Приложение 4. Получение достоверных результатов и воспроизводимых методик подготовки штаммов микроорганизмов для исследования

Приложение 4
к МУ 4.2.4071-24

Получение достоверных результатов и воспроизводимых методик подготовки штаммов микроорганизмов для исследования

1. Получение достоверных и воспроизводимых микробиологических результатов исследования зависит от следующих факторов [12, 13]:

- техническое выполнение лабораторной работы непосредственно зависит от предшествующего обучения, специализации, личного опыта и условий работы;

- оптимальные факторы окружающей среды - приспособленное для лабораторной работы помещение, рациональное освещение (300 - 500 лк) или эффективная вентиляция (1 - 2 м/с), оптимальная температура (плюс 18 - 20 °C), уровень шума 40 дБ;

- методы и время отбора проб для исследования, подготовка образца к исследованию;

- качество реагентов, химикатов, лабораторной посуды, тест-штаммов, искусственных питательных сред и лабораторных животных - все это влияет на достоверность результатов исследования;

- ключевым аспектом получения достоверных результатов и воспроизводимости микробиологического анализа является высокое и стабильное качество питательных сред. Для статистически достоверного результата в качестве итогового количества колоний рекомендуется использовать среднее значение КОЕ на трех чашках Петри, количество КОЕ на которых не должно превышать 250 ³¹.

------------------------------

³¹ГОСТ Р 70393-2022 "Изделия медицинские для диагностики in vitro. Приготовление, производство, хранение и испытания питательных сред", введенный приказом Росстандарта от 13.10.2022 N 1132-ст; ГОСТ ISO 11133-2016 "Приготовление, производство, хранение и определение рабочих характеристик питательных сред", введенный приказом Росстандарта от 07.11.2016 N 1605-ст.

------------------------------

2. Методика приготовления взвеси и количественный учет штаммов биотехнологических микроорганизмов для исследований.

При проведении санитарно-гигиенических исследований штаммов микроорганизмов необходимо использовать свежую культуру микроорганизма, выращенную до стадии, которая, согласно техническим условиям (ТУ) и техническому регламенту конкретного производства, попадает в воздух производственной и окружающей среды.

Селективные питательные среды, используемые для выращивания и получения синтеза максимального количества целевого продукта, подбираются владельцем штамма (биопрепарата) и предоставляются в необходимом количестве исполнителям, которые будут проводить санитарно-гигиенические исследования.

Оптимальные (селективные) питательные среды изложены в паспорте изучаемого биотехнологического микроорганизма, который предоставляет депонирующая организация.

При приготовлении взвеси культуры микроорганизма, выращенного на плотной селективной среде, производят смыв с поверхности и дезинтегрируют. Определяют оптическую плотность полученной микробной суспензии, после чего ее раститровывают последовательными десятикратными разведениями физиологическим раствором до предполагаемой концентрации 100 - 1000 клеток в 1 мл.

Из 2 - 3 последних разведений производят высев по 0,1 мл каждого разведения на 3 чашки Петри. По истечении рекомендованных в соответствии с указаниями в паспорте штамма сроков термостатирования (время и температура) по числу выросших колоний штамма (учету подлежат чашки с ростом от 10 до 250 колоний) рассчитывается концентрация КОЕ в "исходной" суспензии по формуле (8):

;

(8)

где: С - число живых микроорганизмов в 1 мл "исходной" взвеси

К - кратность разведения высеваемой микробной взвеси;

V - объем единичной посевной дозы (в мл);

N - среднее число колоний в серии единичных высевов одинаковых разведений культуры;

Т - общее число колоний, найденных во всех высевах данного разведения;

n - число высевов одинаковых разведений на чашки с плотной питательной средой.

Для определения концентрации в суспензии дрожжевых клеток, спор бактерий и грибов можно использовать камеру Горяева или другие счетные камеры.

Для учета жизнеспособных клеток взвесь микроорганизмов разводят 1:1 краской следующего состава: 0,1 % раствор эозина, приготовленный на 1,7 % растворе хлорида натрия, смешивают в соотношении 1:1 с 0,1 % раствором трипанового синего, приготовленным на дистиллированной воде.

Приготовленной таким образом взвесью заполняют счетную камеру и в соответствии с инструкцией для используемой камеры ведут подсчет клеток, отдельно учитывая число окрашенных (мертвых) клеток. Определяют процент живых клеток. Учитывая двойное разведение суспензии при окрашивании, в числитель соответствующей формулы для расчета количества клеток вводится коэффициент 2.

3. Приготовление отмытых эритроцитов для определения гемолизинов.

Эритроциты человека отмывают с помощью центрифугирования при 2500 об/мин в физиологическом растворе с 0,005 М ацетата кальция до получения прозрачной надосадочной жидкости. Затем эритроциты разводят физиологическим раствором с 0,005 М ацетата кальция в соотношении 1:20.

4. Приготовление экстракта пупочных канатиков.

Пупочные канатики разрезают по ходу кровеносных сосудов и отмывают в дистиллированной воде. Отмытые пупочные канатики помешают на 4 ч в ацетон для их обезвоживания, просушивают и измельчают.

К 500 г измельченных пупочных канатиков, помещенных в колбу с притертой пробкой, добавляют 1000 мл стерильной дистиллированной воды и 15,0 мл хлороформа ³². Смесь тщательно перемешивают при энергичном встряхивании и сутки выдерживают при температуре плюс 4 °C.

------------------------------

³²Примечание: хлороформ (триметилметан) 2 класс опасности, ПДК _рз, 10/5 мг/м ³, ПДК _ав 0,1/0,003 мг/м ³, обладает раздражающим действием. При работе с реактивом рекомендуется использовать вытяжной шкаф, а также средства защиты глаз и кожи.

------------------------------

Затем производят отжимание кашицы через стерильное полотенце. Остаток кашицы на полотенце промывают 1000 мл дистиллированной воды и полученную жидкость центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин.

Прозрачную вязкую жидкость, полученную после центрифугирования, доводят до рН=9,0, к ней добавляют 15,0 мл хлороформа и в опыт берут образцы препарата, обладающие большей вязкостью, которые при разведении в 4 раза еще дают муциновый сгусток при добавлении 2 - 3 капель 2 % раствора уксусной кислоты.

Приготовленный таким образом экстракт пупочных канатиков сохраняется в холодильнике не более 4-х недель.

5. Приготовление лецитовителлина для определения лецитиназы.

Куриное яйцо отмывают щеткой с мылом, обрабатывают спиртом, стерильным скальпелем раскалывают скорлупу и содержимое выливают в стерильную чашку Петри.

В стерильных условиях 10 мл желтка с помощью пипетки смешивают с 190 мл физиологического раствора, содержащего 0,005 М ацетата кальция, и прогревают при температуре плюс 56 °C в течение 30 мин. Эмульсию желтка фильтруют через стерильный бумажный фильтр до получения прозрачной, слегка опалесцирующей жидкости. Готовый препарат хранят в холодильнике не более 2-х недель.