Приложение 18. Инструкция по определению иммунных антител групповой системы АВО

Приложение 18

Инструкция
по определению иммунных антител групповой системы АВО
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

I. Введение

Антитела системы АВО - альфа и бета являются нормальными (естественными) у человека. Они относятся к полным антителам - агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются при комнатной температуре и хуже при температуре 37°С. Добавление в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител, непрямой пробой Кумбса их не выявляют.

Нормальные антитела альфа и бета легко абсорбируются из сыворотки при добавлении групповой субстанции Витебского. Они чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при 70°С в течение десяти минут достаточно, чтобы эти антитела полностью потеряли активность.

Кроме нормальных (естественных) антител альфа и бета у человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы, которые в отличие от нормальных были обозначены символами анти-А и анти-В.

Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном поступлении в организм несовместимого в групповом отношении антигена, при иногрупной беременности, при ошибочном переливании крови, несовместимой по системе АВО, а также при проведении некоторых прививок и иммунизации.

При иногрупной беременности, послужившей причиной гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А или анти-В почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения больного ребенка. При этом, им обычно сопутствует высокий титр нормальных антител альфа и бета.

При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные антитела анти-А или анти-В появляются обычно на пятый - седьмой день, достигая максимума к пятнадцатому - двадцать пятому дню с последующим падением их титра.

В крови у таких больных одновременно повышается титр нормальных антител альфа и бета на 3-8 ступеней также с последующим снижением после 25-30 дня.

Иммунные антитела анти-А и анти-В могут быть как в полной так и неполной форме. Они активны при 37°С, могут иметь несколько более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по сравнению с солевой и выявляться в непрямой пробе Кумбса. Иммунные антитела не абсорбируются при добавлении групповоспецифической субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействию и сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут при температуре 70°С, т.е. при условиях, при которых нормальные антитела альфа и бета полностью инактивируются. Выявление изоиммунных антител может служить ценным диагностическим признаком, в частности, при решении вопроса о причинах гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антител альфа и бета от иммунных антител анти-А и анти - В является их поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и основано применение разных методов для выявления нормальных антител альфа и бета и изоиммунных антител анти-А и анти-В (см. разделы II-V). Активность иммунных антител проявляется в виде способности вызывать агтлютинацию эритроцитов при проведении реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой пробе Кумбса.

Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же причинами, могут одновременно образоваться гемолизины, которым свойственна также групповая специфичность (Методы определения групповых гемолизинов см. в разделах II, VI).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте документа допущена опечатка и имеется в виду раздел V настоящей инструкции

II. Оснащение

При определении антител альфа, бета и иммунных антител анти-А, анти-В необходимо следующее оснащение:

- стандартные эритроциты группы А(II) и В(III) или смесь эритроцитов от 5-6 доноров отдельно каждой группы;

- стандартная сыворотка для пробы Кумбса;

- изотонический раствор NаСl;

- пробирки центрифужные;

- пробирки маленькие, высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 5-6 мм и с гладким дном округлой формы;

- пробирки высотой 4-10 см для пробы Кумбса;

- белые пластинки со смачиваемой поверхностью;

- штативы;

- термостат 37°С;

- центрифуга;

- водяная баня 70°С.

III. Определение полных иммунных антител системы АВО
реакцией солевой агглютинации

1. Подготовительная работа

Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и B(III) дважды отмывают изотоническим раствором NаСl путем центрифугирования, после чего на дне пробирки остается эритроцитная масса, из которой приготавливают 2-3% взвеси и отдельно каждой группы.

Исследуемую сыворотку в количестве 0,5-1 мл разводят в четыре раза изотоническим раствором NаCl во избежание коагуляции при нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из которых прогревают в течение 10 минут при 70°С, точно соблюдая температуру и время. Таким образом, получится две порции сыворотки - нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4.

Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой пробой Кумбса.

2. Техника реакции

При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании сыворотки группы О(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверствия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и у каждой пробирки - степень разведения помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 1:8000).

Во все пробирки каждого ряда, начиная со второй, накапывают по две капли изотонического раствора NаСl. Затем в первую и во вторую пробирки (каждого ряда) накапывают по две капли приготовленной непрогретой сыворотки, разведенной в четыре раза.

Во второй пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с изотоническим раствором NаСl и две капли этой смеси переносят в третью пробирку, из третьей, также после перемешивания - в четвертую и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до 1:8000.

В другом штативе также приготавливают разведения предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно достаточно поместить по шесть пробирок - разведение сыворотки от 1:4 до 1:128).

После приготовления разведений сыворотки во все пробирки добавляют по одной капле 2-3 % взвеси стандартных эритроцитов противоположной группы: при исследовании сыворотки группы В(III) - эритроциты группы А(II), при исследовании сыворотки группы А(II) - эритроциты группы В(III) и при исследовании сыворотки группы O(I) в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы А(II), в другой ряд - эритроциты группы В(III).

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой при комнатной температуре, с прогретой - при 37°С.

3. Трактовка результатов

Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне пробирки, просматривая его через лупу с 6-8-кратным увеличением над источником света.

При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-).

Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных антител, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре.

Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к агглютининам альфа (или бета), титр антител в прогретой сыворотке - к иммунным антителам анти-А (или анти-В). В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.

Отрицатьный результат во всех пробирках с прогретой сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы.

IV. Определение неполных изоиммунных антител системы АВО
непрямой пробой Кумбса

1. Подготовительная работа

Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NаСl, после чего на дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для исследования.

2. Техника реакции

При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы О(I) - два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой пробирки ее номер и все другие сведения, как сказано выше для реакции солевой агглютинации.

Во все пробирки, начиная с N 2, накапывают по три капли изотонического раствора NаСl, а затем в пробирки N 1 и N 2 - по три капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода солевой агглютинации, но в объеме трех капель.

Во все пробирки пастеровской пипеткой добавляют по одной маленькой капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы, смешивают сыворотку с эритроцитами и штатив помешают для инкубации в термостат на 45 минут при 37 °С. За это время иммунные антитела, если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах.

После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки доливают изотонический раствор NаСl, перемешивают их содержимое и центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание повторяют три раза.

После отмывания в каждую пробирку добавляют 3-5 капель изотонического раствора NаСl для получения приблизительно 5% взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью, пронумеровав предварительно места на пластинке соответственно номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по одной капле сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой. Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом покачивании пластинки.

Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации, видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) с указанием времени ее появления в секундах и минутах. Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус (-).

Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных антител анти-А или анти-В неполной формы, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре *(15).

В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.

Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции исследуемой сыворотки.

3. Трактовка результатов

В ходе вышеописанного исследования определяются три вида антител:

- нормальные полные антитела - агглютинины альфа и бета (термолабильные);

- иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные),

- иммунные неполные антитела анти-А и анти-В (термостабильные).

Общее заключение делается на основании сопоставления результатов всех исследований:

а) наличие иммунных (термостабильных) антител полной или неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в организм человека антигена, несовместных полных (термолабильных) антител альфа и бета и редко превышает такие показатели, как 1:8 - для иммунных полных антител и 1:32 - для иммунных неполных антител;

б) высокий титр нормальных полных антител - агглютининов альфа и бета (альфа выше, чем 1:256 и бета выше, чем 1:128 при данном методе исследования) даже при отсутствии иммунных термостабильных антител в момент исследования, отражает состояние повышенной сенсибилизации организма и позволяет сделать предположение о бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого по системе АВО.

в) отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В при титре нормальных антител альфа не выше, чем 1:256 и бета не выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы АВО к моменту данного исследования.

V. Определение гемолизинов системы АВО

1. Оснащение

- стандартные эритроциты группы О(I), А (II) и В(III)

- изотонический раствор NаСl

- пробирки вместимостью 8-10 мл

- маленькие пробирки высотой 4-5 см, диаметром 0,8-1,0 см

- штативы

- термостат 37°С

- центрифуга

2. Подготовительная работа

Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III), а также эритроциты исследуемого лица дважды отмывают изотоничеcким раствором NаСl путем центрифугирования и готовят из них 5% взвесь в изотоническом растворе NаСl.

Сыворотку для исследования используют со сроком хранения не более 48 часов при температуре 4-8°С.

В предварительно пронумерованных пяти пробирках вместимостью 8-10 мл готовят разведения исследуемой сыворотки в изотоническом растворе NаСl, начиная от 1:2 до 1:32 в объемах 2-3 мл.

3. Техника реакции

В штатив устанавливают по пять маленьких пробирок: три ряда при исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) или четыре ряда - при исследовании сыворотки группы О(I). Пробирки нумеруют одинаково во всех рядах соответственно нумерации пробирок с исходными разведениями сыворотки.

Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).

Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят соответственно номерам по пять капель в маленькие пробирки так, чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4 и т. д. до 1:32.

Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).

Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят соответственно номерам по 5 капель в маленькие пробирки так, чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4 и т.д. до 1:32.

Затем во все пробирки добавляют по 1 капле 5 % взвеси эритроцитов: в первый (контрольный) ряд пробирок вводят эритроциты лица, сыворотка которого исследуется: во второй (также контрольный) ряд - эритроциты группы О(I); в третий ряд вводят эритроциты противоположной группы, т.е. группы В(III), если исследуется сыворотка группы А(II) или группы А(II), если исследуется сыворотка группы В(III). При исследовании сыворотки группы О(I) в третий ряд вводят эритроциты группы А(II), а в четвертый ряд - эритроциты группы В(III).

Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и штатив помещают на 45 минут при температуре 37°С, затем пробирки вынимают из термостата и рассматривают результат невооруженным глазом в проходящем свете.

4.Трактовка результатов определения групповых гемолизинов

В ходе исследования определяется наличие или отсутствие групповых гемолизинов анти-А и анти-В.

Результаты оценивают по соотношению количества сохранившихся эритроцитов в осадке и степени гемолиза, т.е. интенсивности окрашивания надосадочной жидкости:

- если эритроциты полностью сохранились в осадке, а надосадочная жидкость прозрачна и бесцветна, это значит, групповые гемолизины отсутствуют, что обозначают знаком минус (-),

- если осадок эритроцитов частично сохранился, а надосадочкая жидкость прозрачна и окрашена в красный цвет разной интенсивности (иногда только небольшим слоем над осадком эритроцитов) - это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины различной степени активности (обозначают знаками от одного плюса (+) до трех плюсов (+++),

- если осадок эритроцитов отсутствует, а вся жидкость окрашена в ярко-красный цвет и прозрачна, это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины, что оценивается на четыре плюса (++++), ...

ГАРАНТ:

Нечитаемые фрагменты в тексте документа

Методические рекомендации "Определение иммунных антител групповой системы АВО", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/135, считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления организации медицинской помощи населению

А.И.Вялков