Приложение 18. Инструкция по определению иммунных антител групповой системы АВО

Приложение 18

Инструкция
по определению иммунных антител групповой системы АВО
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

I. Введение

Антитела системы АВО - альфа и бета являются нормальными (естественными) у человека. Они относятся к полным антителам - агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются при комнатной температуре и хуже при температуре 37°С. Добавление в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител, непрямой пробой Кумбса их не выявляют.

Нормальные антитела альфа и бета легко абсорбируются из сыворотки при добавлении групповой субстанции Витебского. Они чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при 70°С в течение десяти минут достаточно, чтобы эти антитела полностью потеряли активность.

Кроме нормальных (естественных) антител альфа и бета у человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы, которые в отличие от нормальных были обозначены символами анти-А и анти-В.

Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном поступлении в организм несовместимого в групповом отношении антигена, при иногрупной беременности, при ошибочном переливании крови, несовместимой по системе АВО, а также при проведении некоторых прививок и иммунизации.

При иногрупной беременности, послужившей причиной гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А или анти-В почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения больного ребенка. При этом, им обычно сопутствует высокий титр нормальных антител альфа и бета.

При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные антитела анти-А или анти-В появляются обычно на пятый - седьмой день, достигая максимума к пятнадцатому - двадцать пятому дню с последующим падением их титра.

В крови у таких больных одновременно повышается титр нормальных антител альфа и бета на 3-8 ступеней также с последующим снижением после 25-30 дня.

Иммунные антитела анти-А и анти-В могут быть как в полной так и неполной форме. Они активны при 37°С, могут иметь несколько более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по сравнению с солевой и выявляться в непрямой пробе Кумбса. Иммунные антитела не абсорбируются при добавлении групповоспецифической субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействию и сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут при температуре 70°С, т.е. при условиях, при которых нормальные антитела альфа и бета полностью инактивируются. Выявление изоиммунных антител может служить ценным диагностическим признаком, в частности, при решении вопроса о причинах гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антител альфа и бета от иммунных антител анти-А и анти - В является их поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и основано применение разных методов для выявления нормальных антител альфа и бета и изоиммунных антител анти-А и анти-В (см. разделы II-V). Активность иммунных антител проявляется в виде способности вызывать агтлютинацию эритроцитов при проведении реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой пробе Кумбса.

Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же причинами, могут одновременно образоваться гемолизины, которым свойственна также групповая специфичность (Методы определения групповых гемолизинов см. в разделах II, VI).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте документа допущена опечатка и имеется в виду раздел V настоящей инструкции

II. Оснащение

При определении антител альфа, бета и иммунных антител анти-А, анти-В необходимо следующее оснащение:

- стандартные эритроциты группы А(II) и В(III) или смесь эритроцитов от 5-6 доноров отдельно каждой группы;

- стандартная сыворотка для пробы Кумбса;

- изотонический раствор NаСl;

- пробирки центрифужные;

- пробирки маленькие, высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 5-6 мм и с гладким дном округлой формы;

- пробирки высотой 4-10 см для пробы Кумбса;

- белые пластинки со смачиваемой поверхностью;

- штативы;

- термостат 37°С;

- центрифуга;

- водяная баня 70°С.

III. Определение полных иммунных антител системы АВО
реакцией солевой агглютинации

1. Подготовительная работа

Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и B(III) дважды отмывают изотоническим раствором NаСl путем центрифугирования, после чего на дне пробирки остается эритроцитная масса, из которой приготавливают 2-3% взвеси и отдельно каждой группы.

Исследуемую сыворотку в количестве 0,5-1 мл разводят в четыре раза изотоническим раствором NаCl во избежание коагуляции при нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из которых прогревают в течение 10 минут при 70°С, точно соблюдая температуру и время. Таким образом, получится две порции сыворотки - нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4.

Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой пробой Кумбса.

2. Техника реакции

При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании сыворотки группы О(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверствия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и у каждой пробирки - степень разведения помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 1:8000).

Во все пробирки каждого ряда, начиная со второй, накапывают по две капли изотонического раствора NаСl. Затем в первую и во вторую пробирки (каждого ряда) накапывают по две капли приготовленной непрогретой сыворотки, разведенной в четыре раза.

Во второй пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с изотоническим раствором NаСl и две капли этой смеси переносят в третью пробирку, из третьей, также после перемешивания - в четвертую и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до 1:8000.

В другом штативе также приготавливают разведения предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно достаточно поместить по шесть пробирок - разведение сыворотки от 1:4 до 1:128).

После приготовления разведений сыворотки во все пробирки добавляют по одной капле 2-3 % взвеси стандартных эритроцитов противоположной группы: при исследовании сыворотки группы В(III) - эритроциты группы А(II), при исследовании сыворотки группы А(II) - эритроциты группы В(III) и при исследовании сыворотки группы O(I) в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы А(II), в другой ряд - эритроциты группы В(III).

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой при комнатной температуре, с прогретой - при 37°С.

3. Трактовка результатов

Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне пробирки, просматривая его через лупу с 6-8-кратным увеличением над источником света.

При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-).

Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных антител, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре.

Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к агглютининам альфа (или бета), титр антител в прогретой сыворотке - к иммунным антителам анти-А (или анти-В). В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.

Отрицатьный результат во всех пробирках с прогретой сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы.

IV. Определение неполных изоиммунных антител системы АВО
непрямой пробой Кумбса

1. Подготовительная работа

Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NаСl, после чего на дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для исследования.

2. Техника реакции

При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы О(I) - два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой пробирки ее номер и все другие сведения, как сказано выше для реакции солевой агглютинации.

Во все пробирки, начиная с N 2, накапывают по три капли изотонического раствора NаСl, а затем в пробирки N 1 и N 2 - по три капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода солевой агглютинации, но в объеме трех капель.

Во все пробирки пастеровской пипеткой добавляют по одной маленькой капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы, смешивают сыворотку с эритроцитами и штатив помешают для инкубации в термостат на 45 минут при 37 °С. За это время иммунные антитела, если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах.

После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки доливают изотонический раствор NаСl, перемешивают их содержимое и центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание повторяют три раза.

После отмывания в каждую пробирку добавляют 3-5 капель изотонического раствора NаСl для получения приблизительно 5% взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью, пронумеровав предварительно места на пластинке соответственно номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по одной капле сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой. Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом покачивании пластинки.

Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации, видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) с указанием времени ее появления в секундах и минутах. Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус (-).

Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных антител анти-А или анти-В неполной формы, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре *(15).

В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.

Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции исследуемой сыворотки.

3. Трактовка результатов

В ходе вышеописанного исследования определяются три вида антител:

- нормальные полные антитела - агглютинины альфа и бета (термолабильные);

- иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные),

- иммунные неполные антитела анти-А и анти-В (термостабильные).

Общее заключение делается на основании сопоставления результатов всех исследований:

а) наличие иммунных (термостабильных) антител полной или неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в организм человека антигена, несовместных полных (термолабильных) антител альфа и бета и редко превышает такие показатели, к