Приложение 12. Инструкция по изготовлению редких сывороток, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека

Приложение 12

Инструкция
по изготовлению редких сывороток, предназначенных для определения
различных изоантигенов эритроцитов человека
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

1. Введение

Под редкими группами крови понимаются такие сочетания групповых антигенов в эритроцитах человека, в которых: а) отсутствует какой-либо из антигенов высокой частоты, б) отсутствуют одновременно несколько антигенов, в том числе, активных и высокой частоты, в) содержатся различные редкие антигены; г) имеются редкие сочетания антигенов разных систем.

Под редкими сыворотками подразумеваются сыворотки крови людей, чаще с редкой группой крови, содержащие изоиммунные антитела, редко возникающие у людей вследствие естественной сенсибилизации при беременности. Причиной редкости такой сенсибилизации является редкость или наоборот высокая частота антигенов, против которых могут быть направлены антитела, а также низкая иммуногенная активность некоторых антигенов.

     К   редким   сывороткам   относятся   моноспецифические   сыворотки,

содержащие антитела к какому-либо одному антигену системы резус-С, Е,  с,

    w

е, С , или к одному из антигенов  других  систем  -  Келл,  Даффи,  Кидд,

Левис, Лютеран, МNSs и другие.

     К редким сывороткам  относятся  также  полиспецифические  сыворотки,

содержащие два или более вида  антител,  одними  из  которых  чаще  всего

бывают антитела анти-D,  а  другими-  антитела  редкой  специфичности.  К

таким редким полиспецифическим  сывороткам  относятся  сыворотки  анти  -

                                            а

С+D,  анти-D+Е,  анти-С+D+Е,  анти-D+анти-Fу ,   анти-D+Келл   и   другие

сочетания антител анти-D с какими-либо редкими антителами, а так  же  все

                                                                     а

сочетания только редких антител, например анти-С+е, анти-С +  анти-Fу   и

т.д.

Трансфузионная терапия, проводимая лицам, принадлежащим к редким группам, повышает возможность образования редких антител, особенно, если кровь переливалась повторно и реципиент имел в прошлом беременности.

Реиммунизация соответствующим антигеном, проводимая лицам, иммунизированным естественным путем при беременности или вследствие трансфузий крови еще более повышает возможность образования активных редких антител.

Лица, иммунизированные естественным путем при беременности или вследствие гемотрансфузий, могут привлекаться в кадры доноров с дополнительной реиммунизацией соответствующим антигеном. Привлечение к донорству и реиммунизация для получения редких сывороток проводятся так же, как это предусмотрено для сывороток антирезус ("Инструкцией по иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус").

Реиммунизация допустима для повышения активности любых антител, так как не вносит ничего качественно нового в иммунологический статус иммунизируемого лица, и следовательно, не создает дополнительной опасности в случае необходимости переливания крови.

Эффективной мерой получения некоторых редких сывороток является искусственная иммунизация доноров-добровольцев.

Искусственная иммунизация ранее несенсибилизированных лиц допустима только теми антигенами и при тех условиях, когда это не может повлечь каких-либо осложнений для иммунизируемого лица в смысле возможности неблагополучных исходов последующих беременностей или несовместимости в случае переливания крови.

Исходя из сказанного, а также из того, что потребность в редких сыворотках разной специфичности различна, для получения таких сывороток рекомендуется дифференцированный подход и разные способы.

2. Основное назначение редких сывороток в учреждениях Службы крови

     Моноспецифические сыворотки  антирезус  -  анти-С,  анти-Е,  анти-с,

               w

анти-е,  анти-С , а  также  моноспецифические  сыворотки  других   систем

применяются  наряду  с  сыворотками  анти-D  при  фенотипировании   крови

доноров  для   создания   панели   стандартных   эритроцитов   и   кадров

типированных доноров, в том числе  доноров  редких  групп,  а  также  для

установления фенотипа крови  больных  и  других  лиц  с  целью  выяснения

причин и предупреждения сенсибилизации и трансфузионных осложнений.

Полиспецифические сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е применяются при обследовании доноров и при обработке их крови на втором этапе исследования на резус-принадлежность. При этом сыворотки анти-С+D и анти-D+Е должны быть использованы одновременно или могут быть заменены одной сывороткой анти-С+D+Е (см. "Инструкцию по определению резус - принадлежности").

     Сыворотки,  содержащие  антитела  анти-D  и  дополнительно  антитела

                                  а

других  систем,  например  анти-Fу   или  анти-Келл,  являющиеся  главным

образом случайными находками, могут быть  использованы  при  исследовании

крови резус - отрицательных лиц для определения у  них  антигенов, против

которых направлены дополнительные антитела.

3. Источники и способы получения сыворотки

Для получения моноспецифических сывороток анти-С и анти-Е необходимо выявление лиц, сенсибилизированных естественным путем, и привлечение их к донорству с последующей реиммунизацией.

Допускается искусственная иммунизация этими антигенами доноров добровольцев, которая требует длительных курсов, так как не всегда бывает успешной, особенно для получения активных сывороток анти-С.

Моноспецифические сыворотки анти-с и анти-е следует получать только от лиц, сенсибилизированных естественным путем. Рекомендуется привлечение таких лиц к донорству с последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация антигеном с и антигеном е недопустима, так как в этих случаях нужно было бы иммунизировать резус - положительных лиц, то есть сделать их реципиентами, для которых будет несовместимой вся резус-отрицательная и в большинстве случаев резус-положительная кровь.

     Моноспецифические  сыворотки   анти-Келл,   анти-Даффи,   анти-Кидд,

                      w

анти-S, анти-s, анти-С   следует  получать  от  лиц,  сенсибилизированных

естественным путем.  Поскольку  такие  антитела  возникают  исключительно

редко,  чаще  всего  при  беременности  в   сочетании   с   многократными

трансфузиями крови, то выявление таких сенсибилизированных лиц,  то  есть

первичный поиск редких антител  следует  организовать  с  привлечением  к

этой работе отделений переливания крови при больницах.

     После выздоровления этих лиц желательно  привлекать  к  донорству  с

последующей реиммунизацией.

                                                                        w

     Искусственная иммунизация антигенами Келл, Даффи,  Кидд,  S,  е,  С

разрешается  только  для  ограниченного  числа   доноров   в   институтах

переливания крови, а также  в  Центре  изосерологических  стандартов  при

Нижегородской областной станции переливания крови и  Станции  переливания

крови Комитета здравоохранения г.Москвы.

Моноспецифические сыворотки анти-М, анти-N, анти-Р, анти-Левис могут быть выявлены при массовых обследованиях крови доноров, поскольку такие антитела иногда (очень редко) бывают у людей врожденными. Также редко встречаются такие антитела у лиц, сенсибилизированных естественным путем - беременностями и трансфузиями крови. Таких лиц следует привлекать к донорству с последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация этими антигенами противопоказана.

Систематическое получение сывороток анти-М, анти-N, анти-Р и анти - Левис производятся путем иммунизации животных в учреждениях судебной медицины.

Сыворотки двойной специфичности анти-С+D следует получать от лиц, сенсибилизированных естественным путем с последующим привлечением их к донорству и реиммунизации.

Сыворотки двойной и тройной специфичности - анти-D+Е и анти - С+D+Е могут быть получены почти исключительно путем искусственной иммунизации доноров - добровольцев, так как такое сочетание антител очень редко возникает при естественной сенсибилизации.

Антитела специфичности анти-С+D, анти-D+Е и анти-С+D+E иногда образуются при искусственной иммунизации доноров-добровольцев антигеном D. В этих случаях допустимо продолжение иммунизации с использованием тех антигенов, против которых требуется повысить титр антител.

Сыворотки анти-D в сочетании с антителами какой-либо другой специфичности могут быть получены от лиц сенсибилизированных естественным путем при беременности и трансфузиях крови и при этом на протяжении небольшого срока, так как редкие антитела у таких сенсибилизированных лиц быстро ослабевают или исчезают из крови. Искусственная иммунизация для получения таких сывороток противопоказана.

4. Методы иммунизации и реиммунизации

Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С и анти-Е следует производить согласно инструкции "По иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус".

Реиммунизацию с целью получения антител другой специфичности следует производить аналогично реиммунизации антигенами С и Е с использованием эритроцитов соответствующего фенотипа. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов.

     Иммунизацию антигенами системы Келл, Даффи, Кидд, антигенами  S,  s,

 w

С  следует производить аналогично иммунизации антигенами С и Е.  Возможны

некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов. Иммунизацию  и

реиммунизацию для получения сывороток анти-С+D,  анти-D+Е  и  анти-С+D+Е,

следует производить на фоне уже имеющихся активных антител анти-D,  вводя

те  антигены, против  которых  имеются  дополнительные   антитела.   Дозы

введения антигена аналогичны дозам при  иммунизации  антигенами  С  и  Е.

Длительность курса зависит от срока появления антител.

Иммунизированным и реиммунизированным лицам выдается справка по форме, предусмотренной действующей инструкцией "По иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус" с указанием антигена, которым проводилась иммунизация. Иммунизация животных для получения сывороток анти-М и анти-N, анти-Р, анти-Левис и обработка этих сывороток производится согласно ТУ и лабораторным регламентам на эти сыворотки.

5. Методы и дозы взятия крови

У лиц, содержащих антитела, следует брать кровь для последующего получения сыворотки или плазмы (методом плазмафереза).

Дозы взятия крови и плазмы зависят от состояния здоровья таких лиц и предусмотрены действующими инструкциями "О порядке сбора крови, содержащей изоиммунные антитела, пригодные для изготовления стандартных сывороток" и "По медицинскому освидетельствованию доноров крови".

ГАРАНТ:

См. также Порядок медицинского обследования донора крови и ее компонентов, утвержденный приказом Минздрава РФ от 14 сентября 2001 г. N 364

6. Показатели пригодности редких сывороток для практического использования

Сыворотки должны быть прозрачными или слегка опалесцировать. Допустим красный оттенок цвета, а также желтое окрашивание вследствие присутствия желчных пигментов.

Моноспецифические редкие сыворотки рекомендуются для практического использования при титре полных или неполных антител не ниже 1:16. Ввиду редкости и трудности получения таких сывороток, при хорошем авидитете допускается использование их с титром 1:4.

Сыворотки анти-С+D, анти-D+E и анти-С+D+Е должны иметь титры антител анти-D не ниже: полных - 1:16, неполных - 1:32. Титр антител анти-С и анти-Е как полных, так и неполных должен быть не ниже 1:16.

Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела к антигенам других систем, годны для использования в руках специалистов серологических лабораторий учреждений Службы крови при любом титре антител от 1:4 при хорошем их авидитете. Выдача комбинированных сывороток в другие учреждения допустима лишь при титре всех антител не ниже 1:16. Если в сыворотке, содержащей редкие антитела одной специфичности, одновременно содержатся другие антитела с низким титром и слабым авидититом, то сыворотка нуждается в абсорбции или может быть использована в руках специалистов в институтах, на станциях переливания крови. Выдаче в другие учреждения без абсорбции такая сыворотка не подлежит.

7. Организация поиска и первичное исследование сывороток

Поскольку изоиммунные антитела возникают редко, для получения сывороток редкой специфичности следует организовать работу по выявлению сенсибилизированных лиц как среди резус - отрицательных, так среди резус - положительных больных и доноров с привлечением к этой работе лабораторий, в которых проводятся определение резус - принадлежности крови.

Первичное исследование сывороток лиц с подозрением на сенсибилизацию производится в учреждениях Службы крови, включая отделения переливания крови при больницах. Первичное исследование сывороток лиц, подвергающихся искусственной иммунизации, производится на станциях переливания крови, производящих иммунизацию.

Первичное исследование проводится непрямой пробой Кумбса или реакцией конглютинации с применением желатина для выявления неполных антител и реакцией агглютинации в солевой среде для выявления полных антител.

     С  целью  сокращения  объема  работы  при   первичном   исследовании

сывороток  следует  использовать  эритроциты   с   содержанием   возможно

больного числа антигенов в одном образце; удобнее  всего  фенотип  СсDЕе,

      а

К+, Fу +, Jk+.

В случае отсутствия типированных эритроцитов для выявления антител следует приготовить смеси эритроцитов группы О(I) по 5-6 образцов и использовать 3-4 таких смеси в качестве стандартов, считая каждую смесь за один образец.

Для изготовления стандартов можно использовать эритроциты из осадка крови, взятой из вены со стабилизатором или из места укола пальца.

     При  массовых  исследованиях  крови  выявление  изоиммунных  антител

можно производить одновременно с  определением  резус  -  принадлежности,

подвергая  испытанию  сыворотку  каждого  исследуемого  лица.  При   этом

допустимо предварительно исследовать сыворотку  методом  конглютинации  с

желатиной с помощью одного "стандарта"  эритроцитов.  В  качестве  такого

стандарта следует использовать  смесь  2-3  образцов  резус-положительных

                                                             w

эритроцитов группы О(I), содержащих антигены D, С, Е, с, е, С , Келл,  Fу

и другие.

Кровь лиц, в сыворотке которых выявлены антитела, исследуется далее в лабораториях институтов, станций переливания крови, где устанавливается специфичность, активность и форма антител.

8. Исследование сывороток на специфичность, активность
и форму антител

Исследование сывороток начинается с проверки групповой принадлежности по системе АВО. Затем сыворотка исследуется на специфичность, активность и форму антител. Для исследования применяется непрямая проба Кумбса, метод конглютинации с применением желатина, реакция агглютинации в солевой среде. Следует иметь ввиду, что в одной и той же сыворотке могут содержаться как полные, так и неполные антитела, причем их специфичность может совпадать или быть различной. Так, например, сыворотка может содержать неполные антитела анти-D, анти-С и анти-Е и в то же время полные антитела анти-С и анти-Е или только полные анти-Е. Титр полных и неполных антител также может быть различен.

Широта исследований зависит от возможности станции переливания крови. В тех случаях, когда станция не располагает всеми указанными ниже стандартными типированными эритроцитами, для дальнейшего исследования сыворотка должна передаваться в республиканские станции или в институты переливания крови.

Для полного выявления антител, установления их специфичности, формы и титра следует использовать панель типированных стандартных эритроцитов. Для удобства в панели целесообразно использовать эритроциты группы О(I).

В качестве образцов в панель можно включать эритроциты типированных доноров, для чего берут у них кровь из вены в изотонический раствор цитрата натрия или консервант. Эритроциты перед употреблением отмывают двукратно изотоническим раствором хлорида натрия. Срок хранения таких эритроцитов до отмывания - 2-3 дня, после отмывания - 1 день.

Если кровь взята у донора в стерильных условиях в контейнер с консервантом, применяемым для консервирования крови, она может храниться 1 месяц при +4-8 °С. Перед использованием эритроциты двукратно отмывают изотоническим раствором хлорида натрия. Срок годности отмытых эритроцитов 1 день.

Более эффективно использование эритроцитов доноров редких групп, сохраняемых в замороженном состоянии, лучше в малых объемах - 2-5 мл. Для использования эритроциты отмывают специальными растворами (см. действующие методические рекомендации "Методы долгосрочного хранения в замороженном состоянии эритроцитов, предназначенных для трансфузии"). После отмывания эритроциты используются в тот же день.

В панели должны быть представлены стандартные эритроциты, позволяющие выявлять и идентифицировать антитела в пределах следующих систем: Rh-Нr, Даффи, Келл, Кидд, Левис, МNSs, Лютеран, Р. В зависимости от возможности учреждения, эта панель может быть расширена за счет увеличения образцов или уменьшения, но так, чтобы по возможности были включены как положительные, так и отрицательные образцы для каждого антигена.

Панель включает резус-положительные и резус-отрицательные образцы эритроцитов разных фенотипов. Среди резус-положительных содержащие пять антигенов системы резус - СсDЕе. В этих же образцах имеются в том или ином сочетании антигены всех других систем. Таким образом положительная реакция с этими образцами укажет на наличие в сыворотке любых антител, но без уточнения их специфичности.

Следующие резус-положительные образцы относятся к фенотипам ССDЕе, СсDЕЕ, СсDее, ССDее, ссDЕе и ссDЕЕ. Часть их гомозиготна, а часть - гетерозиготна по антигенам С и Е. Эти образцы необходимы для идентификации антител анти-с и анти-е.

Затем следуют образцы фенотипов ссDеe, Ссddde и сссdEe. Эти образцы дают возможность выявлять специфичность антител в системе резус, причем очень ценным является образец с двойным содержанием антигена С (фенотип ССdее). Этот образец даст возможность идентифицировать антитела в очень редких сыворотках, например, анти-D + анти-с.

     Среди   резус-положительных   образцов   в   панели   должны    быть

                                      u             w            u

разновидности с содержанием антигена D  и антигена С . Образец  D  служит

для  того,  чтобы  установить  достаточно  ли  активны  антитела  анти-D.

                                w                                    w

Образец с содержанием антигена С  служит для выявления антител анти-С .

     Панель включает резус-отрицательные образцы,  положительная  реакция

с которыми указывает на наличие антител по другим системам.  Эти  образцы

содержат разнообразные сочетания антигенов других  систем:  положительные

                               a    b

и отрицательные по антигенам Fу , Fу  и Кидд.

Необходимы Келл - положительные образцы. Некоторые из них чрезвычайно редкого фенотипа, не содержащего второго аллеля этой системы, т.е. Челлано - отрицательные. Келл - положительные образцы подразделяются также в зависимости от наличия или отсутствия в них антигенов Даффи.

Исследование сыворотки с этими образцами позволяет выявить специфичность в пределах этих систем и это очень важно, так как антитела анти - Келл и анти-Даффи являются следующими по частоте после антител антирезус.

     Дальнейшее  подразделение  резус-отрицательных   образцов   включает

различия по системе Кидд и  Левис  с  наиболее  редкими  фенотипами  этой

           а--    b-+    a+    b-

системы -Jk   ; Jk   ; Le  ; Le  .

И наконец в панели представлены фенотипы по другим системам МNSs, Р, Лютеран, причем наибольшую ценность представляют различия по этим системам внутри группы резус-отрицательных образцов.

Использование представленной панели стандартных эритроцитов дает возможность выявлять и определять специфичность полных и неполных антител всех серологических систем как в том случае, когда эти антитела одной специфичности, так и в том - когда антитела различаются и по специфичности и по форме.

     В  практической  работе  исследование  следует  начинать   следующим

порядком: сначала  используются  выборочно  10-12  образцов  эритроцитов,

подобранных с таким расчетом, чтобы выявить сенсибилизацию  к  любому  из

                                           w

основных антигенов резус - D, С, Е, с, е, С .  Среди  резус-отрицательных

включаются  образцы  также  с  максимальным  набором   различных   других

антигенов.

Если сыворотка содержит резус-антитела какой-либо одной специфичности или их сочетание, то агглютинация наступит также с соответствующими образцами эритроцитов.

Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные образцы, имеющие антигены Fу или Келл, то следует произвести дополнительные исследования с включением образцов эритроцитов различного фенотипа по этим антигенам. Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные эритроциты независимо от антигенов Fу и Келл, то панель для исследования следует еще более расширить с включением образцов с различными сочетаниями по системам Кидд, Левис, МNSs и т.д.

Если сыворотка агглютинирует все образцы, взятые для первичного исследования, независимо от резус-принадлежности, то проводятся дополнительные исследования с использованием стандартов, гомозиготных по антигенам С и Е, т.е. не содержащих антигена с и антигена е. Отсутствие агглютинации с этими образцами свидетельствует о наличии соответствующих антител - анти-с и анти-е. При наличии агглютинации с указанными фенотипами следует иметь ввиду другие, широко распространенные антигены, например Челлано и поэтому использовать Челлано - отрицательные стандарты. В случае положительного результата и с этим стандартом следует расширить панель с включением образцов одновременно отрицательных по многим антигенам, так как в этих случаях можно предположить наличие в сыворотке нескольких антител.

Титрование сыворотки. После выявления антител и установления их специфичности и формы