакции). Использование тромбина в сомнительных случаях, или если образование сгустка экспериментатором пропущено, исключает неправильное толкование реакции.

Для определения плазмокоагулазной активности раствор препарата фибриногена готовится с соблюдением правил асептики. Содержимое флакона с препаратом фибриногена растворяется в 0,9 % растворе натрия хлорида до концентрации 10 мг/мл. Этот раствор можно использовать для реакции в течение 6 - 8 дней при условии его хранения при температуре плюс 4 °C.

Приготовленный раствор стерильно разливается в пробирки по 0,5 мл. Культура, исследуемая на плазмокоагулазную активность, выращивается на плотной питательной среде при температуре плюс 28 °C в течение 48 ч. Для постановки опыта одна полная петля культуры тщательно суспендируется в 0,5 мл раствора фибриногена. В качестве контроля используются: 0,5 мл раствора фибриногена с полной петлей контрольной культуры; 0,5 мл раствора фибриногена без добавлений.

Суспензии с исследуемыми культурами инкубируются при температуре плюс 28 °C, наблюдение за реакцией начинается через час после начала инкубации. Образование плотного сгустка свидетельствует о положительной реакции на плазмокоагулазную активность. Обычно образование сгустка заканчивается через 2 ч. Если культура обладает сниженной плазмокоагулазной активностью и за 3 - 4 ч инкубации сгусток не образовался, то инкубация продолжается в течение 18 ч. Если по истечении 18 ч инкубации в опытных пробирках сгусток отсутствует, реакцию контролируют добавлением в пробирку 1 - 2 капель раствора тромбина (50 ед./мл).

Учет реакции: если исследуемая культура не обладает плазмокоагулирующей активностью, то после добавления в пробирку тромбина образуется плотный сгусток; если исследуемая культура обладает плазмокоагулирующей активностью, но образование сгустка пропущено, то после добавления в пробирку тромбина сгусток не образуется.

Результаты оцениваются так, как описано выше. Способностью синтезировать пестицин I, растворять фибрин крови млекопитающих и коагулировать плазму обладает большинство штаммов чумного микроба (за исключением штаммов кавказского подвида).

Фрагментное и полногеномное секвенирование штаммов Y. pestis

25. Фрагментное секвенирование участков генома штаммов Y. pestis проводится методом секвенирования по Сенгеру с использованием генетического анализатора ABI PRISM 3500XL (Applied Biosystems, США) или его аналогов в соответствии с инструкциями производителя.

Для определения полногеномной нуклеотидной последовательности штаммов применяется метод высокопроизводительного секвенирования с использованием систем: MiSeq (Illumina), NextSeq 550 (Illumina), Minion (ONT), или их аналогов в соответствии с инструкциями производителя.

Мультилокусный VNTR анализ (MLVA25)

26. Для определения принадлежности штаммов к географическому региону или природному очагу используется метод мультилокусного анализа вариабельного числа тандемных повторов (англ. Multiple locus variable number of tandem repeats analysis, MLVA).

Для получения последовательностей локусов, содержащих VNTR, используются олигонуклеотидные праймеры [25]. Последовательности этих локусов определяются при помощи фрагментного секвенирования полученных в ПЦР амплификатов данных локусов. Поиск VNTR локусов также осуществляется в полногеномных последовательностях штаммов с использованием праймеров, фланкирующих участки VNTR. Для построения дендрограмм применяются файлы формата FASTA в программе PhyML 3. из пакета программ SeaView 5.05¹³⁹.

------------------------------

¹³⁹ https://doua.prabi.fr/software/seaview (в свободном доступе).

------------------------------

Открыть документ в системе ГАРАНТ

Открыть в бесплатной Интернет-версии Открыть в Интернет-версии (только для пользователей системы ГАРАНТ)

<< Приложение 13. Направление на исследование клинического материала		Приложение 15. >> Постановка биологической пробы
	Содержание Методические указания МУ 3.1/4.2.4065-24 "Эпидемиологический надзор в природных очагах чумы на территории Российской Федерации:...