Приложение 2. Лабораторная диагностика гонореи и трихомониаза (Методические указания)

Приложение 2

к приказу Минздрава СССР

от 4 декабря 1986 г. N 1570

Лабораторная диагностика гонореи и трихомониаза
(Методические указания) *(4)

Лабораторные исследования для диагностики гонореи и трихомониаза имеют особое значение, так как установление этиологического диагноза возможно только при обнаружении возбудителя заболевания в отделяемом пораженных очагов, как методом микроскопии, так и культуральным методом.

Для расширения бактериологической диагностики гонореи и трихомониаза и более полного выявления хронических и торпидно протекающих форм этих заболеваний приказом Министерства здравоохранения СССР N 575 от 20.06.77 г. предусмотрена организация централизованных бактериологических лабораторий для диагностики гонореи и трихомониаза на правах отделения в составе республиканских, краевых, областных, городских (в городах с населением 300 тыс. человек и выше) кожно-венерологических диспансеров.

Лабораторная диагностика гонореи

Общепринятыми для обнаружения гонококка являются бактериоскопический и бактериологический методы исследования, причем первый используют значительно чаще. Серологический метод (реакция Борде-Жангу) имеет вспомогательное значение.

Бактериоскопический метод исследования

Перед окраской метиленовым синим и по способу Грама мазки фиксируют 96° этиловым спиртом в течение 3 минут, высушивают.

Окраску мазков 1% водным раствором метиленового синего производят в течение 1 минуты, затем высушивают.

Окраска мазков метиленовым синим может сочетаться с предварительной их окраской 1% раствором эозина на 63° спирте в течение 15 секунд, после чего, перед окраской метиленовым синим, осуществляют промывку препаратов. Эта окраска дает возможность не фиксировать мазки и выявлять в них эозинофилы, наличие которых у девочек указывает на необходимость тщательного обследования их на гельминты.

При отсутствии метиленового синего возможно использование для окраски мазков 0,5% водного раствора бриллиантового зеленого, которым фиксированные мазки окрашивают в течение 1 минуты. При изготовлении раствора указанного красителя следует пользоваться порошком, растворяя его в кипящей дистиллированной воде.

Для окраски по способу Грама требуется: 1) 1% водный раствор кристаллвиолета (краску растворяют в кипящей дистиллированной воде, горячий раствор фильтруют через бумажный фильтр); 2) раствор Люголя (2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды, после чего в этот раствор добавляют 1 г чистого йода и фильтруют через бумажный фильтр); 3) 96° этиловый спирт; 4) 1% водный раствор нейтрального красного (краситель растворяют в дистиллированной воде, раствор фильтруют через бумажный фильтр).

Методика окраски заключается в следующем. Фиксированный, высушенный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, на которую наливают 1% раствор кристаллвиолета на 1 минуту. Бумагу снимают, мазок промывают водопроводной водой и заливают раствором Люголя, который выдерживают несколько секунд до почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают, мазок промывают водой и приступают к обесцвечиванию, которое проводят под контролем глаза, каждый раз погружая, вынимая и вновь погружая мазок в стакан с 96° этиловым спиртом; мазок обесцвечивают до тех пор, пока с более тонких участков перестанут стекать фиолетовые струйки спирта и участки мазка в этом месте станут бледно-серого цвета. Препарат быстро и тщательно промывают водопроводной водой и докрашивают 1% водным раствором нейтрального красного в течение 3 минут, после чего его вновь промывают водопроводной водой и высушивают.

При отсутствии нейтрального красного при окраске мазков по способу Грама может быть использован 1% водный раствор сафронина, которым окрашивают мазок в течение 1 минуты.

Мазки, окрашенные эозином и метиленовым синим или одним метиленовым синим, нужно использовать для изучения морфологии и расположения диплококков, в то время как окончательный лабораторный диагноз гонореи ставится на основании мазков, окрашенных по способу Грама. Иначе возможны ошибки, т. к. стафилококки и стрептококки могут также располагаться внутриклеточно и напоминать собою гонококки. Форма, расположение и окраска диплококков по способу Грама дают возможность различать их между собой.

Однако при идентификации гонококков способ Грама является ценным только в том случае, если им правильно пользоваться, т. к. неправильная окраска не только затрудняет диагностику, но и приводит к большому числу ошибок. При правильной окраске по способу Грама ядра клеточных элементов (лейкоцитов, эпителиальных клеток) должны частично удерживать основную фиолетовую краску (критерий правильности окраски), т.е. в центре они должны быть окрашены в фиолетовый цвет, а по периферии в оранжево-красный, а гонококки, расположенные в лейкоцитах и на эпителиальных клетках, обесцвеченные таким образом и окрашенные дополнительной краской, будут оранжево-красные. Высокое качество окраски обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания мазков. При недообесцвечивании мазков, когда в фиолетовый цвет интенсивно окрашены ядра клеток, гонококки часто сохраняют фиолетовую окраску и могут быть приняты за другие микроорганизмы. В переобесцвеченных мазках стафилококки и стрептококки могут быть окрашены как и ядра клеток в оранжево-красный цвет и приняты за гонококки.

При производстве бактериоскопического исследования врач-лаборант должен оценивать правильность окраски мазков по способу Грама и диагностировать гонорею только по правильно окрашенным участкам мазка. Качество окраски мазков в значительной степени зависит и от их приготовления: материал в мазках из уретры, цервикального канала и ректум на одном стекле должен быть расположен равномерным, тонким слоем, но в то же время содержать достаточно материала для исследования.

При неудачной окраске по способу Грама другой мазок, окрашенный метиленовым синим или бриллиантовым зеленым, после его исследования нужно перекрасить по способу Грама. Для этого фильтровальной бумагой с него снимают иммерсионное масло, несколько раз погружают в 96° этиловый спирт для полного удаления масла, а затем красят как неокрашенный.

Если мазок недообесцвечен, его повторно обесцвечивают и докрашивают нейтральным красным как описано ранее.

Врач-лаборант, исследующий мазки, указывает количество форменных элементов и слизи, пользуясь следующими обозначениями: большое, умеренное, незначительное, скудное количество, единичные клетки; количество лейкоцитов можно обозначать цифрами (0-3, 5-10, 15-20 и т.д., покрывают все поле зрения): гонококки - обнаружены, не обнаружены. Кроме наличия или отсутствия гонококков следует отмечать и другую бактериальную флору, указывая ее отношение к окраске по способу Грама. Там, где это возможно, на основании морфологических особенностей микроорганизмов, надо давать более точное определение обнаруженных микроорганизмов: стрептококки, стафилококки, вагинальная, ложнодифтерийная палочки и т.п. Необходимо также обращать внимание на присутствие в мазках влагалищной трихомонады и грибов рода кандида.

Идентификация гонококка производится на основании его свойств: морфологии, расположения и отношения к окраске по способу Грама.

Гонококк - это парный кокк, имеющий форму кофейного зерна; кокки обращены друг к другу своей вогнутой стороной. Размножаясь делением в разных плоскостях, гонококки не образуют цепочек. Внутри лейкоцитов они располагаются парами или группами так, что одни диплококки лежат по отношению к другим под различными углами. Внеклеточное расположение гонококков также имеет свои характерные особенности. Часто гонококки лежат на клетках плоского эпителия в большом количестве рядами с расположением диплококков под углом или перпендикулярно друг к другу внутри ряда. Частота внутри- и внеклеточного расположения гонококков зависит как от периода заболевания, так и от методики взятия материала.

Основным дифференциальным признаком является отношение гонококка к окраске по способу Грама. Гонококки грамотрицательны, т.е. они легко обесцвечиваются спиртом и окрашиваются дополнительной краской.

Положительный ответ на гонококки можно давать только на основании выявления типичных форм их в мазках, окрашенных метиленовым синим (бриллиантовым зеленым) и по Граму.

Нередко в мазках можно обнаружить гонококки, измененные морфологически и тинкториально. Однако при некоторой настойчивости обычно можно найти единичные группы гонококков, хорошо сохранившие свои основные свойства. Лишь в тех случаях, когда это не удается и встречаются не вполне типичные, сходные с гонококками диплококки, или внеклеточные грамотрицательные диплококки, следует давать описательный ответ, рекомендуя повторное взятие материала и бактериологическое исследование.

При свежей остро протекающей гонорее правильно проведенное бактериоскопическое исследование обычно достаточно для окончательного заключения. При хронической и свежей торпидно текущей гонорее бактериоскопический метод также нередко позволяет обнаружить гонококки, в противном случае прибегают к повторным исследованиям или к бактериологическому методу.

Бактериологический метод исследования.

Способы забора материала для бактериологического исследования

Организационно забор материала для бактериологического исследования при диагностике гонореи может производиться четырьмя способами.

1. Забор материала непосредственно в бактериологической лаборатории, где предусматриваются помещения для больных, их регистрации и взятия у них патологического материала, а также необходимое оборудование и инструментарий (гинекологические кресла, зеркала, ложки Фолькмана, ушные ложки, гинекологические пинцеты и др.). Данный способ является оптимальным. Взятие материала производит специально обученный средний медицинский персонал.

2. Забор материала в кабинете врача, принимающего больного. В этом случае в кабинете необходимо иметь термостат, поддерживающий температуру 36,0-36,5° и эксикатор. Взятие материала и посев его на предварительно прогретую в термостате питательную среду производит лечащий врач, который в последующем все засеянные питательные среды помещает в эксикатор, а последний в термостат. В эксикаторе создают повышенное содержание CO2. Питательные среды с посевным материалом выдерживают в термостате 24 часа, а затем доставляют в бактериологическую лабораторию для изучения и исследования, по возможности создав при этом термостатные условия, особенно в холодное время года. Данный способ приемлем.

3. Забор материала и посев его на питательную среду непосредственно в кабинете лечащего врача и последующая доставка его в бактериологическую лабораторию в ближайшие часы в специально переносном термостате. Взятие материала и посев производит врач, принимающий больного, он же контролирует доставку посевного материала в лабораторию. Посевной материал должен быть доставлен в лабораторию не позже 6 часов с момента посева. Данный способ возможен, но не желательный.

4. Забор материала непосредственно в кабинете лечащего врача в среду сохранения (транспортировки). Материал забирает врач, принимающий больного, специально подготовленным для этого стерильным тампоном, помещает последний в стерильную пробирку со средой сохранения, закрывает резиновым колпачком и помещает в холодильник при 4° для хранения до окончания забора материала у больных, которым планировалось в этот день бактериологическое исследование, после чего посевной материал отправляется в бактериологическую лабораторию не позже 24 часов с момента взятия материала. Данный способ можно применять при пересылке материала с отдаленных территорий.

Посев от каждого больного должен сопровождаться одновременно приготовлением двух мазков из того же очага, откуда сделан посев.

Показания к бактериологическому исследованию

Бактериологическое исследование для диагностики гонореи должно проводиться: 1) у всех мужчин, женщин и детей, обращающихся к врачам по поводу воспалительных заболеваний мочеполовых органов, а также у всех половых контактов или предполагаемых источников заражения гонореей, у которых при микроскопическом исследовании мазков до и после провокаций гонококки не обнаружены (не менее 4 мазков), но имеются клинические, анамнестические или эпидемиологические подозрения на гонорею; 2) у детей для подтверждения гонорейного заболевания, при обнаружении гонококков бактериоскопическим методом исследования (посев, выделение чистой культуры, определение ее ферментативных свойств); 3) у больных гонореей после окончания лечения (не ранее чем через 8-10 дней) и при снятии их с учета; 4) у больных трихомониазом и другими негонококковыми заболеваниями после проведенного лечения (при наличии показаний); 5) у больных, у которых при бактериоскопическом исследовании обнаружены измененные микроорганизмы, подозрительные на гонококки; 6) при необходимости определения чувствительности гонококка к антибиотикам, его сахаролитических свойств или продуцирования им беталактамазы; 7) по требованию следственных органов и судебной экспертизы.

Мазки из патологического материала и культур, в которых обнаружены гонококки, должны сохраняться в лаборатории в течение 3-х месяцев.

Питательные среды для выращивания гонококков

Эффективность бактериологического метода исследования в значительной степени определяется качеством питательных сред. В нашей стране наиболее широко апробированы и используются два вида питательных сред: асцит-агар и безасцитные питательные среды.

Основой обеих сред является мясопентонный агар (МПА) из мяса кроликов или свежих бычьих сердец. Методика его приготовления заключается в следующем. Мясо кролика освобождают от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку или измельчают ножом, взвешивают, заливают двойным объемом водопроводной воды и в таком виде оставляют в холодильнике при 4° на сутки для экстрагирования. Затем массу нагревают до кипения, кипятят 10 минут, охлаждают и фильтруют через марлю. К фильтрату добавляют 2% агар-агара, 1% пептона и 0,5% хлорида натрия, нагревают до растворения агар-агара и устанавливают рН=7,5-7,6 (подщелачивание производят 20% раствором едкого натрия). Среду доводят до кипения, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по стерильным флаконам или колбам и стерилизуют в автоклаве 15-20 минут при 0,5 атмосферы по манометру (112°).

Техника приготовления МПА из свежих бычьих сердец та же, только кипячение массы измельченных сердец в воде следует производить 20 минут вместо 10.

Возможно приготовление основы питательной среды без пептона. При этом пользуются вышеизложенной методикой приготовления МПД, но исключают из его состава пептон, измельченное мясо кролика кипятят 5 минут вместо 10 и стерилизуют среду в автоклаве в течение 10 минут при 0,8 атмосферы по манометру (117°).

Асцит-агар

Асцитическая жидкость должна быть получена от больных с асцитом, причиной которого является сердечная недостаточность, и не должна содержать желчных пигментов. Забор асцитической жидкости производят через троакар в стерильную бутыль и добавляют к ней 5% хлороформа для наркоза. В течение 10 дней жидкость перемешивают с хлороформом путем вращения бутыли, затем ее оставляют при комнатной температуре до полного оседания хлороформа на дно бутыли и просветления жидкости. После этого по мере надобности прозрачную асцитическую жидкость разливают по 50 мл в стерильные колбы с ватными пробками и ежедневно в течение 3 дней их помещают в водяную баню при температуре 56° на 1 час для испарения хлороформа через ватную пробку. После проверки асцитической жидкости на стерильность она может быть использована для обогащения питательной среды для выделения гонококка в концентрации 1/3 и 1/4 объема среды, что определяют опытным путем.

Рецепты безасцитных питательных сред

1. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН=7,4-7,5) - 100 мл, гидролизат казеина для парентерального белкового питания - 2 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл (среда КДС-1).

2. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН=7,4-7,5) - 100 мл, 5% раствор гемогидролизата - 2 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл (среда ГДС-2).

3. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН=7,4-7,5) - 100 мл, среда 199 для культур тканей без антибиотиков - 20 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл (среда 199-СДС).

4. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН=7,4-7,5) - 100 мл, желток свежего куриного яйца - 10 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл (среда ЖС).

Яичный желток получают стерильно из диетических куриных яиц непосредственно перед приготовлением среды. Для этого, предварительно обработав спиртом, скорлупу вскрывают стерильным пинцетом и содержимое яйца выливают в стерильную воронку. После того как белок вытечет, оставшийся в воронке желток переносят в стерильную посуду и мерной пипеткой берут необходимый для изготовления питательной среды объем желтка.

Приготовление дрожжевого аутолизата заключается в следующем. Пекарские дрожжи измельчают и закладывают в бутыль, превышающую по объему взятые дрожжи в 4 - 5 раз, и оставляют для аутолиза на двое суток в сушильном шкафу или термостате при 60°. Затем густую коричневую массу разбавляют тройным объемом теплой водопроводной воды, хорошо перемешивают и дважды центрифугируют по 10 минут при 1000 оборотов в минуту (до просветления жидкости). Надосадочную жидкость сливают, добавляют к ней 0,5% хлористого натрия, доводят рН до 7,4-7,5 и автоклавируют 30 минут при 1 атмосфере по манометру (120°). Хранят в мелкой расфасовке в холодильнике при 4°.

Дрожжевой аутолизат может быть заменен 1,5% раствором экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) в том же количестве (2 мл) 1,5% раствор ЭКД готовят в лаборатории из сухого ЭКД, растворяя его в стерильной дистиллированной воде. Приготовленный таким образом жидкий экстракт разливают по стерильным пробиркам и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атмосферы по манометру в течение 20 минут.

Во всех вышеуказанных питательных средах сыворотка крови крупного рогатого скота может быть заменена нормальной нативной сывороткой для бактериологических питательных сред, которая является той же самой сывороткой, но с добавлением консерванта.

Приготовление обогащенной среды

МПА, находящийся во флаконе или колбе, растапливают в водяной бане, охлаждают до 56-58° и добавляют к нему ингредиенты в соотношениях, указанных ранее в рецептах. Обогащенный МПА по 3-3,5 мл разливают в стерильные пробирки, среду скашивают и увлажняют 0,5 мл стерильного мясопептонного бульона или изотонического раствора хлорида натрия после того, как она застынет. Для проверки на стерильность среду помещают в термостат при 35-37° на сутки.

Все вышеуказанные безасцитные среды, кроме яичной, прозрачны, на них легко дифференцировать колонии микроорганизмов. Среда, обогащенная яйцом, отличается мутностью, она желтая, выросшие на ней колонии, в частности, гонококки, плохо различимы. Однако рост гонококка на этой среде обильный и его колонии легко могут быть обнаружены путем обработки роста 1% раствором диметилпарафенилендиамина или другого реактива на оксидазу, который окрашивает колонии гонококка в красный цвет, хорошо контрастирующий на желтом фоне среды. Использование желточной среды без обработки роста микроорганизмов реактивом на оксидазу не рекомендуется.

Качество каждой новой серии питательной среды лабораторного изготовления необходимо проверять путем посева на нее патологического материала от больных, у которых бактериоскопически обнаружены гонококки.

Срок хранения МПА в холодильнике при 4° не должен превышать 1 месяц, обогащенной среды - 7 суток.

В связи с тем, что для вышеуказанной среды возможен малый срок хранения, разработана методика производственного изготовления лиофилизированной безасцитной питательной среды, которая под названием "Питательная среда для выделения гонококков, сухая" выпускается в двух флаконах: часть I (основа среды) и часть II (обогащающие вещества). Для приготовления рабочей среды в часть I нужно добавить 100 мл стерильной дистиллированной воды и подогреть в водяной бане при 100° до полного растворения содержимого флакона (в пределах 30 минут). Лишнее время выдерживать среду в водяной бане не следует, т.к. это снижает ее качество. В часть II вносят 24 мл стерильной дистиллированной воды (растворение обогащающих веществ наступает немедленно). Затем при соблюдении условий стерильности часть II переносят в охлажденную до 56° часть I, смешивают, разливают по стерильным пробиркам, скашивают и увлажняют как описано ранее.

Сухая среда готовится из кроличьего мяса или бычьих сердец, помимо приведенных в рецепте 1 (среда КДС-1) обогащающих веществ она содержит оротовую кислоту в концентрации 1 мкг/мл. Среда высокого качества, удобна для использования в бактериологических лабораториях, т.к. для перевода сухой среды в рабочую требуется лишь стерильная дистиллированная вода.

Использование безасцитной питательной среды с добавлением антибиотиков и оротовой кислоты дает хорошие результаты при бактериологической диагностике, в том числе экстрагенительной гонореи: гонореи миндалин и глотки, прямой кишки. Антибиотики добавляют для подавления роста сопутствующей гонококку бактериальной флоры, что повышает интенсивность роста гонококка, облегчает обнаружение его единичных колоний и выделение в чистой культуре. Добавляют 20,0 ЕД/мл полимиксина М сульфата и 6,2 ЕД/мл ристомицина сульфата; вместо последнего можно использовать линкомицин гидрохлорид - 2 мкг/мл. Оротовую кислоту вводят в состав питательной среды в количестве 1 мкг/мл.

Для этого берут навеску оротовой кислоты 1 мг (1000 мкг) и разводят в 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (получают рабочий раствор, содержащий 1000 мкг который может сохраняться в холодильнике в течение 10 дней) и стерилизуют в водяной бане 15 минут, затем отбирают 0,1 мл полученного раствора и добавляют к 100 мл обогащенной питательной среды. Среду с антибиотиками необходимо использовать одновременно со средой без антибиотиков (одна пробирка со средой с антибиотиками, другая - без них), т.к. хотя и редко, но встречаются штаммы гонококка, чувствительные к вышеуказанным антибиотикам.

Среда сохранения (транспортировки)

Состав среды сохранения: 1) 1 литр дистиллированной воды, свободной от хлора, 30 г агар-агара; 2) 900 мл дистиллированной воды, свободной от хлора, 2 мл тиогликоловой кислоты, 12 мл 1М раствора едкого натрия, 100 мл 20% водного раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного, 20 мл 1% раствора хлористого кальция. Последнюю смесь (2) прибавляют к свежеприготовленному агару (1), доводят рН до 7,3-7,4, по 10 мл среду разливают в стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 1 часа.

Ватные тампоны на деревянных палочках или стержнях из нержавеющей стали диаметром около 2 мм, вмонтированные в ватные пробки, кипятят 20 минут в фосфатном буфере, рН=7,4, и импрегнируют в течение 24 часов в 1% водной суспензии тонко измельченного древесного угля. После высушивания ватные тампоны подправляют, вставляют в бактериологические пробирки соответствующего диаметра (равного диаметру пробирок со средой) и стерилизуют в автоклаве 20 минут при 1 атмосфере (температура 120°).

Для приготовления фосфатного буфера готовят два раствора: 1 раствор - в 1 л дистиллированной воды растворяют 28,4 г натрия фосфорнокислого двухзамещенного (0,2М); 2 раствор - в 1 л дистиллированной воды растворяют 27,8 г лимонной кислоты (0,1 М). Смешивают 181,7 мл 1 раствора и 18,3 мл 2 раствора.

Производство посева с использованием среды сохранения осуществляется следующим образом. Врач, осматривающий больного, извлекает из пробирки тампон, вводит его в очаг заболевания на несколько секунд для пропитывания (можно сделать несколько движений по и против часовой стрелки), извлекает его, не касаясь окружающих предметов, в пробирку со средой сохранения. Поверх ватной пробки пробирку закрывают резиновой соской. До отправки материала в бактериологическую лабораторию посевы сохраняют при 4° в холодильнике минимальный срок, но не более суток. Одновременно берут патологический материал и делают мазки для бактериоскопического исследования, которые направляют в лабораторию вместе с посевом. В бактериологической лаборатории немедленно после поступления тампоны с патологическим материалом вынимают из среды сохранения и ими производят посев по поверхности скошенной питательной среды в пробирках. Каждым тампоном делают посев на питательную среду в двух пробирках. Посев по поверхности питательной среды следует производить зигзагообразными движениями вдоль поверхности среды, вращая тампон. Если диаметр пробирок со средой сохранения и питательной средой аналогичен, можно тампон после посева оставить во второй пробирке в соприкосновении с питательной средой. Посевы помещают в термостат и выращивают при 36-37° в эксикаторе. Следует иметь в виду, что при использовании среды сохранения рост гонококка может наступить позже, чем при непосредственном посеве патологического материала на питательную среду.

Работа с культурами

Выращивание гонококков можно производить в пробирках или чашках Петри; первый способ обеспечивает значительную экономию среды. Для повышения процента высеваемости гонококков засеянные питательные среды помещают в термостат в эксикаторе с 20% содержанием углекислого газа, который получают в результате реакции между серной кислотой и бикарбонатом натрия: в эксикатор объемом 5 литров помещают стакан с 50 мл 10% серной кислоты, в него опускают 3,8 г бикарбоната натрия, дают возможность образовавшемуся газу вытеснить из эксикатора воздух, после чего притирают крышку, края которой предварительно смазывают вазелином и ланолином 1:1. Выращивание производят в термостате при 36-37°.

Выросшую культуру исследуют макро- и микроскопически: изучают вид колоний и отмечают подозрительные на гонококки, готовят из них и другой флоры мазок, который окрашивают по способу Грама и микроскопируют.

Колонии гонококков чаще вырастают в течение 1-2 суток, поэтому обязательным является исследование культур на следующий день после посева. Однако наблюдается и более поздний рост, особенно при посеве патологического материала из цервикального канала, что по мнению одних исследователей объясняется расположением гонококка внутри слизи, других - наличием в посевном материале его Л-форм, трансформация которых происходит медленно. В связи с этим, если питательная среда не зарастает сопутствующей флорой, ее выдерживают в термостате до 8 суток с обязательным ежедневным просмотром.

Колонии гонококка имеют круглые очертания, ровные края, блестящую поверхность, прозрачны или слегка мутные, бесцветны. При снятии колоний с поверхности среды петлей и при получении суспензии гонококков в изотоническом растворе натрия хлорида или водопроводной воде с целью получения мазков из культур на предметном стекле определяется их слизистая консистенция.

При бактериологической диагностике гонореи большое значение имеет правильная окраска мазков из культур по способу Грама и квалифицированное их исследование. Критерием правильной окраски культур является наличие недообесцвеченных участков в толстых местах мазка. При этом, при правильной окраске, в центре скоплений из оранжево-красных микроорганизмов наблюдаются группы кокков или отдельные участки мазка, окрашенные в фиолетовый цвет.

При исследовании мазков из культур необходимо учитывать морфологию, расположение и окраску гонококков. Они представляют собой, главным образом, не парные, а отдельные кокки, собранные в скопления с более плотным центром и как бы рассыпанные беспорядочно по периферии. Наряду с интенсивно окрашенными в оранжево-розовый цвет кокками встречаются бледно окрашенные формы, а также особи неправильно округлых очертаний. Полиморфность гонококков увеличивается по мере старения культуры. Гонококки не образуют в культуре цепочек и гроздей, что свойственно стрептококкам и стафилококкам. Следует отметить, что нередко встречаются штаммы стрептококка и стафилококка, легко теряющие свою первоначальную фиолетовую окраску при обесцвечивании спиртом, и в процессе окраски по способу Грама приобретающие "грамоотрицательность". Без учета морфологии и расположения кокков в данном случае легко может быть допущена лабораторная ошибка - они могут быть приняты за гонококки.

Для идентификации гонококков, определения чувствительности к антибиотикам и продуцирования бета-лактамазы их выделяют в чистой культуре. Для этого ежедневно делают пересев отдельно расположенных колоний гонококка на свежую питательную среду того же состава, и на среду с антибиотиками. Последняя позволяет быстрее получить гонококк в чистой культуре. Субкультуры изучают под микроскопом на наличие в них бактерий других видов. Чистая культура гонококка не должна содержать ни единой популяции других микроорганизмов. Иногда приходится получать субкультуры несколько раз (3-5) для достижения чистоты. Чистую культуру гонококка можно при необходимости сохранять в лиофильно высушенном состоянии или на МПА из кроличьего мяса с кусочками печени под стерильным вазелиновым маслом с пересевами 1-2 раза в месяц. Для кратковременного сохранения гонококков нужно пересевать чистую культуру ежедневно на свежую питательную среду.

Значительную помощь для обнаружения гонококковых колоний в смешанных культурах оказывает реакция на цитохромную оксидазу, которая несмотря на ее неспецифичность, является высокочувствительным вспомогательным приемом при проведении культуральной диагностики гонореи. Она позволяет быстро находить единичные колонии гонококка при наличии большого числа колоний других микроорганизмов, выросших на поверхности питательной среды. Кроме того, с помощью реакции на оксидазу можно быстрее и точнее определять гонококковые колонии на поверхности непрозрачных питательных сред.

В качестве оксидазного реактива используют 1% водный раствор диметилпарафенилендиамина, диэтилпарафенилендиаминсульфата, парааминоэтиланилинсульфата, цветные проявители ЦП-2; Т-34, Т-32, ЦПВ-1. Растворы реактивов готовят на дистиллированной воде или изотоническом растворе натрия хлорида каждый раз перед применением. После того, как выросшие в пробирках на питательной среде культуры изучены макроскопически и подозрительные на гонококки колонии пересеяны на свежую питательную среду для выделения чистой культуры, из оставшихся колоний микроорганизмов сделаны мазки в капле водопроводной воды для дальнейшего исследования в окраске по способу Грама, на скошенную поверхность питательной среды с ростом бактерий наслаивают раствор оксидазного реактива пастеровской пипеткой так, чтобы он, стекая по поверхности среды, смачивал все выросшие на ней колонии микроорганизмов. Пробирки оставляют при комнатной температуре и просматривают. Оксидазную реакцию считают положительной при окрашивании хотя бы одной колонии микроорганизмов и отрицательной, если через 10-15 мин. смоченные раствором оксидазного реактива, колонии не окрашивались. Оксидазоположительные колонии, если нужно, пересеивают немедленно на свежую питательную среду, а оставшиеся колонии снимают петлей, делают из них мазки, которые окрашивают по способу Грама и исследуют под микроскопом. Для выделения чистой культуры гонококка лучше производить пересев колоний, не окрашенных оксидазным реактивом, если же дифференцировать их без оксидазной реакции не представляется возможным, то пересевать окрашенную колонию надо в первые секунды после начала окрашивания, так как реактив, оказывая токсическое действие на гонококки, снижает их жизнеспособность. Пересев по прошествии нескольких минут после воздействия реактива уже не дает роста гонококков. Гонококковые колонии после наслоения раствора реактива через несколько секунд окрашиваются вначале в розовый, затем в красный, а через несколько минут - в черный цвет. Они окрашиваются даже при наличии смешанных колоний, состоящих из гонококков и других микроорганизмов. Колонии оксидазоотрицательных микроорганизмов не окрашиваются, сохраняя цвет своего пигмента или оставаясь бесцветными.

Высокая чувствительность оксидазной реакции не согласуется с ее специфичностью. Оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, которые в процессе своей жизнедеятельности выделяют цитохромную оксидазу, поэтому оксидазоположительные колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать в окраске по способу Грама.

Дифференциация грамотрицательных кокков

Большое практическое значение имеет дифференциация грамотрицательных кокков. При обнаружении их в посевах патологического отделяемого у больных детей необходимо выделение чистой культуры грамотрицательных кокков и дифференциация их по ферментативным свойствам. Подобное исследование необходимо производить и при обнаружении в посевах у взрослых нетипичных грамотрицательных кокков.

Важное эпидемиологическое значение имеет выявление экстрагенитальных очагов гонореи, так как, во-первых, при недостаточно полном обследовании больных они не определяются, во-вторых, чувствительность гонококков к антибиотикам, в частности, к бензилпенициллину, в этих очагах может быть пониженной, из-за чего не наступает их санация в результате лечения. В связи с тем, что бактериоскопия при гонорее миндалин и глотки дает обычно отрицательный результат, первостепенное значение приобретает бактериологическое исследование.

Ввиду наличия на слизистой оболочке миндалин и глотки большого числа различных нейссерий, решающее значение приобретает выделение чистых культур грамотрицательных кокков и их тщательная идентификация путем изучения морфологических свойств, особенностей роста на питательных средах, пигментообразования и определения сахаролитических свойств. Наиболее трудным является дифференцирование гонококка от менингококка. Следует учитывать возможность получения смешанных культур гонококка с другими нейссериями. В мазках из культур гонококк отличается от других нейссерий меньшей интенсивностью окраски и четкостью контуров, более выраженным лизисом и типичным расположением в виде скоплений с густым центром и рассыпанными по периферии кокками. Это расположение обусловлено большей слизистостью колоний гонококка. Колонии большинства непатогенных нейссерий - непрозрачны, гонококка и менингококка - прозрачны. Колонии гонококка мельче колоний менингококка, последние - более плоские. При изучении роста микроорганизмов через слой питательной среды с боковым электрическим освещением отмечается голубой оттенок колоний менингококка, в то время как колонии гонококка имеют цвет среды или являются беловатыми.

Гонококки и менингококки не растут на простых питательных средах, причем наиболее требователен к составу питательной среды, гонококк, особенно при первичном посеве от больного. Ряд других признаков представителей рода Neisseria и Branhamella, которые могут быть выделены со слизистой оболочки человека (миндалин и глотки у взрослых, а также мочеполового тракта у детей и реже у взрослых) приведены в таблице.

Таблица

Дифференциальные признаки грамотрицательных кокков

-------------------------------------------------------------------------

                |   Образование кислоты из:  |Наличие  |Потреб-  |Рост

                |----------------------------|пигмента |ность в  |при

Микроорганизмы  | глю-|маль-|фрук-|саха-|лак-|         |СО2      |22°

                | козы|тозы |тозы |розы |тозы|         |         |

-------------------------------------------------------------------------

N. gonorrhoeae     +     -     -     -     -      -        //       -

N. meningitidis    +     +     -     -     -      -        /        -

N. sicca           +     +     +     +     -      х        *        х

N. flava           +     +     +     -     -      +        *        х

N. subflava        +     +     +-    +-    -      +        *        х

N. perelava        +     +     +     +     -      +        *        х

N. flavescens      -     -     -     -     -      +        *        +

N. mucosa          +     +     +     +     -      -        *        +

B. catarrhalis     -     -     -     -     -      -        *        +

-------------------------------------------------------------------------

Обозначения: +  большинство   штаммов  дает  положительный   результат

                (90%);

             -  большинство   штаммов   даст  отрицательный  результат

                (90%);

             +- признак  непостоянный   у  одного  и того  же  штамма;

             х  некоторые    штаммы   дают   положительный,  некоторые

                отрицательный результат;

             // очень важна;

             /  важна;

             *  не обязательна.

Невозможность получения роста гонококков и менингококков на МПА без обогащающих среду ингредиентов и температуре 22° может быть использована при идентификации выделенных грамотрицательных кокков.

Дифференциальный диагноз между гонококком и менингококком бывает труден, когда образование кислоты из глюкозы и мальтозы выражено слабо или отсутствует. В этих редких случаях может помочь определение гемолитических свойств выделенных культур путем посева их на МПА с 5% крови лошади. Наличие зон гемолиза вокруг колоний после 48-72 часов инкубации посева указывает на выделение менингококка.

Для определения сахаролитических свойств грамотрицательных кокков следует использовать среду ферментации ЦКВИ.

Основой среды является МПА из кроличьего мяса или бычьих сердец, приготовленный по ранее описанной методике, рН=7,4-7,5. В каждую из пяти колб со 100 мл расплавленного в кипящей водяной бане и охлажденного до 56° МПА добавляют смесь, состоящую из 15 мл желтка свежего куриного яйца и 1,5 г одного из следующих сахаров: глюкозы, мальтозы, фруктозы, сахарозы, лактозы, растворенных в 2 мл дистиллированной воды и простерилизованных кипячением в водяной бане в течение 15 минут, а также 6 мл 0,2% раствора фенолового красного водорастворимого. Перемешивают, разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри. Среду можно хранить в холодильнике при 4° в течение одного месяца.

Приготовление индикатора: 2 г фенолового красного водорастворимого добавляют к 1 л дистиллированной воды, доводят рН до 7,8, используя 20% раствор едкого натрия, стерилизуя в автоклаве при 120° в течение 20 минут.

Посев чистой культуры подлежащего дифференциации грамотрицательного кокка производят на поверхность среды ферментации, предварительно подогретой в термостате, в виде двух взаимоперпендикулярных штрихов длиною 1 см. На поверхность среды в одной чашке Петри можно посеять от 1 до 5 испытуемых штаммов. Чашки с посевами помещают в эксикатор с влажной ватой на дне, но без создания в нем повышенного содержания углекислого газа.

Результаты реакции учитывают через сутки. Положительным считают изменение красного цвета среды на желтый в зоне роста микроорганизмов под действием их сахаролитических ферментов. При отсутствии этого действия среда остается красной или становится вишневой, что регистрируется как отрицательный результат.

ЦКВИ разработана также более экономичная модификация указанного способа определения сахаролитических свойств грамотрицательных кокков, которую удобно использовать при изучении малого числа штаммов. При применении данного способа растворы всех пяти сахаров наносят на поверхность среды в одной чашке, что позволяет изучать сахаролитические свойства одного штамма при наличии одной чашки со средой. При изготовлении среды для данной модификации к МПА добавляют только желток свежего куриного яйца в соотношении, указанном выше. Чашки Петри, в которые разливаются среды, должны быть установлены на горизонтальной поверхности. Хранение среды в чашках допускается в течение одного месяца в xoлoдильнике при 4°.

Перед использованием среду нагревают в термостате, после чего дно чашки с внешней стороны делят на пять секторов и чашки устанавливают на горизонтальной плоскости. На поверхность среды каждого сектора стерильной пастеровской пипеткой наносят по одной капле 80% раствора одного из пяти вышеуказанных сахаров, растворенных в 0,2% стерильном растворе фенолового красного водорастворимого, приготовленного как указано выше. Эти растворы сахаров стерилизуют кипячением в водяной бане в течение 15 минут. Неиспользованные растворы можно хранить в холодильнике при 4° в течение одного месяца.

Посев испытуемой культуры производят на все пять секторов в одной чашке в зоне нанесения растворов сахаров, после того как произойдет диффузия их в среду.

Инкубация посевов и учет результатов осуществляется как указано выше.

Добавление к среде ферментации антибиотиков, согласно методическим указаниям, способствует сохранению стерильности среды при хранении и препятствует загрязнению изучаемых культур при посеве их на среду ферментации.

Определение чувствительности гонококков к антибиотикам

При безуспешном лечении гонореи возникает необходимость определения чувствительности гонококка к антибиотикам. С этой целью используют метод диффузии в агар с применением стандартных бумажных дисков, пропитанных антибиотиками. Асцит-агар или безасцитную питательную среду разливают в чашки Петри. На ее поверхность наносят 1 мл взвеси суточной чистой культуры гонококка в изотоническом растворе хлорида натрия (густота взвеси 10 ЕД по оптическому стандарту мутности), которую стеклянным шпателем равномерно распределяют но поверхности среды, выдерживают 15 минут при комнатной температуре, избыток взвеси удаляют с помощью пипетки. Затем на поверхность среды помещают бумажные диски с антибиотиками, применяемыми для лечения гонореи. Чашки в эксикаторе выдерживают в термостате 1-2 суток. При оценке результатов измеряют в мм диаметр зон полной задержки роста гонококка вокруг дисков, включая их диамер. Отсутствие зон указывает на отсутствие чувствительности, зоны диаметром до 10 мм - на малую чувствительность, более 10 мм - на чувствительность испытуемых штаммов гонококка к концентрации антибиотика в стандартных дисках, причем чем больше зона, тем выше чувствительность.

Использование смешанных культур для определения чувствительности гонококка к антибиотикам не допустимо.

При микроскопическом обнаружении большого числа гонококков в патологическом отделяемом возможен непосредственный посев отделяемого на среду в чашках Петри с последующем наложением дисков с антибиотиками. При этом берут густую взвесь отделяемого в 1 мл изотонического раствора, равномерно распределяют ее шпателем по поверхности среды, причем избыток не удаляют, а ожидают полного всасывания взвеси в среду. В остальном исследование проводят аналогично ранее описанному.

Определение бета-лактамазной активности гонококка

В последние годы все шире распространяются штаммы гонококка, продуцирующие бета-лактамазу, которая инактивируя пенициллин, обусловливает безуспешность лечения больных гонореей этим антибиотиком. Выработку гонококком бета-лактамазы определяют чашечным способом, при котором к стерильной основе питательной среды для выделения гонококка, расплавленной в водяной бане и охлажденной до 45°, добавляют помимо обогащающих веществ взвесь стафилококка, чувствительного к пенициллину. Для этого из суточной культуры стафилококка готовят взвесь в стерильном изотоническом растворе густотой 5 ЕД по оптическому стандарту мутности, затем эту взвесь разводят еще в 10 раз, берут 6 мл взвеси и добавляют к 100 мл среды. Среду со взвесью перемешивают и разливают по стерильным чашкам Петри. На застывшую среду в центр чашки помещают стандартный диск с пенициллином и от него по радиусам до края чашки засевают в виде линий испытуемые микроорганизмы. При использовании 1 чашки можно исследовать 4-5 штаммов. При проведении данного исследования необходимо иметь штамм любого микроорганизма, продуцирующий бета-лактамазу (положительный контроль). Чашки Петри с посевами помещают в термостат при 36-37°. Через сутки среда прорастает стафилококком (рис.1.3) за исключением зоны задержки роста (рис.1.2) вокруг диска (рис.1.1.). Микроорганизмы, не продуцирующие бета-лактамазу, вырастают в виде полосы, не изменяя очертаний зоны задержки роста стафилококка (рис.1.7.). При выработке штаммом бета-лактамазы она нейтрализует бензилпенициллин, диффундирующий в питательную среду из диска, в результате чего по краям линии роста этого микроорганизма по направлению к диску наблюдается рост стафилококка внутри среды, что приводит к искривлению очертаний зоны задержки роста (рис.1.5.). Если штамм не продуцирует бета-лактамазу, но чувствителен к бензилпенициллину, то он вырастает до зоны задержки роста (рис.1.4). Микроорганизмы, продуцирующие стафилоцин, который губительно действует на стафилококк, при своем росте образуют полосу просветления в газоне (рис.1.6.). По степени искривления зоны задержки роста судят о количестве вырабатываемой испытуемым штаммом бета-лактамазы.

Следует учесть, что при пересевах гонококк может потерять способность продуцировать бета-лактамазу.

Организационные вопросы

Лаборатория, осуществляющая бактериологическую диагностику гонореи, должна иметь бокс с предбоксником, комнату для мытья посуды, отдельные помещения для взятия материала от больных и его обработки, для микроскопического исследования мазков и культур, подготовки лабораторной посуды, а также для приготовления питательных сред и их стерилизации. Лаборатория должна быть обеспечена термостатами, сушильными шкафами, холодильниками, автоклавами, инактиваторами, центрифугами, инструментарием, лабораторной посудой, а также необходимыми реактивами и ингредиентами для окраски и приготовления питательных сред.

Работа с живыми культурами микроорганизмов требует строгого соблюдения правил личной и общественной безопасности при ее выполнении. Все предметы, которые были использованы при работе с патологическим материалом или живыми культурами (петли, пипетки, пробирки, предметные стекла и др.) немедленно обеззараживают прожиганием на пламени, либо погружением в дезинфицирующий раствор, либо автоклавированием. Работу с живыми культурами микроорганизмов производят только в боксе, его не используют для приготовления стерильных питательных сред. Стены и потолок бокса должны быть выкрашены масляной краской, пол выложен плиткой или покрыт линолеумом, столы обиты легко моющимися материалами. В боксе необходима бактерицидная лампа, на рабочих местах - банки с дезинфицирующим раствором, желательна газовая горелка, которая может быть заменена спиртовой. В предбокснике ставят шкафы для спецодежды и стерильной посуды, необходимых для работы в боксе. Ежедневно до работы и после нее бокс обрабатывают дезинфицирующими растворами и облучают бактерицидной лампой.

Рис.1 1 - стандартный диск, пропитанный раствором пенициллина 2 - зона задержки роста 3 - газон индикаторной культуры золотистого стафилококка (штамм 209) 4 - рост микроорганизма не продуцирующего бета-лактамазу и чувствительного к пенициллину 5 - рост микроорганизма продуцирующего бета-лактамазу 6 - рост микроорганизма не продуцирующего бета-лактамазу и вырабатывающего стафилоцин 7 - рост микроорганизма не чувствительного к пеницилину и не вырабатывающего бета-лактамазу

Бактериологический контроль на загрязненность бокса должен проводиться не менее одного раза в неделю. Для этого на 15 минут оставляют на столе открытыми чашки Петри с мясопептонным агаром (МПА) и средой Сабуро, затем первую чашку инкубируют в течение 48 часов при 37°, вторую - 96 часов при 22°. Допускается рост не более 10 колоний сапрофитных микроорганизмов.

Известно, что правильная организация лабораторных исследований, их высокое качество помогает раннему распознаванию и своевременному лечению гонореи и трихомониаза, решение вопросов излеченности больного и, тем самым, создают условия для более эффективной борьбы с распространением этих заболеваний, для правильности их учета.

Бактериологическая диагностика является одним из важных звеньев в борьбе с распространением заболеваемости гонореей и трихомониазом, так как эффективная организация и проведение лечебно-профилактических и противоэпидемических мероприятий без этого чувствительного и специфического метода выявления возбудителя невозможны. Основным этапом бактериологической диагностики является первичное выделение возбудителя инфекции, которое осуществляется путем культивирования на питательной среде исследуемого отделяемого пораженных органов, содержащего микроорганизмы. Поэтому надежность исследований и, соответственно, эффективность работы бактериологической лаборатории в значительной мере зависит от качества исследований. Получение точных и достоверных результатов может быть достигнуто лишь при оптимальном числе проведенных исследований в единицу времени, увеличение их приводит к стремлению каждым работником быстрее провести каждое исследование, повышению утомляемости и, естественно, к снижению качества исследования, а в результате возможности гиподиагностики заболевания. Оптимальные условия для работы бактериологической лаборатории достигаются в том случае, когда каждый работник выполняет исследования в соответствии с нормами затрат рабочего времени, полагающегося для производства данного исследования.

Отделами эпидемиологии и микробиологии Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института Минздрава СССР, по методикам и при непосредственной консультационной помощи Нормативно-исследовательского центра Всесоюзного научно-исследовательского института гигиены и организации здравоохранения им. Н. А. Семашко на основании проведенных хронометражных замеров деятельности работников бактериологических лабораторий кожно-венерологических диспансеров разработаны расчетные нормы времени на отдельные виды лабораторных исследований при диагностике гонореи и трихомониаза (приложение).

Главным управлением лечебно-профилактической помощи и Планово-финансовым управлением Министерства здравоохранения СССР указанные нормы письмом N 10-9/476-43 от 21 января 1985 года разрешено использовать руководителям органов и учреждений здравоохранения при решении вопросов по рациональной расстановке и использованию кадров в подведомственных им лечебно-профилактических учреждениях.

Приложение

Расчетные нормы времени на отдельные виды лабораторных исследований в бактериологических лабораториях кожно-венерологических диспансеров

-------------------------------------------------------------------------

    |                              |  Время на одно исследование *(5)

    |                              |      в минутах и секундах

 N  |       Наименование           |-------------------------------------

п/п |       исследований           |            |      В том числе:

    |                              |            |------------------------

    |                              |    Всего   |  врача-ла- | лабо-

    |                              |            |  боранта   | ранта

----+------------------------------+------------+------------+-----------

  1 |             2                |      3     |      4     |     5

-------------------------------------------------------------------------

               1. Микробиологическая диагностика гонореи.

1.1. Культуральные  и  бактериоско-     22 мин      11 мин      11 мин

     пические исследования для  ди-     54 сек.     09 сек.     45 сек.

     агностики  гонореи  без забора

     материала в лаборатории

1.2. То же с изучением чувствитель-     36 мин      24 мин      11 мин

     ности чистых культур гонококка     21 сек.     36 сек.     45 сек.

     к антибиотикам   методом  диф-

     фузии в  агар с использованием

     дисков

1.3. Культуральные  и  бактериоско-     38  мин     11 мин      26 мин

     пические исследования  для  ди-    06  сек.    09 сек.     57 сек.

     агностики   гонореи  с забором

     материала  в лаборатории (все-

     го).

     В том  числе:

     1) забор  материала, приготов-     15 мин         -        15 мин

     ление мазков  на 2 стекла  и       12 сек.                 12 сек.

     производство   посева  на  2

     пробирки со средой;

     2) бактериоскопические  иссле-      9 мин       6 мин       3 мин

     дования  мазков, окрашенных        00 сек.     00 сек.     00 сек.

     метиленовым   синим   и  по

     Граму;

     3) работа  с культурами  (при-      9 мин       5 мин       4 мин

     готовление  мазков, их  изу-       12 сек.     09 сек.     03 сек.

     чение);

     4) приготовление  питательных       2 мин        -          2 мин.

     сред   (безасцитные,  асцит-       48 сек.                 48 сек.

     агар);

     5) приготовление   материалов,      1 мин        -          1 мин.

     обеспечивающих    проведение       54 сек.                 54 ceк.

     исследований  для диагности-

     ки  гонореи   (посуды,  про-

     бок, тампонов,  красок, кон-

     троль  работы    аппаратуры,

     стерилизация,  убивка  зараз-

     ного материала и др.)

1.4. Культуральные  и  бактериоско-     51 мин      24 мин      26 мин

     пические  исследования для ди-     33 сек.     36 сек.     57 сек.

     агностики   гонореи  с забором

     материала в лаборатории и изу-

     чением чувствительности чистых

     культур гонококка к антибиоти-

     кам  методом диффузии  в  агар

     с использованием дисков

        2. Микробиологическая диагностика гонореи и трихомониаза

2.1. Культуральные и бактериоскопи-     34 мин      17 мин      17 мин

     ческие исследования  для одно-     24 сек.     18 сек.     06 сек.

     временной  диагностики гонореи

     и трихомониаза  без забора ма-

     териала в лаборатории

2.2. То же  с   изучением  чувстви-     47 мин     30 мин.     17 мин.

     тельности чистых   культур го-     51 сек.    45 сек.     06 сек.

     нококка к  антибиотикам  мето-

     дом диффузии  в агар с исполь-

    зованием дисков

2.3. Культуральные  и  бактериоско-     50 мин     17 мин      33 мин

     пические исследования для  од-     33 сек     18 сек.     15 сек.

     новременной диагностики  гоно-

     реи и  трихомониаза  с забором

     материала  в лаборатории  (все-

     го).

     В том  числе:

     1) забор  материала,  пригогов-    16 мин        -        16 мин

     ление мазков на  2 стекла и        09 сек.                09 сек.

     производство  посева   на 2

     пробирки с  питательной сре-

     дой  для   гонококков   и в

     1 пробирку   со  средой для

     влагалищных  трихомонад;

     2) бактериоскопические исследо-    10 мин      7 мин.      2 мин

     вания мазков,   окрашенных         27 сек.    30 сек.     57 сек.

     метиленовым   синим   и  по

     Граму;

     3) работа  с  культурами  (при-    17 мин      9 мин       7 мин

     готовление культур, изучение       09 сек.    48 сек.     21 сек.

     их);

     4) приготовление    питательных     4 мин.       -         4 мин

     сред   (безасцитные, асцит-        42 сек.                42 сек.

     агар, жидкие и др.);

     5) приготовление    материалов,     2 мин        -         2 мин

     обеспечивающих   проведение        06 сек.                06 сек.

     исследований для  диагности-

     ки гонореи  и  трихомониаза

     (посуды,  пробок,  тампонов,

     красок, контроль работы  ап-

     паратуры, стерилизация, убив-

     ка  заразного   материала и

     др.)

2.4. Культуральные  и  бактериоско-     64 мин     30 мин.     33 мин

     пические исследования  для  од-    00 сек.    45 сек.     15 сек.

     новременной   диагностики гоно-

     реи и  трихомониаза  с забором

     материала в лаборатории  и изу-

     чением чувствительности  чистых

     культур гонококка  к антибиоти-

     кам методом  диффузии  в агар с

     использованием дисков

В расчетные нормы включено время на: прием, регистрацию больных и выдачу заключений; взятие материала непосредственно из очагов заболевания и его исследование; проведение всей необходимой подготовительной работы к исследованию (приготовление реактивов, красок, питательных сред и др.). Время переходов (проездов) для взятия материала на исследование лаборантом в стационаре лечебно-профилактического учреждения или другого учреждения должно учитываться по фактическим затратам.

При распределении времени между врачом-лаборантом (заведующим) и лаборантом настоящие нормы предусматривают, что при непосредственном выполнении исследований врач-лаборант выполняет следующие манипуляции: микроскопирование мазков патологического материала, взятого из очагов и окрашенного метиленовым синим и по Граму, и мазков из культур, окрашенных по Граму, для обнаружения возбудителей гонореи и трихомониаза с регистрацией результатов исследования в бланке; макроскопическое изучение выросших культур, а также постановка оксидазного теста; микроскопирование выросшей культуры в нативном препарате для обнаружения возбудителя трихомониаза с регистрацией результатов исследований в бланке; пересевы колоний гонококка и выделение его чистой культуры; пересев культур влагалищных трихомонад в свежую питательную среду; определение чувствительности чистых культур гонококков к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков; контроль работы лаборантов, обучение их; контроль работы лабораторий, занимающихся диагностикой гонореи и трихомониаза, в курируемых учреждениях, подготовка кадров в них. Все остальные манипуляции выполняются лаборантами под контролем врача-лаборанта (заведующего). Данное распределение обязанностей не исключает взаимозаменяемости в тех случаях, когда это диктуется необходимостью или условиями работы.

Нормы предназначаются для определения фактического объема работы бактериологической лаборатории, ее производственной мощности, анализа качества ее работы и установления более правильных соотношений между врачами-лаборантами и лаборантами, но не могут служить основанием для расчета по заработной плате, а также для установления штатов лабораторий.

Затраты времени врачами-лаборантами и лаборантами исчисляются в зависимости от объема работы, выполненной каждым из них, в соответствии с изложенными нормами. Так, например, в бактериологической лаборатории в течение года всего произведено 3800 исследований для диагностики гонореи со взятием материала в лаборатории (1.3) и 1600 исследований для одновременной диагностики гонореи и трихомониаза (2.3), из которых в 425 и 360 случаях, соответственно, изучалась чувствительность гонококка к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков (1.4. и 2.4.). При этом лаборатория располагала в данном году 2 штатными единицами врачей-лаборантов и 3 - лаборантов.

Затраты времени, необходимые для проведения указанной работы в соответствии с расчетными нормами, составляют для 2 врачей-лаборантов: (11 мин 09 сек Х (3800 - 425) Х2)+(17 мин 18 сек Х (1600 - 360) X 2) +(24 мин 36 сек Х 425 Х 2)+(30 мин 45 сек Х 360 Х 2), что в сумме составляет 2687 часов. То же для 3-х лаборантов: (26 мин 57 сек Х (3800 - 425) Х З) +(33 мин 15 сек Х (1600 - 360) Х 3) + (26 мин 57 сек Х 425 Х 3)+(33 мин 15 сек Х 360 Х 3), сумма равна 7780 часов.

Фактически в течение года 2 врача-лаборанта работали 3396 часов (283 раб. дня Х 6 часов Х 2), а 3 лаборанта - 5094 часа (283 раб. дня Х 6 X 3). Следовательно, в лаборатории, выполняющей указанный объем работы, целесообразно было использовать 0,75 (2687:3396) вместо 2 должностей врачей-лаборантов и 1,5 (7780:5094) вместо 3 должностей лаборантов.

Серологический метод исследования (реакция Борде-Жангу)

Принцип. Специфические антигонококковые антитела вступают в соединение со специфическим антигеном (убитая культура гонококка, содержащая 3 млрд микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту). Образовавшиеся комплексы сорбируют вводимый в реакцию комплемент. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (эритроциты барана+гемолитическая сыворотка). Применяется для выявления больных гонореей, в основном при хронических и осложненных формах заболевания.

Реагенты:

1. 0,9% изотонический раствор натрия хлорида.

2. Антиген специфический гонококковый, две разные серии, сохраняется в холодильнике при 4°.

3. Комплемент - смесь сывороток крови морских свинок. Может быть использован лиофильновысушенный или жидкий, консервированный - 5 г сернокислого натрия и 4 г борной кислоты на 100 мл. Хранится в холодильнике при 4°, срок годности до двух месяцев.

4. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка против эритроцитов барана с титром не ниже 1 :1200, сохраняется в холодильнике при 4°.

5. Эритроциты барана. Кровь получают у барана путем пункции яремной вены. Кровь собирают в стерильную банку со стеклянными бусами, встряхивают 5-10 минут. Фильтрованием через марлю отделяют образовавшиеся сгустки фибрина. Дефибринированная кровь барана хранится в холодильнике при 4° в течение 3-5 дней. При необходимости более длительного хранения кровь консервируют. К 100 мл дефибринированной крови барана добавляют 15 мл смеси, приготовленной по следующей прописи: глюкозы 6 г, борной кислоты 4,5 г, 100 мл изотонического раствора натрия хлорида; приготовленную смесь кипятят на водяной бане 3 дня подряд по 20 минут, срок годности консервированной крови барана до 4 недель. Дефибринированная консервированная и неконсервированная кровь хранится в холодильнике при 4°.

Специальное оборудование

1. Центрифуга.

2. Термостат с температурой 37°.

3. Холодильник с температурой 4°.

4. Инактиватор (водяная или суховоздушная баня) с температурой 56°.

5. Приборы дозировочные для серологических исследований (Флоринского) ФЛ-3 и ФЛ-4.

6. Пипетки градуированные на 1,2 мл с делениями 0,01 мл.

7. Пипетки градуированные на 5, 10 мл с делением 0,1 мл.

8. Пробирки размером: 14х60 мм, 15х100 мм, 15х150 мм.

9. Цилиндры мерной емкостью 100, 250, 500 мл с делениями на 5 мл.

10. Химические стаканы емкостью 50, 100, 250, 500 мл.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов:

Обработка испытуемой сыворотки крови. Для исследования требуется 7-10 мл крови, которую получают пункцией локтевой вены. Пункцию производят стерильной иглой при соблюдении правил асептики. Взятие крови производят натощак или не ранее 6 часов после приема пищи. Нельзя брать кровь у больных с повышенной температурой, после употребления спиртных напитков ранее 24 часов, перенесших недавно инфекционное заболевание, у женщин во время менструации, у беременных в последние 10 дней беременности, у рожениц в первые 10 дней после родов, у новорожденных в первые 10 дней жизни. В лабораторию кровь, собранная в сухую чистую пробирку, должна быть доставлена не позднее 48 часов с момента взятия при условии ее хранения в холодильнике при 4°. Сыворотка крови может быть использована для постановки в день взятия крови. При этом доставленную в лабораторию кровь (в день ее взятия) помещают в термостат при 37° на 15-30 минут. Образовавшийся сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенок пробирки и центрифугируют 15 минут при 1000 об/мин. Над сгустком образуется слой прозрачной сыворотки крови, которую при помощи пипетки с резиновым баллоном без примеси эритроцитов переносят в другую пробирку. При наличии в сыворотке крови примеси эритроцитов ее центрифугируют и отделяют от них. Кровь, доставленную в лабораторию накануне постановки реакции, обводят стеклянной палочкой и помещают в холодильник при 4°. Перед постановкой реакции образовавшуюся над сгустком крови сыворотку переносят в другую пробирку. Снятую со сгустка сыворотку крови инактивируют при 56° 30 минут. Сыворотки крови ранее инактивированные, в день постановки реакции должны быть повторно прогреты при 56° в течение 15 минут. Инактивированные сыворотки крови могут сохраняться в холодильнике при 4° в течение 5-6 дней. При необходимости длительного хранения сывороток крови (до 3-4 недель) их консервируют добавлением сухой борной кислоты (из расчета получения 2% концентрации) или замораживают в морозильной камере холодильника на тот же срок, не допуская повторного замораживания и оттаивания. Допускается исследование сыворотки крови, высушенной на вощаной бумаге (на каждый 0,5 мл сыворотки крови до ее высушивания добавляют по 3 капли свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара). Для исследования сухую сыворотку крови необходимо растворять в изотоническом растворе натрия хлорида в объеме, равном объему высушенной сыворотки крови. Перед исследованием проводят инактивирование при 56° в течение 30 минут.

Желтушные, хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки крови для исследования непригодны.

Приготовление раствора антигенов. Антигены разводят соответственно способу и титру, указанному на этикетке. Титр - это количество чистого антигена в 1 мл раствора.

Приготовление гемолитической системы. Дефибринированную кровь барана или эритроциты барана в объеме, необходимом для работы в данный день, трех-пятикратно отмывают изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования. Центрифугируют 10 минут при 1,5 тысячах оборотов в минуту. Последнюю бесцветную порцию промывной жидкости сливают, а осадок вновь центрифугируют для его уплотнения. Надосадочную жидкость вновь удаляют, а из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов барана в изотоническом растворе натрия хлорида. Равный объем гемолитической сыворотки, разведенной в изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру (например, на этикетке указан титр 1:1200; для разведения титр будет 1:400, т. е. 0,1 мл гемолитической сыворотки на 40 мл изотонического раствора натрия хлорида) приливают к равному объему 3% взвеси эритроцитов барана и производят быстрое смешивание, путем переливания из одной колбы в другую. Полученную гемолитическую систему выдерживают в термостате при 37° 30 минут.

Титрование комплемента. Комплемент морской свинки разводят 1 : 10 изотоническим раствором натрия хлорида. При работе с сухим комплементом предварительно необходимо растворить содержимое ампулы в изотоническом растворе натрия хлорида в объеме, равном объему высушенного комплемента.

Отрицательную инактивированную сыворотку крови человека разводят изотоническим раствором натрия хлорида 1:5.

Титрование комплемента проводят в 36 пробирках, поставленных по 12 штук в три ряда. Два ряда пробирок для титрования комплемента в присутствии двух антигенов и третий ряд - для титрования комплемента без антигенов в присутствии изотонического раствора натрия хлорида. Пять контрольных пробирок: две - для контроля антигенов и по одной - для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и изотонического раствора натрия хлорида на гемотоксичность - заполняют их до объединения раствора гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов барана (таблица N 1).

Таблица 1

Схема проведения контроля

-------------------------------------------------------------------------

         Ингредиенты (мл)           |        Контрольные пробирки

     (общий объем -  1,25 мл)       |------------------------------------

                                    |  1   |   2  |   3  |   4  |    5

-------------------------------------------------------------------------

  Гемолитическая  сыворотка, разве-    -     0,25     -      -       -

денная по утроенному титру

  3% взвеси эритроцитов барана        0,25   0,25   0,25   0,25    0,25

  Комплемент   1 : 10                 0,25    -       -      -       -

  Антиген гонококковый  N   1, раз-    -      -       -    0,5       -

веденный по титру

  Антиген гонококковый  N   2, раз-    -      -       -     -       0,5

веденный по титру

  Изотонический    раствор   натрия   0,75   0,75   1,0    0,5      0,5

хлорида

-------------------------------------------------------------------------

                Помещают  в термостат при 37° на 45 минут

-------------------------------------------------------------------------

Результат                              -Г     -Г     -Г     -Г       -Г

-------------------------------------------------------------------------

После 45 минут пребывания в термостате при 37° во всех контрольных пробирках должен отсутствовать гемолиз.

Комплемент, разведенный 1:10, разливают в 12 пробирок первого ряда в дозах: 0,1, 0,16, 0,2, 0,24, 0,3 0,36, 0,4, 0,44, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65 мл (таблица N 2). Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл соответствующими объемами изотонического раствора натрия хлорида: 0,9, 0,84, 0,8, 0,76, 0,7, 0,64, 0,6, 0,56, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35 мл. Полученную в каждой пробирке смесь тщательно перемешивают и переносят по 0,25 мл в соответственно стоящие позади два ряда пробирок и 0,25 мл выливают. Затем во все 36 пробирок разливают по 0,25 мл инактивированной отрицательной сыворотки крови человека, разведенной изотоническим раствором натриях хлорида 1: 5. Далее в 12 пробирок первого ряда приливают по 0,25 мл разведенного по титру гонококкового антигена N 1; разведенный по титру гонококковый антиген N 2 приливают по 0,25 мл в 12 пробирок второго ряда; изотонический раствор натрия хлорида приливают по 0,25 мл в 12 пробирок третьего ряда. Штатив с пробирками встряхивают и добавляют по 0,5 мл гемолитической системы в третий ряд пробирок (без антигенов). Штатив с пробирками вновь встряхивают и помещают в термостат при 37° на 45 минут. После инкубации в термостате в 24 пробирки первого и второго рядов добавляют по 0,5 мл гемолитической системы. Содержимое пробирок вновь встряхивают и помещают в термостат при 37° на 45 минут. По истечении 45 минут определяют рабочую дозу комплемента, которая устанавливается следующим образом: в основу берут титр комплемента без антигенов, затем титр комплемента в присутствии антигенов, к которому делают надбавку в пределах 30-50% в зависимости от степени гемолиза в пробирках с меньшим количеством комплемента.

Титром комплемента является наименьшее его количество, способствующее полному гемолизу эритроцитов барана в присутствии антигена и отрицательной сыворотки крови человека.

В данном случае титр комплемента будет 0,4, а рабочая доза комплемента - 0,6 т.е. 6% комплемент (таблица N 2).

Для каждого рабочего дня готовят необходимый объем комплемента, разведенного по рабочей дозе, исходя из расчета 0,75 мл комплемента на каждую испытуемую сыворотку крови, при условии постановки реакции Борде-Жангу с двумя разными сериями антигена. Так, на 60 испытуемых сывороток крови необходимо 45 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Следовательно, к 42,3 мл изотонического раствора натрия хлорида нужно добавить 2,7 мл комплемента (при шестипроцентной рабочей дозе комплемента). В случае получения разных титров комплемента в присутствии гонококковых антигенов двух разных серий используют при постановке реакции разные рабочие дозы комплемента в соответствии с полученными титрами, т. е. для каждого антигена свою рабочую дозу.

Таблица 2

Титрование комплемента в присутствии антигена и отрицательной сыворотки крови человека

-------------------------------------------------------------------------

Ингредиенты  |                      NN  пробирок

(мл) (общий  |-----------------------------------------------------------

объем -      |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |

1,25 мл)     |  1 |  2 |  3 |  4 |  5 |  6 |  7 |  8 |  9 | 10 | 11 | 12

-------------------------------------------------------------------------

Комплемент

1:10          0,1  0,16 0,2  0,24 0,3  0,36 0,4  0,44 0,5  0,55 0,6  0,65

Изотонический

раствор  нат-

рия хлорида   0,9  0,84 0,8  0,76 0,7  0,64 0,6  0,56 0,5  0,45 0,4  0,35

-------------------------------------------------------------------------

              После тщательного перемешивания из каждой пробирки  первого

              ряда переносят по 0,25 мл в соответствующие пробирки второ-

              го,  третьего ряда и по 0,25 мл удаляют из каждой  пробирки

              первого ряда.

-------------------------------------------------------------------------

Отрицательная                 по 0,25 мл во все 36 пробирок

инактивирован-

ная сыворотка

крови человека

1 : 5

-------------------------------------------------------------------------

Антиген гоно- 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

кокковый N 1,

разведенный                     (первый ряд пробирок)

по титру

-------------------------------------------------------------------------

Антиген гоно- 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

кокковый N 2,

разведенный                     (второй ряд пробирок)

по титру

-------------------------------------------------------------------------

Изотонический 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

раствор нат-

рия хлорида                     (третий ряд пробирок)

-------------------------------------------------------------------------

Гемолитичес-  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5

кая система                     (третий ряд пробирок)

-------------------------------------------------------------------------

                Встряхнуть, поместить в термостат при  37° на 45 минут.

-------------------------------------------------------------------------

Гемолитичес-  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5

кая система                     (первый и второй  ряды)

-------------------------------------------------------------------------

                Встряхнуть, поместить в термостат при  37° на 45 минут.

-------------------------------------------------------------------------

Результат      -Г   -Г   -Г   -Г   -Г   -Г   +Г   +Г   +Г   +Г   +Г   +Г

-------------------------------------------------------------------------

     Примечание: -Г (задержка гемолиза); +Г (гемолиз).

Качественный метод.Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1:5 изотоническим раствором натрия хлорида, исследуют в трех пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,25 мл. В первую пробирку добавляют 0,25 мл гонококкового антигена N 1, разведенного по титру; во вторую - 0,25 мл гонококкового антигена N 2, разведенного по титру; в третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Комплемент, разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и контрольные пробирки. После первичной 45 минутной инкубации в термостате при 37° приливают во все опытные и контрольные пробирки по 0,5 мл гемолитической системы. После встряхивания пробирки вновь помещают в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке исследуемой сыворотки (таблица N 3).

Таблица 3

Методика постановки качественной реакции Борде-Жангу

-------------------------------------------------------------------------

         Ингредиенты (мл)           |            NN  пробирок

     (общий объем -  1,25 мл)       |------------------------------------

                                    |     1     |      2    |3 (контроль)

-------------------------------------------------------------------------

  Испытуемая      инактивированная      0,25         0,25        0,25

сыворотка крови, разведенная 1 :5

-------------------------------------------------------------------------

  Антиген  гонококковый N   1, раз-     0,25         -           -

веденный по титру

-------------------------------------------------------------------------

  Антиген гонококковый  N   2, раз-     -            0,25        -

веденный по титру

-------------------------------------------------------------------------

Изотонический    раствор   натрия       -            -           0,25

-------------------------------------------------------------------------

  Комплемент,   разведенный  по ра-     0,25         0,25        0,25

бочей дозе

-------------------------------------------------------------------------

          Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут

-------------------------------------------------------------------------

Гемолитическая система                  0,5          0,5         0,5

-------------------------------------------------------------------------

Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45-60 минут (до наступления гемолиза в контрольной пробирке испытуемой сыворотки крови).

Оценка результатов.Для обозначения позитивности реакции Борде-Жангу пользуются системой четырех плюсов. Полная задержка гемолиза в опытных пробирках расценивается как резкоположительный результат (4+), значительная задержка гемолиза - положительный (3+), частичная задержка гемолиза - слабоположительный (2+ и 1+), незначительная задержка гемолиза - сомнительный (+-). Полный гемолиз в опытных пробирках расценивается как отрицательный результат реакции.

Результаты реакции будут ошибочны при: 1) несоблюдении условий и срока хранения испытуемой сыворотки крови, антигенов, комплемента, гемолитической сыворотки, эритроцитов барана; 2) нарушении условий и методики постановки реакции; 3) исключении из постановки контрольных положительных и слабоположительных сывороток крови; 4) неправильно выбранной рабочей дозе комплемента (избыток или недостаток его в опыте); 5) использовании при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток.

Примечание: Указанные ошибки при постановке реакции приводят к появлению как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов.

Количественный метод. Этим методом определяют титр антител в положительных сыворотках крови путем исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся количеств сывороток крови, разведенных изотоническим раствором натрия хлорида. Количественный метод реакции Борде-Жангу ставят с положительными сыворотками крови, давшими 4+. Сыворотки крови в день постановки реакции повторно прогревают при 56° 15 минут.

Каждую испытуемую сыворотку крови исследуют в 8 пробирках. В первую пробирку наливают 0,8 мл изотонического раствора натрия хлорида, со второй по седьмую пробирки - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку вносят 0,2 мл инактивированной испытуемой сыворотки крови, содержимое перемешивают и по 0,25 мл переносят во вторую и восьмую (контрольную) пробирки, затем 0,25 мл выливают. Из второй пробирки после перемешивания переносят 0,25 мл в третью, из третьей - четвертую и т. д. до седьмой пробирки, из которой 0,25 мл разведенной сыворотки крови выливают. Затем приливают по 0,25 мл гонококкового антигена, разведенного по титру с первой по седьмую пробирку. В восьмую (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. После встряхивания во все восемь пробирок добавляют по 0,25 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Первичная инкубация в термостате при 37° продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5 мл гемолитической системы. Встряхнув пробирки, их помещают в термостат при 37° на 45-60 минут и после наступления полного гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результат реакции (таблица 4).

Таблица 4

Методика постановки количественной реакции Борде-Жангу

-------------------------------------------------------------------------

         Ингредиенты (мл)        |        NN пробирок

     (общий объем -  1,25 мл)    |---------------------------------------

                                 |  1 |  2 |  3 |  4 |  5 |  6 |  7 |  8

                                 |    |    |    |    |    |    |    |(ко-

                                 |    |    |    |    |    |    |    |нтр-

                                 |    |    |    |    |    |    |    |оль)

-------------------------------------------------------------------------

  Изотонический раствор натрия

хлорида                           0,8  0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 -

  Испытуемая инактивированная сы-

воротка крови                     0,2

-------------------------------------------------------------------------

                                    После перемешивания   из  1  пробирки

                                  0,25 мл удаляют,  а во 2 и  8  пробирки

                                  переносят  по  0,25  мл.  Из 2 пробирки

                                  после перемешивания переносят  последо-

                                  вательно из пробирки в пробирку (из 2 в

                                  3, из 3 в 4 и т. д. до 7 пробирки вклю-

                                  чительно) по 0,25 мл.

                                    Из 7 пробирки 0,25 мл удаляют.  Полу-

                                  чают  разведения сыворотки крови в про-

                                  бирках соответственно

                                 1:5  1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:5

-------------------------------------------------------------------------

  Антиген гонококковый, разведен-

ный по титру                      0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25  -

-------------------------------------------------------------------------

  Изотонический раствор натрия

хлорида                           -    -    -    -    -    -    -    0,25

-------------------------------------------------------------------------

  Комплемент, разведенный по ра-

бочей дозе                        0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

-------------------------------------------------------------------------

     Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут

-------------------------------------------------------------------------

  Гемолитическая система          0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5

-------------------------------------------------------------------------

                                    Встряхнуть, поместить в термостат при

                                  37°  на 45-60 минут до наступления пол-

                                  ного гемолиза  в  контрольной  пробирке

                                  испытуемой сыворотки крови

-------------------------------------------------------------------------

  Результат                       4+   3+    -   -    -    -    -    -

-------------------------------------------------------------------------

                    В данном  случае титр сыворотки крови 1:10

Оценка результатов. Титром антител исследуемой сыворотки крови является последнее разведение, давшее положительный результат.

Лабораторная диагностика трихомониаза

В связи с широким распространением мочеполового трихомониаза среди населения и наличием трудно диагностируемых хронических и торпидно протекающих форм этого заболевания большое значение приобретает правильное применение с диагностической целью существующих лабораторных методов исследования.

Основными очагами трихомонадной инвазии являются мочеиспускательный канал у мужчин, влагалище, цервицервикальный канал, уретра у женщин. Последняя поражается не менее, чем у половины больных, нередко наблюдается изолированное воспаление уретры. У мужчин, кроме уретры, трихомонады могут вызывать воспаление предстательной железы, семенных пузырьков, придатков яичек, куперовых желез, мочевого пузыря; восходящая, инфекция мочевых путей (пиелонефриты и пиелиты) встречается реже. В воспалительный процесс у женщин часто вовлекаются большие вестибулярные железы, ходы Скене, мочевой пузырь и область Льетодиева треугольника. Влагалищные трихомонады могут проникать в полость матки. В отдельных случаях их находят в сактосальпинксах и кистах яичников.

Таким образом, как и гонорея, мочеполовой трихомониаз протекает по типу многоочагового заболевания, поэтому исследования на трихомонады необходимо проводить из всех возможных очагов поражения.

Клинический диагноз трихомониаза во всех случаях должен быть подтвержден обнаружением типичных форм влагалищных трихомонад при лабораторном исследовании.

У мужчин из мочеиспускательного канала материал для исследования на трихомонады берут после 4-5 часовой задержки мочи. Ввиду того, что в свободно стекающей капле из уретры трихомонады удается обнаружить сравнительно редко, необходимо исследовать отделяемое после удаления свободно стекающей капли, а также центрифугат свежевыпущенной первой порции мочи. Лучшие результаты получают при исследовании материала, взятого при соскобе со слизистой уретры с помощью ложки Фолькмана, тупой ушной ложки или желобоватого зонда.

У женщин материал для исследования берут путем соскоба со стенок влагалища в области заднего свода, а также из уретры с помощью легкого поскабливания переднебоковых стенок ложкой Фолькмана, тупой ушной ложкой или желобоватым зондом, предварительно смоченных изотоническим раствором натрия хлорида. У девочек патологический материал берут из глубины влагалища также с помощью ложки, введенной через отверстие в девственной плеве.

Для повышения качества лабораторной диагностики трихомониаза необходимым условием является прекращение применения противотрихомонадных средств за 7-10 дней до взятия материала. Даже однократное спринцевание или введение противотрихомонадных препаратов может обусловить отрицательные результаты исследования.

Для лабораторной диагностики трихомониаза применяются следующие методы: 1) микроскопическое исследование нативного препарата; 2) микроскопическое исследование окрашенного препарата; 3) культуральное исследование путем посева на питательную среду.

Микроскопическое исследование нативного препарата

При исследовании нативных препаратов материал наносят на слегка подогретое предметное стекло, смешивают с каплей теплого изотонического раствора натрия хлорида, накрывают покровным стеклом и исследуют в микроскопе с объективом 40 и окуляром 10Х. Ввиду того, что при длительном пребывании препаратов при комнатной температуре трихомонады довольно быстро теряют подвижность, исследование следует проводить непосредственно после получения материала.

В нативных препаратах влагалищная трихомонада узнается по грушевидной или овальной форме тела величиной немного большей лейкоцита, характерным толчкообразным движениям и жгутикам, которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с темнопольным или фазовоконтрастным конденсором.

При исследовании нативных препаратов влагалищные трихомонады иногда смешивают со жгутиковыми семейства бодонидов, которые могут быть занесены в препарат из воды, загрязненной посуды и т. д. В отличие от трихомонад, бодониды имеют лишь 2 жгутика и очень быстро двигаются по прямой. К ошибкам может привести и наличие в препарате подвижных бактерий, которые, прикрепляясь к лейкоцитам, создают впечатление наличия большого количества подвижных трихомонад.

Микроскопическое исследование окрашенного препарата

Преимуществом исследования трихомонад в окрашенных препаратах является возможность изучения их спустя длительное время после взятия материала. В повседневной практике наиболее широко применяют окраску высушенных на воздухе и фиксированных препаратов 1% раствором метиленового синего или по способу Грама, что позволяет выявлять трихомонады при одновременном исследовании мазков на гонококки. Хорошие результаты получают при использовании для окраски препаратов 0,5% водного раствора бриллиантового зеленого.

В окрашенных препаратах метиленовым синим или по Граму, трихомонады имеют овальную, круглую или грушевидную форму с хорошо выраженными контурами и нежноячеистым строением цитоплазмы, ядро расположено эксцентрично, интенсивно окрашено.

Для выявления более тонкого строения трихомонад применяют более сложные методики окраски препаратов (по Романовскому-Гимза, Лейшману-Романовскому), которые позволяют видеть жгутики, ундулирующую мембрану и т.д. По Романовскому-Гимза мазки окрашивают в течение 1 часа 5% раствором азурэозина в дистиллированной воде. Окраску препаратов по Лейшману-Романовскому производят следующим образом. Краску Лейшмана (0,25 г сухого порошка краски, 25 мл метилового спирта, 12,5 мл глицерина) наносят на нефиксированный мазок и оставляют в течение 20-30 секунд, после чего смывают водопроводной водой и докрашивают по Романовскому-Гимза (1 мл азурэозина растворяют в 30 мл дистиллированной воды, раствор краски готовят ex tempore) в течение 1 часа, после чего краску смывают водопроводной водой. Окрашенные препараты высушивают на воздухе.

Значительно повышают выявляемость трихомонад повторные анализы, в частности, с использованием провокации, а также применение культурального метода в комплексе с другими методами исследования. При обследовании на трихомониаз применяют только алиментарный (острая, соленая пища) и механический (массаж на буже, металлический колпачок на шейку матки) способы провокации; инстилляции и смазывания препаратами серебра и раствором Люголя не проводят, так как последние губительно действуют на влагалищную трихомонаду и затрудняют ее обнаружение. Мазки, в которых обнаружены трихомонады, должны сохраняться в лаборатории 3 месяца.

Культуральный метод исследования

Наиболее широкое распространение для культуральной диагностики трихомониаза получили питательные среды, в состав которых входят асцитическая жидкость, солянокислый цистеин, сыворотки крови, пищевой белок (мясо, печень) и т. д. Общим недостатком таких сред является нестандартность их основы, трудоемкость приготовления, дефицит составных частей и ограниченные сроки хранения.

В ЦКВИ было разработано 4 варианта жидкой питательной среды из стандартных ингредиентов, используемых при изготовлении безасцитных питательных сред для выделения гонококков. Особенностью этой среды является возможность изготовления непосредственно перед употреблением.

Рецепты среды

Вариант N 1: солевой раствор - 100 мл, гидролизат казеина для парентерального белкового питания - 10 мл дрожжевой аутолизат - 10 мл, сыворотка крови лошади или крупного рогатого скота без консерванта - 30 мл, 20% раствор мальтозы - 10 мл, пенциллин и стрептомицин - по 160000 ЕД (среда СКДС).

Вариант N 2: содержит в своем составе 10 мл 5% раствора гемогидролизата для культур тканей вместо гидролизата казеина. Остальные ингредиенты берутся в тех же количествах как и в среде N 1 (среда СГДС).

Вариант N 3: содержит в своем составе 10 мл 10-кратного концентрата среды 199 для культур тканей вместо гидролизата казеина, остальные ингредиенты берутся в тех же количествах как в среде N 1 (среда СДС-199).

Солевой раствор, раствор мальтозы и метиленового синего готовят в лаборатории или заказывают в аптеке. Состав солевого раствора в смеси с метиленовым синим: хлористый натрий - 6,5 г, хлористый калий - 0,14 г, хлористый кальций - 0,12 г, бикарбонат натрий - 0,2 г, 0,5% раствор метиленового синего - 0,5 мл, дистиллированная вода - 1 л. Стерилизация в автоклаве при 120° 30 минут.

20% раствор мальтозы стерилизуют кипячением 20 минут.

Дрожжевой аутолизат готовят в лаборатории по методике, описанной ранее.

Приготовление среды: приведенные в рецептах растворы в указанном объеме сливают в стерильную колбу, смешивают, доводят рН до 6,3, добавляют антибиотики из расчета 1000 ЕД каждого на 1 мл полученной смеси, вновь смешивают, разливают по 5 мл в стерильные пробирки, поверхность среды в которых заливают стерильным вазелиновым маслом (толщина слоя - 5 мм). Хранят до употребления при 4° не более двух недель.

Вариант N 4: среда из смеси гидролизата казеина для парентерального белкового питания (8,3 мл) и раствора гидролизина (16,7 мл), 125 мл дистиллированной воды; к смеси добавляют 0,9 г хлорида натрия, по 0,15 г хлорида калия, кальция и бикарбоната натрия, 0,045 г метабисульфита натрия, 1,5 г мальтозы, 3,75 мг оротовой кислоты, рН среды доводят до 6,0-6,3, среду стерилизуют при 112° в течение 20 минут, после охлаждения добавляют 30 мл стерильной сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота без консерванта, 100000 ЕД пенициллина, 100000 мкг стрептомицина, 7200 ЕД амфоглюкамина.

При выращивании на жидких питательных средах влагалищные трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой берут материал для исследования в нативном препарате. Микроскопическое исследование культур следует производить на 3-5, а при отрицательных результатах - повторно на 7-9 и 11-17 день после посева, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от величины посевной дозы.

Названные в данных указаниях методы исследования в диагностике гонореи и трихомониаза унифицированы*(6), обязательны к применению, использование модификаций недопустимо.

Контроль за качеством бактериологических и других исследований для диагностики гонореи и трихомониаза возложен на соответствующие лаборатории и республиканские научно-исследовательские кожно-венерологические институты и республиканские, областные (краевые) кожно-венерологические диспансеры*(7).

Методика осуществления контроля изложена в "Методических рекомендациях по организации контроля качества бактериоскопических и бактериологических исследований на гонорею", N 10-8/20, утвержденных Минздравом СССР 23 марта 1979 года.