Приложение 8. Инструкция по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели

Приложение 8

Инструкция
по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева
и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус,
предназначенных для этой цели
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

Общие сведения

Методы определении резус-принадлежности на плоскости без подогрева позволяют быстро проводить исследование без применения особого лабораторного оборудования непосредственно у постели больного, а также у доноров как в единичных случаях, так и при массовых обследованиях.

Методы основаны на использовании сывороток антирезус, изготовленных в сочетании с коллоидными растворами (альбумин, полиглюкин), в присутствии которых неполные резус-антитела приобретают способность агглютинировать резус-положительные эритроциты на плоскости при комнатной температуре, аналогично реакции по определению групп крови АВО.

Наиболее удобными для практики являются методы определения на плоскости без подогрева, при помощи сыворотки антирезус, изготовленной в сочетании с альбумином и при помощи реактива антирезус, изготовленного из сыворотки антирезус в сочетании с сухим полиглюкином и альбумином.

1. Определение резус-принадлежности на плоскости без подогрева при
помощи сыворотки антирезус, приготовленной с альбумином
(прилагается при выдаче сыворотки)

Оснащение:

а) специально приготовленная универсальная сыворотка антирезус анти-D в комплекте с контрольной сывороткой;

б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;

в) изотонический раствор NaCl;

г) стеклянные палочки.

Для исследования используют кровь, полученную непосредственно из места укола или взятую заранее в пробирку со стабилизатором, но не более 2 суток хранения при 4-8°С.

Техника реакции

На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется и, сделав соответствующее обозначение, наносят на нее в две точки: слева по 2 капли сыворотки антирезус и справа по 2 капли контрольной сыворотки. Рядом с этими каплями наносят по 1 капле исследуемой крови. Кровь тщательно смешивают с сывороткой стеклянной палочкой и размазывают на пластинке до получения тонкого слоя. Затем пластинку периодически покачивают в течение 4-5 минут и добавляют в обе смеси по 1 капле изотонического раствора NaCl для снятия возможной неспецифической агглютинации. Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут, после чего учитывают результат.

Трактовка результата.

Если слева, то есть с сывороткой антирезус, произошла агглютинация эритроцитов, а справа (контроль) ее нет- кровь остается равномерно окрашенной, без признаков агглютинации, это значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).

Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).

При наличии агглютинации в контрольной капле, что может произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, необходимо исследовать кровь повторно другими методами, желательно в лабораторных условиях.

2. Определение резус-принадлежности при помощи реактива антирезус,
изготовленного с использованием сухого полиглюкина
(прилагается при выдаче реактива)

Оснащение:

а) специально приготовленный реактив антирезус анти-D в комплекте с контрольным реактивом;

б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;

в) изотонический раствор NаСl;

г) стеклянные палочки.

Для исследования используют кровь, полученную непосредственно из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со стабилизатором не более чем за 2 суток до исследования. Кровь хранят при 4-8°С.

Техника реакции

На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется и, сделав соответствующие обозначения, наносят на нее слева 1 каплю реактива анти-резус и справа - 1 каплю контрольного реактива, затем добавляют и к реактиву антирезус, и к контрольному реактиву по 1 капле густой взвеси исследуемой крови.

Кровь тщательно смешивают с реактивом и размазывают по пластинке стеклянной палочкой тонким слоем. Затем пластинку периодически покачивают в течение 3-4 минут и добавляют в обе смеси для исключения неспецифической агглютинации по 5-8 капель изотонического раствора NаСl.

Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут, после чего учитывают результат.

Трактовка результата.

Если слева, т.е. с реактивом антирезус, произошла агглютинация эритроцитов, а справа (в контроле) ее нет - это значит, что исследуемая кровь резус - положительная (Rh+).

Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).

Однако результат учитывают как истинный только при отсутствии агглютинации в контроле.

При наличии агглютинации в контроле, что может произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, кровь необходимо исследовать повторно другими методами, желательно в лабораторных условиях.

3. Изготовление универсальной сыворотки антирезус анти-D
в сочетании с альбумином для определения резус-принадлежности
на плоскости без подогрева

Сыворотка антирезус содержит неполные антитела анти-D. Выпускается в комплекте с контрольной сывороткой, не содержащей резус-антител. Сыворотка предназначена для определения резус-антигена D.

Материалом для изтотовления сыворотки антирезус в сочетании с альбумином служит сыворотка крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленная - универсальная с титром неполных резус-антител анти-D не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана годной, как стандартная сыворотка антирезус в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".

Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как резус-антител, так и групповых агглютининов альфа и бета.

Контрольная сыворотка должна соответствовать требованиям, предъявляемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.

При изготовлении сывороток антирезус в сочетании с альбумином необходимы:

- альбумин 20-30 % раствор, полученный из плазмы крови человека;

- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови, взятой на гепарине;

- гепарин;

- изотонический раствор NаСl.

Работу по изготовлению сыворотки начинают с подбора оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина. Подбор можно вести двумя способами:

а) используя одну и ту же сыворотку антирезус, испытывая с ней разные образцы (серии) альбумина, и выбирая таким образом образец альбумина с высокой конглютинационной активностью;

б) используя один и тот же образец (серию) альбумина, испытывая его с разными образцами сыворотки антирезус.

Выбор альбумина с высокой конглютинационной активностью

Сыворотку антирезус с титром неполных антител 1:64 - 1:128 разводят в пробирках в 2-4 раза отдельно различными образцами раствора альбумина.

Разные смеси сыворотки антирезус с альбумином исследуют на пластинке с 5-6 образцами Rh+ и с 5-6 образцами крови ссddeе, а также с кровью фенотипа Ссddее и сcddEе.

Cыворотку антирезус, смешанную с альбумином, переносят в 2 точки по 2 капли (0,1 мл) на пластинку, добавляют к ней по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли перемешивают и размазывают по пластинке до получения тонкого слоя. Наблюдение ведут до истечения 5 минут при покачивании пластинки.

Учет и оценка результата.

Результат учитывают по скорости наступления и величине агглютинатов резус-положительных эритроцитов и отсутствии агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами. На основании этого отбирают образwы альбумина, наиболее пригодные для использования.

Для последующего использования применяют образцы альбумина, при испытании которых агглютинация резус-положительных эритроцитов появляется в течение первых 20-30 секунд, а неспецифическая аггрегация резус-отрицательных эритроцитов отсутствует до истечения 10 минут.

Подбор сыворотки антирезус с высокой конглютинационной
активностью в альбуминовой среде

Несколько различных образцов сыворотки антирезус наносят отдельно в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку и добавляют к ним по капле (0,05 мл) 20-30% альбумина.

Сыворотку тщательно смешивают с альбумином и добавляют к ней по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли перемешивают с эритроцитами на плоскости до получения тонкого слоя. Наблюдение ведут до 5 минут при покачивании пластинки.

Так поступают отдельно для каждого испытуемого образца сыворотки, испытывая их с 5-6 образцами Rh+ крови и с 5-6 образцами крови ссddее, а также с кровью фенотипа Ссddее и сcddEe.

Учет и оценка результата

Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и по отсутствию с резус-отрицательными эритроцитами ссddее и эритроцитами генотипа Ссddее и ссddЕе.

Для последующего использования выбирают сыворотки антирезус анти-D, при испытании которых четко выраженная агглютинация резус - положительных эритроцитов наступает в течение первых 20-30 секунд, а неспецифическая агглютинация резус-отрицательных эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe отсутствует до истечения 10 минут.

Подбор оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина

После выбора альбумина с наиболее высокой коглютинирующей способностью или, наоборот, выбора сыворотки антирезус с высокой агглютинирующей активностью в альбуминовой среде, приступают к подбору оптимального их соотношения, для чего:

в штатив устанавливают 5 пронумерованных пробирок;

в первую пробирку вносят 2 капли (0,1 мл) выбранной серии альбумина, во вторую пробирку - 4 капли, в третью - 6, в четвертую - 8 и в пятую - 10 капель;

в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) сыворотки антирезус и содержимое тщательно перемешивают;

из каждой пробирки переносят в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку, образуя таким образом 2 ряда сыворотки с альбумином;

во все капли первого ряда вносят по 1 капле (0,05 мл) свежей резус-положительной крови, во 2-ой - резус-отрицательной крови (кровь предварительно берут с гепарином - 1 капля на 10 мл крови). Смесь перемешивают и ведут наблюдение в течение 3 минут при покачивании пластинки.

Учет и оценка результатов

Четкая аглютинация Rh-эритроцитов и отсутствие аглютинации rhэритроцитов ccddee и эритроцитов фенотипа Ссddee и ccddEe указывает на оптимальное соотношение данного образца сыворотки антирезус и альбумина.

Приготовление основного объема (серии) сыворотки антирезус анти-D
в сочетании с альбумином

Для приготовления полного объема (серии) стандартной сыворотки используют выбранные оптимальные соотношения сыворотки и альбумина. И сыворотку и альбумин используют тех же серий, которые применялись для установления оптимального их соотношения.

К изготовленному полному объему смеси сыворотки с альбумином добавляют гепарин из расчета - 1 капля на 20 мл сывортки.

Приготовленную таким образом сыворотку проверяют на пластинках с 5-6 образцами резус-положительных эритроцитов и с 5-6 образцами резус-отрицательных ccddee , а также с эритроцитами фенотипа Ccddee и ccddEe.

При наличии четко выраженной агглютинации с резус-положительной кровью, наступающей через 30-40 сек, и отрицательной реакции с резус - отрицательной кровью ссddee и кровью фенотипа Ссddee и ссddЕe, сыворотку антирезус в сочетании с альбумином считают пригодной в качестве стандартной сыворотки анти-D для определения резус - принадлежности на плоскости без подогрева.

Исследование проводят с одновременным параллельным использованием контрольной сыворотки.

Изготовление контрольной сыворотки

Для изготовления контрольной сыворотки используют изогемагглютинирующую сыворотку группы АВ(IV) и добавляют к ней альбумин того же образца (серии) и в том же количестве и в соотношении, которые были использованы для приготовления данной серии сыворотки антирезус.

Контрольную сыворотку испытывают аналогично тому, как описано выше для сыворотки антирезус. Контрольная сыворотка не должна вызывать агглютинацию эритроцитов.

Консервирование сыворотки

Сыворотку антирезус и контрольную сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл сыворотки.

Розлив и паспортизация сыворотки антирезус и контрольной сыворотки

Сыворотку антирезус разливают по 1-2 мл в ампулы, которые запаивают, или во флаконы, которые плотно укупоривают резиновыми пробками. На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего сыворотку, специфичности сыворотки, метода, для которого она предназначена, количества, номера серии и срока годности.

Контрольную сыворотку разливают, в таких же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и так же наклеивают этикетки. Номер серии контрольной сыворотки повторяет номер серии основной сыворотки антирезус.

Хранение, срок годности и контроль

Сыворотки антирезус, изготовленные в сочетании с альбумином, и контрольные сыворотки хранят при 4-8°С.

Срок годности - 4 месяца.

По истечении срока годности, но при сохранении активности и специфичности сывороток, срок годности может быть продлен еще на 1 месяц.

Выдача сыворотки антирезус

Сыворотка антирезус выдается в комплекте с контрольной сывороткой.

К каждому комплекту прилагают инструкцию по использованию.

    /------------------------------\ /------------------------------\

    |  Наименование учреждения     | |  Наименование учреждения     |

    |        изготовителя          | |        изготовителя          |

    |------------------------------| |------------------------------|

    |   Сыворотка антирезус-D      | |   Контрольная сыворотка      |

    |  для метода на плоскости     | |  для метода на плоскости     |

    |       без подогрева          | |       без подогрева          |

    |    Для всех групп крови      | |    Для всех групп крови      |

    |        системы АВО           | |        системы АВО           |

    |                              | |                              |

    | Серия__________ мл______     | | Серия__________ мл______     |

    | Годна до________________     | | Годна до________________     |

    \------------------------------/ \------------------------------/

Формы этикеток для сыворотки антирезус и контрольной сыворотки.

4. Изготовление реактива антирезус с использованием сухого
полиглюкина для определения резус принадлежности
на плоскости без подогрева

Реактив содержит неполные активные антитела антирезус анти-D, представляет собой вязкий опалесцирующий мутноватый раствор. При хранении может выпадать осадок. Выпускается в комплекте с контрольным реактивом, не содержащим резус-антител.

Материалом для изготовления реактива антирезус служат нативные сыворотки крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленные - универсальные с титром неполных резус-антител не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана годной, как стандартная сыворотка антирезус.

Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как резус-антител, так и групповых антител альфа и бета. Контрольная сыворотка должна ... тов.

ГАРАНТ:

Неразборчивый фрагмент текста в источнике документа

Содержимое капель перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и оставляют на 3 минуты, периодически покачивая пластинку; через 3 минуты во все капли добавляют по 5-6 капель изотонического раствора NаСl, перемешивают и через 2 минуты учитывают результат.

Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты Ссddeе и ссddЕе.

Учет и оценка результатов

Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее с резус-отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа Ссddеe и rccddEe.

Показателем пригодности реактива для последующего использования является наличие крупно-зернистой агглютинации резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1 минуты и отсутствие ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddee) и эритроцитами фенотипа СсddEe и ссddEe.

Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.

Консервирование реактивов

Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл реагента.

Розлив и паспортизация

Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают или парафинируют.

На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого он предназначен, количества, номера серии и срока годности.

Контрольный реактив разливают в такие же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и также наклеивают этикетки с соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива повторяет номер серии основного реактива антирезус.

Соответствовать требованиям, предъявлаемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.

При изготовлении реактива антирезус необходимы:

полиглюкин, высушенный лиофильным способом;

альбумин - 2,5% раствор;

изотонический раствор NаСl;

образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови.

Примечания:

1. Полиглюкин высушивают лиофильным способом на сублимационном аппарате по регламенту, установленному для сушки плазмы. Сушку ведут во флаконах емкостью 250-500 мл.

2. 2,5% раствор альбумина получают из готового 10%-20% раствора альбумина путем разведения его изотоническим раствором NаСl.

Изготовление реактива антирезус

Сыворотку, содержащую антитела анти-D с титром не ниже чем 1:64 - 1:128*(8), переносят во флакон с предварительно высушенным полиглюкином в объеме, равном количеству жидкого полиглюкина, высушенного в данном флаконе. В результате конечная концентрация полиглюкина составит 6%.

Содержимое флакона тщательно перемешивают путем встряхивания до полного растворения порошка полиглюкина.

Изготовление контрольного реактива.

Для изготовления контрольного реактива в другой такой же флакон с высушенным полиглюкином той же серии добавляют стандартный разводитель или 2,5% раствор альбумина так же до исходного объема полиглюкина. Содержимое тщательно перемешивают до полного растворения порошка полиглюкина.

Исследование качества изготовленных реактивов.

Исследование реактивов производят непосредственно после их изготовления с резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами и оценивают по характеру агглютинации и специфичности реакции:

на пластинку помещают два ряда, слева - по две капли (0,1 мл) реактива антирезус и справа - по две капли (0,1 мл) контрольного реактива;

в первый ряд добавляют по одной капле (0,05 мл) резус - положительных эритроцитов, во второй ряд также по одной капле резус - отрицательных эритроцитов. Содержимое капель перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и оставляют на три минуты, периодически покачивая пластинку;

через три минуты во все капли добавляют по 5-6 капель изотонического раствора NаСl, перемешивают и через две минуты учитывают результат.

Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных эритроцитов групп А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты Ссddее и ссddEе.

Учет и оценка результатов

Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа Ссddее и rccddЕе.

Показателем пригодности реактива для последующего использования является наличие крупно-зернистой агглютинации резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1 минуты и отсутствие ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа СсddЕе и ссddЕе.

Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.

Консервирование реактивов

Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл реагента.

Розлив и паспортизация

Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают или парафинируют.

На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого он предназначен, количества, номера серии и срока годности.

Контрольный реактив разливают в такие же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и также наклеивают этикетки с соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива повторяет номер серии основного реактива антирезус.

      /---------------------------\   /---------------------------\

      | Наименование учреждения   |   | Наименование учреждения   |

      |      изготовителя         |   |      изготовителя         |

      |---------------------------|   |---------------------------|

      | Реактив антирезус - D     |   |   Контрольный реактив     |

      | для метода на плоскости   |   | для метода на плоскости   |

      |     без подогрева         |   |     без подогрева         |

      | Серия_________ мл______   |   | Серия_________ мл______   |

      |                           |   |                           |

      | Годен до_______________   |   | Годен до_______________   |

      \---------------------------/   \---------------------------/

Формы этикеток для реактива антирезус и контрольного реактива

Хранение, срок годности и контроль

Реактив антирезус, приготовленный с сухим полиглюкином и контрольный реактив хранят при 4-8°С. Срок годности 4 месяца.

Реактив антирезус и контрольный реактив проверяют на активность и специфичность через месяц.

Выдача реактива антирезус

Реактив антирезус выдается, в комплекте с контрольным реактивом.

К каждому комплекту (или набору комплектов) придается инструкция по использованию.

"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 6 декабря 1990 года N 05-14/38-14 считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления организации медицинской помощи населению

А.И.Вялков