Приложение 6. Инструкция по удалению из сыворотки антирезус антител другой специфичности

Приложение 6

Инструкция
по удалению из сыворотки антирезус антител другой специфичности
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

Общие сведения

В практической работе по определению резус-принадлежности крови наибольшее удобство представляет использование сывороток антирезус группы крови АВ(IV), не содержащих групповых агглютининов альфа и бета. Такие сыворотки являются универсальными, так как позволяют определять резус-принадлежность в крови любой группы по системе АВО.

Сыворотки антирезус, принадлежащие к группам О(I), А(II) и В(III), также могут быть превращены в универсальные путем абсорбции или нейтрализации в них групповых агглютининов альфа и бета.

Помимо групповых агглютининов использованию сыворотки антирезус мешают также имеющиеся в отдельных случаях изоиммунные антитела другой специфичности, чаше всего анти-С и анти-Е. Если эти антитела имеют низкий титр, они могут быть удалены при помощи абсорбции или путем разведения сыворотки.

Использование универсальных сывороток антирезус упрощает работу, повышает эффективность лабораторной службы и исключает получение ошибочных результатов из-за несоответствия группы сыворотки антирезус и исследуемых эритроцитов. Для освобождения сыворотки антирезус от агглютининов альфа, бета и от антител анти-С и анти-Е можно применять разные способы:

а) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета соответствующим групповым веществом, содержащимся в амниотической жидкости (см.п.1)

б) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета естественным групповым веществом А и В (субстанция Витебского) (см. п.2);

в) абсорбцию групповых агглютининов aльфа и бета резус - отрицательными эритроцитами, находящимися в свертках крови после снятия с них сыворотки (см. п.3);

г) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета путем разведения сыворотки (см. п.4);

д) абсорбцию антител анти-С и анти-Е эритроцитами этой специфичности (см. п.5);

е) нейтрализацию антител анти-С и анти-Е путем разведения сыворотки (см. п.6).

1. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета при
помощи амниотической жидкости *(7)

Амниотическая жидкость содержит растворенную групповую субстанцию, соответствующую группе крови плода. Она может быть использована как в нативном виде, так и предварительно высушенная и затем растворенная дистиллированной водой (получение и обработку амниотической жидкости см. п.8).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте документа допущена опечатка и имеется в виду п. 6 настоящей инструкции

Для нейтрализации агглютининов альфа и бета в сыворотке антирезус группы O-aльфа бета(I) используют амниотическую жидкость группы АB(IV) или смесь ... образцов амниотической жидкости групп А(II) и В(III). Для нейтрализации агглютининов бета в сыворотке группы А-бета(II) используют амниотическую жидкость группы В альфа (III). Для нейтрализации агглютининов альфа в сыворотке антирезус группы Ва(III) используют амниотическую жидкость группы А(II).

Для полного истощения групповых агглютининов в исходной сыворотке антирезус проводят подбор оптимального соотношения амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки антирезус, для чего:

- в штатив устанавливают пять пробирок с обозначениями 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6,

во все пробирки вносят по 2 капли амниотической жидкости - нативной или растворенной после высушивания;

- в первую пробирку добавляют 4 капли нейтрализуемой сыворотки, во вторую - 6 капель, в третью - 8 капель, в четвертую - 10 капель, в пятую - 12 капель;

- содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре;

- после 10-ти минутной экспозиции смесь из каждой пробирки контролируют на плоскости на полноту нейтрализации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, содержащими антиген, соответствующий нейтрализуемым агглютининам;

- последнее разведение, в котором отсутствует агглютинация (время наблюдения 5 минут) принимается за оптимальное соотношение амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки;

- если агглютинация отсутствует во всех разведениях, готовят разведения: 1:7, 1:8, 1:9 и продолжают исследование, как сказано выше;

- после того как выбрано оптимальное соотношение, к основному объему сыворотки антирезус добавляют соответствующее количество амниотической жидкости и перемешивают их. Через 10-20 мин. после перемешивания вновь проверяют сыворотку на полноту абсорбции на плоскости с 6-8 образцами резус - отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III).

- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".

Примечание:

В целях упрощения получения универсальных сывороток из сывороток антирезус группы А-бета(II) и В-aльфа(III) их можно предварительно смешивать, что позволяет нейтрализовать одномоментно агглютинины альфа и бета амниотической жидкостью группы АВ(IV) или смесью амниотической жидкости группы А(II) и группы В(III). Предварительное смешивание сыворотки противоположных групп целесообразно еще и потому, что при этом происходит частичная взаимная нейтрализиция групповых агглютининов, что снижает количество амниотической жидкости, необходимое для полной нейтрализации, а, следовательно, снижается степень разведения абсорбируемой сыворотки.

Использование высушенной амниотической жидкости

При низком титре сыворотки антирезус, ограничивающем ее разведение, для нейтрализации агглютининов целесообразно использовать сухой порошок. К нейтрализации приступают так же - с определения оптимального соотношения сыворотки антирезус и сухого порошка, полученного из амниотической жидкости, для чего:

- в штатив устанавливают четыре пронумерованные пробирки, в которые вносят по 0,5 мл сыворотки антирезус;

- в первую пробирку добавляют 2 мг высушенной амниотической жидкости, во вторую - 4 мг, в третью - 8 мг и в четвертую - 16 мг. Содержимое пробирок перемешивают до полного растворения порошка и оставляют при комнатной температуре;

- через 10 минут проводят испытание на плоскости на полноту нейтрализации с эритроцитами групп А(II) и В(III) и выбирают оптимальное соотношение ингредиентов;

- выбранное соотношение используют для изготовления основного объема сыворотки;

- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".

2. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета естественными
групповыми веществами специфичности А и В (субстанция Витебского)

Групповые специфические вещества А и В являются высокомолекулярными полисахаридами, приготавливаются в производственных условиях из слизистой оболочки свиных и лошадиных желудков путем их ферментативного переваривания с последующим осаждением и очисткой органическими растворителями. Количество группового специфического вещества, необходимого для нейтрализации антител в сыворотке, зависит от активности вещества. Для нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке антирезус добавляют групповое специфическое вещество из расчета:

- к 1000 мл сыворотки антирезус группы О(I) - 0,1 г группового вещества А и 0,1 г - группового вещества В;

- к 1000 мл сыворотки антирезус группы А(II) - 0,1 г группового вещества В;

- к 1000 мл сыворотки антирезус группы В(III) - 0,1 г группового вещества А.

Для растворения группового вещества необходимое его количество сначала растирается стеклянной палочкой в пробирке или на часовом стекле с небольшим количеством (1 мл) сыворотки антирезус, подогретой до 37°С, затем это групповое вещество переносят в общее количество сыворотки антирезус, тщательно многократно смывая его сывороткой со стекла. Сыворотку антирезус перемешивают с групповым веществом и помещают в термостат на 3 часа, перемешивая каждые 30 минут.

После этого сыворотку помещают в холодильник при 4°С не менее, чем на трое суток, а затем исследуют на пластинке на содержание групповых агглютининов с 6-8 образцами резус-отрицательной крови группы А(II) и В(III).

Отсутствие агглютинации означает, что групповые агглютинины полностью нейтрализованы. Наличие агглютинации означает неполную нейтрализацию групповых агглютининов. В случае неполной нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке вновь добавляют такое же или большее (до 0,5 г) количество группового вещества и вся процедура повторяется.

При полной нейтрализации групповых агглютининов сыворотку исследуют и обрабатывают далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".

3. Абсорбция групповых агглютининов резус-отрицательными
эритроцитами на свертках крови группы АВ(IV)

Неотмытые свертки крови группы АB(IV), оставшиеся после отсасывания сыворотки антирезус, допустимо хранить при 4-8°С в течение 1-2 суток.

Для абсорбции охлажденный сверток измельчают при помощи стеклянной палочки и добавляют к нему также охлажденную сыворотку антирезус в количестве 1/6-1/3 объема по отношению к объему, занимаемому измельченным свертком (к 300 мл свертка приливают 50-100 мл абсорбируемой сыворотки, в зависимости от активности групповых антител). Сыворотку тщательно смешанную со свертком оставляют на 18-20 часов при 4-8°С, после чего отделяют от свертка путем центрифугирования.

Далее сыворотку проверяют на плоскости с 6-8 образцами резус отрицательных эритроцитов и в случае полной абсорбции групповых агглютининов обрабатывают и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".

4. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета
при помощи разведения сыворотки

Для нейтрализации сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NаСl специально подобранной сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем.

Нейтрализация групповых антител при помощи разведения возможна только лишь при большом различии титра групповых и резус - антител.

Например, если титр групповых антител 1:8, сыворотку следует развести не менее чем в 16 раз, что возможно только в том случае, если титр резус-антител в ней после разведения сохранится не ниже требований, предъявляемых к стандартной сыворотке антирезус.

В процессе работы в начале следует приготовить пробные разведения сыворотки антирезус и исследовать титр резус-антител, а также степень нейтрализации групповых антител с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и B(III).

При сохранении достаточного титра резус - антител и полноте абсорбции групповых антител, разводят основной объем сыворотки антирезус и далее исследуют ее и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".

5. Удаление из сыворотки антирезус сопутствующих
антител анти-С и анти-Е

Если на какой-либо стадии обработки сыворотки антирезус-D выяснится, что в ней содержатся еще и другие антитела антирезус, последние могут быть удалены путем абсорбции или разведения сыворотки.

Абсорбция производится трижды отмытыми эритроцитами, взятыми приблизительно в половинном объеме по отношению к сыворотке. Если в сыворотке имеется примесь антител анти-С, то для абсорбции применяются эритроциты фенотипа Ссddее, а если имеется примесь анти-Е, то эритроциты фенотипа ссddЕе. Абсорбция проводится в течение 2-3 час. при температуре 37°С при помешивании с последующей проверкой сыворотки на специфичность и активность. Если сопутствующие антитела не удалились, сорбцию можно повторить.

Разведение сыворотки антирезус для удаления сопутствующих антител можно проводить при титре антител анти-D не ниже чем 1:128-1:256 и титре сопутствующих антител не выше 1:2.

Сыворотку антирезус разводят изотоническим растворов NaCl, сывороткой-разводителем или стандартным разводителем.

В начале следует делать пробные порции, которые исследовать на полноту нейтрализации сопутствующих антител и на сохранность достаточного титра резус - антител-D. При положительном результате разводят основной объем сыворотки. Как после абсорбции так и после разведения основного объема сыворотки, ее вновь обрабатывают и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".

6. Получение и обработка амниотической жидкости для использования
ее при изготовлении сывороток антирезус

Амниотическую жидкость собирают в родильных домах от каждой роженицы отдельно в чистые флаконы. От одной роженицы может быть получено от 100 до 1500 мл. На этикетке флакона указывают фамилию роженицы, дату взятия, количество и, по возможности, группу крови новорожденного.

Групповая принадлежность амниотической жидкости соответствует группе крови новорожденного.

Оплата за сбор амниотической жидкости производится учреждениями службы крови аналогично оплате за ретроплацентарную кровь из средств на заготовку крови.

Подготовка амниотической жидкости к использованию

Групповую принадлежность амниотической жидкости устанавливают путем определения групповой принадлежности крови новорожденного или методом истощения агглютининов альфа и бета в гемагглютинирующей сыворотке группы О(I). Для этого в пробирке смешивают равные объемы (по 1 мл) стандартной гемагглютинирующей сыворотки с титром 1:32 и испытуемой амниотической жидкости. Смесь перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Затем смесь сыворотки и амниотической жидкости исследуют на плоскости со стандартными эритроцитами группы А(II) и В(III). Соотношение эритроцитов и смеси должно соответствовать примерно 1:10, экспозиция 5-7 минут.

Трактовка результатов

- Наличие агглютинации в каплях с эритроцитами группы А(II) и группы В(III) указывает на отсутствие в амниотической жидкости групповых антигенов А и В, т.е. на принадлежность ее к группе О(I). Такая амниотическая жидкость не пригодна для нейтрализации групповых агглютининов.

- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы А(II) и наличие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе А(II).

- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III) и наличие ее с эритроцитами группы А(II) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе В(III).

- Отсутствие агглютинации в каплях, как с эритроцитами группы А(II), так и группы В(III) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе АВ(IV).

Групповую принадлежность записывают на этикетке, которую наклеивают на флаконе с амниотической жидкостью.

Контроль амниотической жидкости на специфичность

Следует учитывать возможность попадания в амниотическую жидкость крови роженицы, в связи с чем необходимо исследовать каждый образец амниотической жидкости на наличие групповых агглютининов.

Исследование амниотической жидкости с эритроцитами группы А(II) и В(III) проводится аналогично определению групповой принадлежности крови.

Наличие агглютинации означает наличие в амниотической жидкости групповых агглютининов крови роженицы. Такой образец непригоден для работы.

Фильтрация и консервирование амниотической жидкости

После определения групповой принадлежности и контроля на специфичность амниотическую жидкость фильтруют через обычный бумажный фильтр или под вакуумом через фарфоровую воронку Бюхнера, в которую помещает измельченную фильтровальную бумагу толщиной 5-7 мм. После фильтрования амниотическая жидкость становится прозрачной.

Консервирование производится борной кислотой из расчета 2 гр на 100 мл или азидом натрия 1 г на 1000 мл.

Срок хранения амниотической жидкости 12 месяцев при 4-8°С.

Высушивание амниотической жидкости

С целью удлинения срока годности амниотическую жидкость высушивают по 150-250 мл во флаконах емкостью 250-500 мл. На флаконы наклеивают этикетки с указанием группы амниотической жидкости по системе АВО, ее исходного количества и даты высушивания.

Высушенную амниотическую жидкость хранят при комнатной температуре. Срок годности 5 лет. Высушенную амниотическую жидкость перед употреблением разводят дистиллированной водой до исходного объема. После растворения используют аналогично нативной.

Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус антител другой специфичности", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября, 1990 года N 10-11/136, считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления

организации медицинской

помощи населению

А.И.Вялков