Приложение 5.6. (обязательное). Бактериологический метод контроля эффективности работы парового стерилизатора (Извлечение из "Методических указаний по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов" 1991 г. (N 15/6-5 Минздрав СССР)

Приложение 5.6.

(Обязательное)

Бактериологический метод контроля эффективности работы парового стерилизатора (Извлечение из "Методических указаний по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов" 1991 г. (N 15/6-5 Минздрав СССР)

1. Бактериологический контроль работы стерилизаторов проводят после монтажа и ремонта аппаратуры, а также в процессе его эксплуатации (плановый - 2 раза в год и при получении неудовлетворительных результатов контроля).

Контроль эффективности работы стерилизаторов осуществляют бактериологическим методом, используя биотесты на основании гибели спор тест-культуры. Биотесты представляют собой флаконы из трубки стеклянной для лекарственных средств ФИ/1-5 нс 1 ТУ 64-0709-10-88 (инсулиновые флаконы) или чашечки из алюминиевой фольги (диск размером 14 мм с луночкой-вдавление от неоточенного края карандаша), содержащие высушенные споры тест-культуры Вас. stearothermophilus ВКМ В-718, помещенные в пакеты из упаковочной бумаги (ОСТ 42-21-2-85). Упаковочные тесты нумеруют и размещают в контрольные точки паровых стерилизаторов (5-10 тестов). По окончании стерилизации биотесты подвергают бактериологическому исследованию.

2. Штамм Вас. stearothermophilus ВКМ В-718 подвижная термофильная палочка, по Граму окрашивается положительно, культивируется при температуре 55 +- 1°С, исключающей развитие других широко распространенных микроорганизмов. Споры овальные, расположенные центрально. На мясопептонном бульоне (рН 7,3 +- 0,1) через 24 часа образует помутнение среды, на мясо-пептонном агаре (рН 7,3 +- 0,1) - слабо выпуклые колонии диаметром 2-4 мм с ровным краем. Штамм непатогенен для человека и животных. Штамм получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов, хранится в музее культур НИИ профилактической токсикологии и дезинфекции (117246 г.Москва, Научный проезд, 18).

Приготовление биотеста

В ампулу с лиофилизированной культурой вносят 0,2 мл. стерильной водопроводной воды и оставляют в течение 30 минут при комнатной температуре.

Одну-две капли культуры засевают в 2 пробирки с бульоном (МПБ, Хоттингера, питательный сухой) с 0,5% глюкозы. Суточную культуру засевают на пробирки скошенного агара (Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный). Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным картофельнопептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55° в течение 10-12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой. На 7, 10 и 12 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования. Достаточным количеством считают 80-90 % спор в поле зрения. Культуру смывают стерильной дистиллированной водой. В целях освобождения от вегетативных клеток суспензию прогревают на водяной бане при температуре 65-70° в течение 30 мин, центрифугируют трехкратно с частотой вращения 33, 33 с - 1 (2000 об/мин) по 15 минут, промывая осадок стерильной дистиллированной водой после каждого центрифугирования. Отмытые споры суспендируют в стерильной дистиллированой воде в соотношении 1 : 1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками (срок хранения 2 года).

Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые пластинки.

     Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной  суспензии

                            -7

десятикратно разводят  до 10   стерильной дистиллированной водой, высевая

                                                        -5   -7

на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл  ориентировочно  из 10  -10  )  (предел

разведения зависит от титра полученных спор). Посевы инкубируют в течение

48 часов, проводят подсчет выросших колоний. Титр жизнеспособных  спор  в

исходной суспензии определяют как среднее арифметическое число колоний  с

учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

     Пример расчетов. Предположим, что при посеве на три  чашки  Петри  с

                                          -5

агаром суспензия в разведении 1:100000 (10  ), подсчитано 140, 110 и  134

                                               -6

колонии. Аналогичные высевы  из  разведений  10   привели  к  образованию

                          -7

12 ,14 и 16 колоний; из 10  - 5, 3 и 7  колоний.  Вычисляем  общее  число

колоний, а затем среднее количество колоний для каждого  разведения  128,

14 и 5

     Из расчета посевной дозы (0,1 мл на  каждую  чашку)  вычисляем  титр

жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведения,  далее

находим среднее арифметическое число колоний:

                  5              7

     128 х 10 х 10  = 12 х 8 х 10

                 6            7

     14 x 10 х 10  = 14,0 х 10

                7            7

     5 х 10 х 10  = 50,0 х 10 ;

     Таким образом, титр исходной суспензии составит:

                                7             8

     (12 х 8 + 14,0 + 50,0) х 10  : 3 = 2,5 10  спор в 1 мл.

     Исходная суспензия должна содержать не менее

             7          8                                      5        6

     2,5 х 10 - 2,5 х 10 спор в 1 мл. Споры в количестве 5 х 10 - 5 х 10

вносят  из  исходной  суспензии  с  помощью  дозатора  пипеточного    (ТУ

64-1-3329-81) в 0,02 мл в носители (стерильные инсулиновые  флакончики  с

ватно-марлевой пробкой или чашечки из алюминиевой фольги,  разложенные  в

чашки Петри), подсушивают в термостате  при  37°  или  в  эксикаторе  над

осушителем (силикагель, хлористый кальций) при  комнатной  температуре  в

течение 24 часов.  Для  определения фактической обсемененности  исследуют

не менее 3-х биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки)  вносят  по

1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из  алюминиевой  фольги,

отмывают в широкогорлых пробирках с бусами  в  10  мл)  и  встряхивают  в

течение 10 минут на аппарате для  встряхивания  жидкостей  с  последующим

высевом на  3  агаровые  пластинки  по           0,1 мл суспензии из трех

последовательных десятикратных разведений.

     3. Определение устойчивости спор тест-культур  к  действию  водяного

насыщенного  пара  под  избыточным  давлением  проводят  при  температуре

120 +- 2°С.

     Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной коробке  в

камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере

                             2

0,11+0,01 МПа (1,1+0,1 кгс/см ) проводят продувку парового  стерилизатора

(вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение  10

минут при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от

                                        2

0,01  до  0,02 МПа (от 0,1 до 0,2 кгс/см ).   После   продувки    доводят

давление пара  в  стерилизационной камере до 0,11 +- 0,01 МПа (1,1 +- 0,1

      2

кгс/см ) температура 120+-2°С и через 5  минут  (времени  выживания  спор

тест-культуры)  с  момента  установления  давления  спускают  пар.    Для

уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления

проводят максимум в течение 8 минут, спуск - в течение 3 минут.

Аналогичное исследование проводят в течение 15 минут времени выдержки (время гибели спор тест-культуры). Контроль температуры осуществляют максимальным термометром. По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое исследование.

Партию биотестов считают годными для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют вышеописанным требованиям.

4. Для определения эффективности работы стерилизатора в обеззараженные биотесты и контрольный (без стерилизации) стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55 °С в течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на агаровые пластинки, из проросших емкостей. При использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению красного цвета среды (рН 7,7 +- 0,1 на желто-оранжевый (рН 6,7 +- 0,1) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты.

В целях исключения ложного отрицательного результата (при наличии роста тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы (пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми пробками (N 7,5; 12,5).

Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность работы стерилизатора. Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения.

При наличии роста тест-штаммов проводится повторный контроль на удвоенном количестве биотестов. Если и при повторной проверке тест-культуры не инактивируются осуществляют тщательный контроль технического состояния аппарата и контрольно-измерительных приборов. При отсутствии роста тест-культур в контрольном биотесте (не подвергшемся стерилизации) устанавливается причина (нежизнеспособность тест-культуры, несоблюдение методики приготовления биотестов, питательных сред, условий культивирования).

5. Для спорообразования используют:

- картофельнопептонный агар (пептон - 5,0, мел - 1,0, агар - 25,0, картофельная вода - 1000 мл, рН 7,1 +- 0,1. Сырой картофель (200 г очищенного картофеля на 1 л водопроводной воды) тщательно моют, очищают от кожуры и глазков, нарезают мелкими ломтиками, заливают водопроводной водой и кипятят 30 мин. после закипания (молодой картофель употреблять нельзя). Отвар отстаивают и фильтруют в холодном состоянии через ватно-марлевый фильтр. Доводят объем фильтрата до первоначального. Устанавливают рН 7,1 +- 0,1 Добавляют пептон и агар. Нагревают, помешивая до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего добавляют мел. Разливают по флаконам, стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. После стерилизации среду во флаконах скашивают; - пшеничный агар (пшеничная крупа "Артек" или "Полтавская" - 500,0 , агар - 25,0 , дистиллированная вода - 1000 мл), рн 7,3 +- 0,1.

Пшеничную крупу "Артек" ("Полтавская") заливают дистиллированной водой. Через 12 часов настой аккуратно сливают, не выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар и растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 час). Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают рН 7,3 +- 0,1. Разливают во флаконы. Стерилизуют текучим паром по 1 часу в течение 3 суток. После стерилизации среду скашивают.

     6. Для контроля используют бульон Хоттингера рН 7,3, агар Хоттингера

РН 7,3, питательный бульон сухой рН     7,1 (Дагестанский НИИ питательных

сред) , питательный агар сухой  рН      7,3 (Дагестанский НИИ питательных

сред), среда питательная для  контроля  стерильности  сухая  (предприятие

Центрального   НИИВС   им.И.М.Мечникова)  рН   7,0,  бульон  из  перевара

кровяных  сгустков,  полусинтетическая  среда  с  индикатором   феноловым

красным РН 7,7 (аммоний  фосфорно-кислый  однозамещенный  -  NH40H2P04  -

1,0 г; магний серно-кислый MgSО  - 0,2 г, калий хлористый - КС1 - 0,2  г,

                               4

глюкоза - 5.0 г,  феноловый  красный  -       0,02 г, бульон Хоттингера с

содержанием аминного азота - 140-160 мг % - 200 мл, дистиллированная вода

- 800 мл, рН 7,7 +- 0,1. Компоненты смешивают и растворяют при нагревании

на водяной бане, доводят рН  до         7,7 +- 0,1, разливают во флаконы,

стерилизуют при 110°С в течение 30 минут).