Приложение 2. Инструкция по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО

Приложение 2

Инструкция
по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток
для определения групп крови системы АВО
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

Стандартными изогемагглютинирующими сыворотками являются сыворотки, приготовленные из крови людей и некоторых других жидкостей, содержащие групповые антитела (агглютинины). Сыворотки предназначаются для определения групповой принадлежности крови людей по системе АВО.

Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки представляют собой прозрачную жидкость, окрашенную в соответствии с групповой принадлежностью, и расфасованную в ампулы или флаконы. На этикетке указывают названия учреждения, изготовившего сыворотку, специфичность, титр агглютининов и срок годности.

I. Источники получения сывороток

Источниками для получения стандартных сывороток служат:

а) Кровь, заготовленная без консерванта от донора, предварительно обследованного и содержащего в крови групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток;

б) плазма, полученная при проведении плазмафереза или отделенная из донорской крови, по каким-либо причинам не использованная для лечебных целей и содержащая групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток;

в) дополнительный источник - плевральный транссудат, асцитическая жидкость, если в них содержатся групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток.

II. Условия пригодности стандартной изогемагглютинирующей сыворотки

К стандартной изогемагглютинирующей сыворотке предъявляются следующие требования:

а) сыворотка должна быть специфичной, то есть содержать определенные групповые антитела - альфа (анти-А), бета (анти-В) или оба антитела вместе, и не вызывать неспецифической агглютинации эритроцитов одноименной группы и группы О(I). Сыворотка группы АВ(IV), не содержащая групповых агглютининов, не должна вызывать агглютинации;

б) должна быть активной, что выражается в наступлении первых признаков агглютинации со стандартными эритроцитами групп А1 и В в течение первых 30 секунд и со стандартными эритроцитами группы А2 в течение первой минуты и титром агглютининов по отношению к эритроцитам групп А1 и В не ниже, чем 1:32 и группы А2 - не ниже, чем 1:16.

в) не должна оказывать на эритроциты гемолизирующего действия;

г) должна быть прозрачной. Допускается небольшая опалесценция, что не влияет на качество сыворотки;

д) должна быть окрашена: группа А(II) - в светлосиний цвет, группа В (III) - в красный цвет, группа АВ(IV) - в желтый цвет;

е) должна быть предохранена от инфицирования прибавлением консервирующих средств;

ж) должна иметь точную паспортизацию, т.е, обозначение групповой принадлежности, титра, срока годности, номера серии и наименования учреждения, ее изготовившего. Все эти сведения должны быть обозначены на этикетке, наклеиваемой на флакон (ампулу) со стандартной сывороткой, а также внесены в "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки", в который записывают также сведения о дате изготовления сыворотки и результатах контрольных проверок ее качества.

III. Основные этапы работы по приготовлению
стандартной изогемагглютинирующей сыворотки

1. Предварительное определение пригодности крови донора для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки путем взятия от него крови и отделения от нее сыворотки или путем получения плазмы с помощью проведения плазмафереза. Исследования производятся заранее в пробной порции крови, полученной непосредственно от донора в небольшом количестве.

2. Взятие крови от донора, отделение от нее сыворотки или получение плазмы от донора при помощи плазмафереза.

3. Предварительное определение пригодности плазмы, предполагаемой для передачи в сывороточное отделение для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.

4. Обработка плазмы для получения из нее сыворотки.

5. Сбор остатков крови из флакончиков (пробирок) - спутников в общую емкость, отделение от нее сыворотки (плазмы) и предварительное определение пригодности для изготовления стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.

6. Получение в лечебных учреждениях асцитической жидкости, плеврального транссудата, освобождение их от сгустков фибрина и предварительное определение пригодности этого материала для изготовления из него стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.

7. Определение пригодности сыворотки, плазмы для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки, включающее:

а) определение групповой принадлежности сыворотки (групповых агглютининов);

б) определение способности сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию;

в) определение гемолизирующих свойств сыворотки;

г) определение активности сыворотки;

д) скорость наступления агглютинации;

е) титр агглютининов.

8. Предварительное заключение о пригодности сыворотки.

9. Консервирование сыворотки.

10. Первый контроль сыворотки до розлива.

11. Второй контроль сыворотки до розлива.

12. Фильтрование сыворотки.

13. Окрашивание сыворотки.

14. Окончательное заключение о пригодности сыворотки.

15. Розлив сыворотки.

16. Паспортизация разлитой сыворотки.

17. Контроль разлитой сыворотки.

IV. Методы серологических исследований

1. Определение групповой принадлежности сыворотки при помощи

стандартных эритроцитов.

Определение производится на белой фарфоровой или любой другой белой пластинке со смачиваемой поверхностью, на которой надписывают обозначения: слева "О", в середине "А" и справа "В". Соответственно каждому обозначению на пластинку наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп O(I), А(II) и В(III). На каждую каплю эритроцитов капают одну большую каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки с тем, чтобы соотношение количества эритроцитов и сыворотки было приблизительно 1:10. Эритроциты перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое, потом снова покачивают и одновременно наблюдают результат. Наблюдение проводят в течение 5 минут. Через 3-5 минут в каждую каплю, в которой наступила агглютинация, добавляют 1 каплю (0,1 мл) изотонического раствора NаСl и снова покачивают пластинку.

Результат учитывают по наличию или отсутствию агглютинации в каждой капле. При этом возможны четыре варианта:

- агглютинация наступила с эритроцитами групп А(II) и В(III), но отсутствует с эритроцитами группы О(I). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке двух агглютининов альфа (анти-А) и бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Оальфа бета(I);

- агглютинация наступила с эритроцитами группы В(III) и отсутствует с эритроцитами групп О(I) и А(II). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Абета(II);

- агглютинация наступила с эритроцитами группы А(II) и отсутствует с эритроцитами групп О(I) и В(III). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина альфа (анти-А), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Вaльфа(III);

- агглютинация отсутствует с эритроцитами всех трех групп. Это указывает на отсутствие групповых агглютининов, т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе АВ(IV).

2. Определение способности сыворотки вызывать неспецифическую

агглютинацию.

Эти исследования можно проводить одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов.

Дополнительно в исследование включают 6-8 образцов эритроцитов группы О(I) и одногруппных с исследуемой сывороткой.

Наблюдение результатов с эритроцитами одноименной группы и группы О(I) проводят до 20 минут.

Если испытуемая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов одноименной группы и группы О(I), это значит, что она обладает свойством вызывать неспецифическую агглютинацию. В этих случаях учитывают скорость ее наступления и интенсивность.

3. Определение гемолизирующих свойств сыворотки.

Гемолизирующие свойства сыворотки выявляются одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов. Если при смешивании с эритроцитами сыворотка вызывает их гемолиз, значит, сыворотка обладает гемолизирующими свойствами.

4. Определение скорости наступления агглютинации.

Скорость наступления агглютинации определяют так же, как групповую принадлежность - при помощи стандартных эритроцитов, но с дополнительным включением в реакцию стандартных эритроцитов группы А2. Скорость наступления агглютинации учитывают с помощью секундомера от момента перемешивания сыворотки с эритроцитами до момента наступления первых признаков агглютинации отдельно по отношению к эритроцитам групп А1, А2 и В.

5. Определение титра агглютининов.

Для определения титра агглютининов в исследуемой сыворотке приготавливают разведения ее в изотоническом растворе NаСl. Для этого в штатив ставят 10 пробирок и в каждую из них вносят градуированной пипеткой по 1 мл изотонического раствора NаСl. Затем в первую пробирку той же пипеткой добавляют 1 мл испытуемой сыворотки и перемешивают ее с изотоническим раствором путем встряхивания пробирки. Из этой пробирки 1 мл смеси переносят во вторую и снова перемешивают и так до последней пробирки. В результате в пробирках образуются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.

Непосредственно на пластинке можно приготовить разведения сыворотки в арифметической прогрессии. Для этого следует сделать в пробирке первое исходное разведение (любое).

Например, к одной капле сыворотки добавить 15 капель изотонического раствора хлорида натрия, получив таким образом разведение 1:16. Эту разведенную сыворотку нанести в 6 пронумерованных точек на пластинку: в первую точку - 2 капли, во вторую, третью и все последующие - по 1 капле. Затем добавить изотонический раствор: во вторую точку - 1 каплю, в третью - 2 капли, в четвертую - 3 капли, в пятую - 4 капли, в шестую - 5 капель. Капли перемешивают стеклянной палочкой, начиная с последней точки в направлении к первой. Так получают разведения сыворотки на пластинке: 1:16, 1:32, 1:48, 1:64, 1:80, 1:96.

При определении титра агглютинина альфа2 по отношению к эритроцитам А2 приготавливают дополнительно промежуточное разведение сыворотки 1:24.

Разведения сыворотки можно приготовить, отмеряя сыворотку и изотонический раствор NаСl каплями, для чего используют одну и ту же пипетку.

На пробирках отмечают степень разведения сыворотки. Далее 0,1 мл (одну большую каплю) каждого разведения сыворотки переносят на пластинку, предварительно надписав на ней обозначения степени разведения сыворотки: 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024

Разведения сыворотки можно приготавливать также непосредственно на пластинке. Для этого в десять пронумерованных точек наносят по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NаСl, в первую точку добавляют одну каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки, перемешивают капли, затем той же пипеткой переносят одну каплю смеси во вторую точку и т.д. до десятой, получая таким образом разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.

На пластинку рядом с каждой каплей разведенной сыворотки наносят маленькую каплю (0,01 мл) стандартных эритроцитов соответствующей группы, т.е. эритроциты А, и А2, когда титруют агглютинины альфа и эритроциты группы В, когда титруют агглютинины бета. Соотношение эритроцитов и сыворотки должно быть 1:10.

Каждую каплю стандартных эритроцитов тщательно перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, после чего пластинку покачивают, затем оставляют на 1-1,5 минуты в покое, снова покачивают и одновременно наблюдают результат в течение 5 минут.

Наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила агглютинация стандартных эритроцитов до истечения 5 минут, принимают за титр агглютининов в этой сыворотке.

V. Предварительное заключение о пригодности крови для
изготовления из нее стандартной сыворотки

Основным показателем пригодности крови донора для изготовления из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. скорость наступления агглютинации и титр агглютининов.

Скорость наступления агглютинации должна быть не более чем 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В и не более 1 минуты с эритроцитами группы А2.

Титр сыворотки должен быть: для агглютинина альфа не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1, не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам А2, и для агглютинина бета не ниже, чем 1:32 к эритроцитам В.

При предварительном исследовании непосредственно взятой пробной порции крови титр агглютининов должен быть, хотя бы на одно разведение выше, в виду возможного его падения в процессе обработки и консервирования основной порции крови.

Одновременно следует учитывать, не вызывает ли сыворотка крови неспецифической агглютинации или гемолиза эритроцитов.

Если сыворотка вызывает слабую неспецифическую агглютинацию эритроцитов позднее, чем через 2 минуты, то это не является противопоказанием к использованию этой крови, так как эти свойства при дальнейшей обработке сыворотки обычно исчезают.

Если сыворотка вызывает неспецифическую агглютинацию ранее 2 минут, то брать у донора кровь для приготовления стандартной сыворотки не следует.

Гемолизирующих свойств крови у доноров обычно не наблюдается, но если это имеет место, то брать кровь у донора не следует.

В этом случае так же, как и при выраженной неспецифической реакции, донора следует подвергнуть дополнительному медицинскому обследованию.

Доноров, кровь которых соответствует требованиям, предъявляемым к стандартным сывороткам, следует брать на особый учет с целью дальнейшего использования их крови для изготовления стандартных сывороток.

VI. Взятие крови у донора и отделение от нее сыворотки

Кровь у донора берут из вены в сухой стерильный сосуд. Через 15-30 минут сосуд с кровью встряхивают для отделения свертка от стенки и затем помещают на сутки в холодильник при 4-8°С. Отделившуюся за это время сыворотку отсасывают или сливают в другой сосуд, а сосуд со свертком оставляют еще на одни сутки при 4-8°С. Обычно через одни сутки из свертка отделяется еще некоторое количество сыворотки, которую присоединяют к первой порции. Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки, или азидом натрия из расчета 1 г на 1 мл сыворотки.

Для ускорения свертывания крови сосуд можно поставить сначала на один час в термостат, а затем в холодильник.

Паспортизация. На сосуде с кровью, а затем с сывороткой надписывают паспортные данные, т.е. фамилию, имя и отчество донора, групповую принадлежность, дату взятия крови, количество крови и полученной из нее сыворотки, а также результат исследования пробной порции крови. Эти же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки" (Дальнейшая обработка см. пункт IХ).

Получение сыворотки из крови, оставшейся во флакончиках (пробирках) - спутниках после взятия ее у доноров.

Для изготовления сыворотки может быть использована кровь из флакончиков (пробирок) - спутников. Для этого остатки крови сливают (каждую группу отдельно) в сухие флаконы. На флаконе надписывают группу крови и дату заготовки.

VII. Получение сыворотки из плазмы

При получении сыворотки из плазмы из последней удаляется фибрин. Это можно осуществить несколькими способами:

1. К плазме прибавляют раствор хлорида кальция из расчета 3 мл 20% или 6 мл 10% на 100 мл плазмы. Через 30-40 минут во флаконе образуется сверток. Если сверток пристал к стенке, то флакон следует встряхнуть, чтобы сверток отделился. Флакон с содержимым оставляют на двое суток в холодильнике, после чего отделившуюся сыворотку переливают через воронку с марлей в другой флакон. Сыворотку консервируют и на флакон переносят паспортные данные.

Иногда во флаконе с сывороткой через некоторое время снова выпадает сверток фибрина; в этих случаях сыворотку еще раз переливают через воронку с марлей (с тканью) в другой флакон.

2. К плазме добавляют равный объем одногруппной сыворотки с титром антител не ниже 1:32. Содержимое флакона перемешивают, оставляют на одни сутки при комнатной температуре и затем помещают в холодильник на 10-14 дней. На паспорте флакона дописывают сведения о дате и количестве добавленной сыворотки.

За 10-14 дней образуется плотный сверток фибрина и, кроме того, может исчезнуть свойство вызывать гемолиз или неспецифическую, агглютинацию эритроцитов.

Отделившуюся сыворотку сливают в другой флакон через воронку с тканью, сыворотку консервируют, на флакон наносят паспортные данные.

Паспортизация. Паспортные записи о плазме переносят с флакона на флакон по мере отделения сыворотки. К ним добавляют запись о дате получения сыворотки. Те же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".

Дальнейшая обработка сыворотки (см. пункт IХ).

VIII. Получение сыворотки из плеврального транссудата
и асцитической жидкости

В тех случаях, когда в процессе лечения больному делается пункция грудной или брюшной полости с целью удаления жидкости, последнюю можно использовать для изготовления стандартной сыворотки. Для этого жидкость собирают в чистую посуду. По доставлении в лабораторию жидкость переливают во флакон через воронку с марлей или тканью для отделения свертка (если он имеется) и консервируют борной кислотой или азидом натрия, как указано выше.

Паспортизация. На флаконе надписывают сведения о том, из чего сыворотка приготовлена, и дату. Те же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".

IХ. Дальнейшая обработка и предварительное заключение
о пригодности сыворотки, полученной из любых источников

1. Серологические исследования.

В сыворотке определяют:

а) групповую принадлежность (групповые агглютинины);

б) гемолизирующие свойства;

в) способность вызывать неспецифическую агглютинацию;

г) активность, т.е. скорость наступления агглютинации и ее выраженность;

д) титр агглютининов.

Методы исследования (см. пункт IV)

На основании этих исследований делают предварительное заключение о пригодности сыворотки. Основными показателями являются скорость наступления агглютинации и титр антител.

2. Сыворотку предварительно считают пригодной, если она вызывает агглютинацию эритроцитов групп А1 и В не позднее чем через 30 секунд, а эритроцитов группы А2 не позднее чем через 1 минуту, и если титр агглютининов в ней не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам групп А1 и В и не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам группы А2.

При этом также следят за тем, чтобы сыворотка не имела красной или бурой окраски.

Если агглютинация наступает позднее или титр агглютининов ниже, сыворотку считают непригодной.

Наличие неспецифической агглютинации или гемолизирующих свойств на этой стадии изготовления сыворотки не делает ее непригодной, что позволяет сохранить до 1-го контроля (пункт ХI).

3. Паспортизация. Результаты всех исследований, перечисленных в этом разделе, записывают на флаконе с сывороткой и в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной cыворотки".

Х. Консервирование сыворотки

Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у донора, и сыворотку, полученную из любого другого источника и признанную предварительно годной, консервируют.

Наиболее пригодным консервантом является борная кислота, которую прибавляют из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия 1 г на 1 мл.

После прибавления консерванта сыворотку оставляют на срок 10-12 дней. За этот срок в ней, с одной стороны, может снизиться титр агглютининов, с другой - исчезнуть свойство вызывать гемолиз или неспецифическую агглютинацию, если это имело место. Сыворотку, имеющую высокий титр агглютининов, разрешается разводить изотоническим раствором NаСl до титра не ниже 1:64 и соответственно количеству разводителя добавляют борную кислоту или азид натрия.

ХI. Первый контроль сыворотки до розлива и оценка
пригодности ее для дальнейшей обработки

1. Первый контроль производится через 10-12 дней после поступления сыворотки, ее предварительного испытания и консервирования. Он заключается в следующем:

а) проверяют правильность паспортизации сыворотки, т.е. сверяют записи на флаконе и в журнале;

б) определяют групповую принадлежность при помощи стандартных эритроцитов и результат сверяют с обозначением группы крови на флаконе и в журнале;

в) одновременно с определением групповой принадлежности проверяют способность сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию и гемолиз эритроцитов;

г) проверяют, нет ли в сыворотке признаков инфицирования, не помутнела и не потемнела ли она;

д) проверяют активность сыворотки, т.е. скорость наступления агглютинации и титр агглютининов;

е) результаты всех исследований записывают на флаконе и в журнал.

2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки делается при следующих условиях: если паспортные записи произведены правильно, в сыворотке нет признаков инфицирования, если она не помутнела, не потемнела и обладает достаточной активностью.

Под достаточной активностью при первом контроле понимают соответствие требованиям, указанным в разделе II.б. при условии, что титр не только соответствует этим требованиям, но и не снизился более, чем на два разведения по сравнению с исходными цифрами.

Если сыворотка отвечает этим условиям, ее считают пригодной для дальнейшей обработки и оставляют еще на 10-12 дней, после чего производят второй контроль (см. п.ХIV).

При снижении титра более, чем на две ступени (даже если титр сыворотки после снижения остался равным или выше, чем 1:32) сыворотку считают непригодной.

При наличии признаков инфицирования, значительного потемнения и помутнения сыворотку считают непригодной.

При первом контроле сыворотки явления неспецифической агглютинации и гемолизирующие свойства наблюдаются редко, потому что эти свойства обычно исчезают за время хранения сыворотки с консервантом. Если эти свойства все же сохранились, это не делает сыворотку непригодной для дальнейшей обработки, так как при некоторых условиях они могут быть устранены в течение времени, предшествующему второму контролю сыворотки.

XII. Устранение свойства сыворотки вызывать
неспицифическую агглютинацию

Устранение свойства сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию может быть достигнуто путем разбавления ее изотоническим раствором NаСl. Это допускается только для сыворотки групп О(I), А(II) и В(III) и только при высоком титре агглютининов в ней - не ниже, чем 1:64 - и при этом титре не более, чем половинным объемом изотонического раствора по отношению к объему сыворотки (с добавлением соответствующего количества борной кислоты или азида натрия). Предварительно испытывают ряд пробных разведений сыворотки, приготовленных в небольших количествах. Наблюдение проводят в течение 20 мин. После подбора разведения, устраняющего неспецифическую агглютинацию, разводят всю сыворотку.

Если разведение изотоническим раствором NаCl не устраняет неспецифической агглютинации, сыворотку считают непригодной.

Разведение сыворотки группы АВ(IV) не допускается. Сыворотку, вызывающую хотя бы незначительную неспецифическую агглютинацию, считают непригодной.

XIII. Устранение гемолизирующего действия сыворотки

Для устранения гемолизирующего действия сыворотки ее прогревают при 56°С в течение одного часа. Если такое прогревание не устраняет гемолизирующего действия, сыворотку считают непригодной.

ХIV. Второй контроль сыворотки до розлива и оценка ее
пригодности для дальнейшей обработки

1. Второй контроль производят через 10-12 дней после первого (приблизительно через 20-24 дня после начала обработки сыворотки) и проводят так же, как первый контроль (см. раздел ХI).

2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки делают при следующих условиях: если паспортные записи сделаны правильно, сыворотка не инфицирована, не помутнела, не потемнела, не вызывает неспецифической агглютинации и гемолиза эритроцитов и достаточно активна.

Под достаточной активностью при втором контроле понимают соответствие требованиям, указанным в разделе II.б, при условии, что титр не только соответствует этим требованиям, но и не снизился по сравнению с цифрами, полученными при первом контроле.

В других случаях сыворотку считают непригодной.

ХV. Смешивание сывороток

Для максимального использования сырья и упрощения контроля за образцами разлитой сыворотки допускается смешивание нескольких порций одногруппных сывороток после второго контроля их, до розлива (раздел ХIХ). Предварительно из каждой порции берут по 1-2 мл сыворотки и в смеси их определяют титр агглютининов. Затем титр проверяют еще раз через 2-3 дня и если он не изменился, то смешивают основные сыворотки. Сыворотку-смесь обозначают новым номером и ее снова испытывают, аналогично второму контролю (раздел ХIY).

ХVI. Окрашивание сыворотки

Дополнительным условием, предупреждающим ошибки при определении группы крови, является окрашивание сывороток.

Окрашивание можно производить до фильтрации, если предполагается фильтровать сыворотку через бумажный фильтр. При использовании фильтра Зейтца сыворотку окрашивают после фильтрации.

Сыворотку группы А(II) окрашивают в синий (или сине-зеленый) цвет,

сыворотку группы В(III) - в красный цвет,

сыворотку группы АВ(IV) - в желтый цвет (см. дополнение п.ХХХ).

ХVII. Фильтрование сыворотки

Сыворотку, признанную пригодной, фильтруют. Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у донора, обычно достаточно профильтровать через бумажный фильтр. Сыворотку, полученную из других источников, необходимо фильтровать через фильтр Зейтца со стерилизующей прикладкой. Такое фильтрование просветляет сыворотку и предупреждает развитие инфекции. Немедленно после фильтрования сыворотку окрашивают (см. Дополнение 2).

ХVIII. Окончательное заключение о пригодности сыворотки

Окончательное заключение о пригодности сыворотки делают после ее фильтрования.

Сыворотку считают пригодной, если она:

а) специфична, т.е. содержит агглютинины альфа или бета, или оба вместе и не вызывает неспецифической агглютинации эритроцитов;

б) активна, т.е. вызывает первые признаки агглютинации в течение первых 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В, и в течение одной минуты с эритроцитами группы А2 и имеет титр агглютининов не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1 и В и не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам А2.

Для окончательного заключения о пригодности сыворотки, кроме абсолютной величины титра, принимают во внимание его динамику (см. раздел XI, первый контроль и раздел ХIV, второй контроль);

в) не оказывает на эритроциты гемолизирующего действия;

г) прозрачная. Допускается небольшая опалесценция;

д) предохранена от инфицирования консервированием;

е) имеет точную паспортизацию.

При соответствии этим требованиям сыворотке присваивается номер серии и она может быть разлита и выпущена как стандартная изогемагглютинирующая сыворотка для определения групп крови АВО с соответствующей записью в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".

ХIХ. Розлив

Сыворотку групп О-альфа бета(I), А-бета(II) и В-aльфа(III) разливают во флаконы или ампулы по 1-5 мл, сыворотку АВ(IV) - по 0,5 мл.

Запрещается разливать сыворотки разных групп одновременно в одном помещении.

Немедленно после розлива на флаконы (ампулы) наклеивают этикетки. Флаконы закупоривают, ампулы запаивают.

XX. Паспортизация разлитой сыворотки

1. Этикетки, наклеиваемые на флаконы (ампулы) с разлитой сывороткой, должны содержать следующие сведения:

а) название учреждения, в котором изготовлена сыворотка;

б) групповую принадлежность сыворотки с обязательным указанием агглютининов;

в) номер серии;

г) титр агглютининов в сыворотке. Титр альфа-агглютинина указывается по отношению к эритроцитам группы А1. Для сыворотки группы О-альфа бета(I) указывается титр только одного агглютинина альфа или бета и из них того, который слабее;

д) срок годности: число, месяц, год;

е) на этикетке наносят по диагонали цветные полосы:

для группы А(II)- две синие,

для группы В(III) - три красные,

для группы АВ(IV) - четыре желтые.

2. Этикетки изготавливают типографским способом, оставляя свободные места для цифровых обозначений (номера серии, титра и срока годности), которые вносят на этикетку к моменту розлива. Форму этикетки - см. Рисунок 1.

3. Сыворотку, разлитую во флаконы (ампулы), регистрируют в "Журнале для регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".

 /-------------------------------\     /--------------------------------\

 |  Наименование учреждения      |     |  Наименование учреждения       |

 |       изготовителя            |     |       изготовителя             |

 |-------------------------------|     |--------------------------------|

 |Изогемагглютинирующая          |     |Изогемагглютинирующая           |

 |сыворотка группы Оальфа бета(I)|     |сыворотка группы Оальфа бета(II)|

 |           АНТИ - (А+В)        |     |           АНТИ - В             |

 |Серия ........... Титр ........|     |Серия ........... Титр .........|

 |мл ......... годна до .........|     |мл ......... годна до ..........|

 \-------------------------------/     \--------------------------------/

 /-------------------------------\     /--------------------------------\

 |  Наименование учреждения      |     |  Наименование учреждения       |

 |       изготовителя            |     |       изготовителя             |

 |-------------------------------|     |--------------------------------|

 |Изогемагглютинирующая          |     |Изогемагглютинирующая           |

 |сыворотка группы B альфа(III)  |     |сыворотка группы ABo(IV)        |

 |           АНТИ - A            |     |                                |

 |Серия ........... Титр ........|     |Серия ...........         ......|

 |мл ......... годна до .........|     |мл ......... годна до ..........|

 \-------------------------------/     \--------------------------------/

Рис. 1. Форма этикеток стандартных изогемагглютинирующих сывороток системы АВО.

На этикетки наносят по диагонали цветные полосы:

- для сыворотки группы А бета(II) - две синие;

- для сыворотки группы В альфа(III) - три красные;

- для сыворотки группы АВо(IV) - четыре желтые.

Возможно печатать таким же цветом полностью текст этикеток.

ХХI. Срок годности стандартной изогемагглютинирующей сыворотки

Срок годности стандартной сыворотки устанавливают 6 месяцев с момента ее розлива.

Сыворотку, срок годности которой истек, можно проверить и при условии, если она сохранила без изменения свои свойства (см.разд.ХVIII), продлить срок годности еще на 2 месяца.

ХХII. Контроль разлитой сыворотки

Контроль разлитой сыворотки производят в пределах срока ее годности. Для этого из каждой серии разлитой сыворотки в лаборатории оставляют несколько ампул, которые сохраняют как образцы для последующего контроля.

Контроль заключается в проверке внешнего вида сыворотки и сохранения ее специфичности и активности.

При контрольной проверке к сыворотке предъявляют следующие требования:

а) отсутствие помутнения, выпадения осадка и потемнения;

б) отсутствие способности вызывать неспецифическую агглютинацию и гемолиз эритроцитов;

в) наступление агглютинации с эритроцитами групп А1 и В не позднее, чем в течение 30 секунд и с эритроцитами группы А2 не позднее, чем в течение одной минуты;

г) сохранение титра агглютининов на высоте, установленной при втором контроле сыворотки до розлива.

Если титр снизился (не более, чем на одну ступень), но высота его не ниже требований, указанных в разделе II.б, то сыворотку проверяют еще через пять и десять дней. Если титр далее не снижается, сыворотку считают пригодной.

ХХIII. Методика титрования при контроле разлитой сыворотки

При контроле разлитой сыворотки титр можно определять более простым cпособом. Испытуемую сыворотку разводят изотоническим раствором NаСl соответственно указанному на ней титру. Например, при титре 1:64 в пробирку накапывают 63 капли изотонического раствора и той же пипеткой одну каплю испытуемой сыворотки. Сыворотку тщательно перемешивают с изотоническим раствором и одну каплю смеси переносят на пластинку. Сюда же прибавляют одну маленькую (приблизительно в 10 раз меньшую) каплю стандартных эритроцитов соответствующей группы. Эритроциты перемешивают с сывороткой и наблюдают за результатом при покачивании пластинки в течение пяти минут.

Если за это время появилась агглютинация, значит, титр сыворотки не снизился. Если в течение пяти минут агглютинация не наступила, значит, титр сыворотки снизился. В этих случаях для установления величины титра сыворотку титруют вновь, как указано в разделе IV.5.

ХХIV. Брак разлитой сыворотки в пределах указанного срока годности

Если при контроле разлитой сыворотки окажется, что она не соответствует предъявляемым требованиям (см. раздел ХХII, а, б, в, г), то сыворотку считают непригодной и ликвидируют.

В учреждения, в которые эта сыворотка была отпущена, немедленно сообщают по телефону или телеграфом о непригодности данной серии сыворотки.

Сыворотку, возвращенную из других учреждений из-за непригодности, ликвидируют так же, как сыворотку этой серии, оставшуюся неиспользованной в лаборатории, ее изготовившей.

ХХV. Выдача сыворотки

Сыворотку выдают по требованиям учреждений, в которых определяют группу крови.

Выдают сыворотку комплектом в равных количествах групп О альфа бета(I), А бета(II), и В aльфа(III). Сыворотку группы АВо(IV) выдают по 1 мл на 15 мл общего количества сыворотки других трех групп. При выдаче сыворотки к ней обязательно прикладывают инструкцию по использованию (см. п.ХХIХ, Дополнение 1).

ХХVI. Хранение сыворотки

Сыворотку на всех стадиях ее изготовления можно хранить при комнатной температуре или в холодильнике при 4-8°С. Если сыворотка замерзла, это не меняет ее свойства и она может быть использована после полного ее оттаивания.

ХХVII. Общие сведения о паспортизации сыворотки

Под паспортизацией подразумевают запись на флаконе всех сведений о находящейся в нем порции исходного материала, из которого получается сыворотка, и последовательную запись всех результатов, полученных при исследовании исходного материала, а затем сыворотки в процессе ее изготовления и контроля.

Паспортные записи производятся:

а) на флаконе с исходным материалом. Эти записи постепенно пополняются и переносятся с флакона на флакон по мере обработки и исследования этой порции сыворотки;

б) на этикетке, наклеиваемой на флакон или ампулы с разлитой сывороткой;

в) в "Журнале регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".

г) в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".

ХХVIII. Паспортные записи в журналах

а) В "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО" записывают все сведения о поступившем материале и полученной из него сыворотки, включая контрольные исследования, проведенные до момента розлива сыворотки.

При смешивании сывороток различных серий смесь записывают под новым номером.

Записи в этом журнале повторяют записи на флаконах с неразлитой сывороткой.

б) В "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО" записывают сведения о сыворотке с момента ее розлива. В этот журнал вносят сведения, имеющиеся на этикетке разлитой сыворотки, и делают дополнительные записи о дате розлива и результатах контрольных проверок разлитой сыворотки. В этот же журнал записывают, куда и сколько было отпущено сыворотки каждой серии.

Нумерацию серий начинают с 1 января каждого года и ведут независимо от групповой принадлежности сыворотки.

Дополнение 1

ХХIХ. Инструкция по применению
изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО
(прилагается при выдаче сыворотки)

Техника реакции

Определение группы крови АВО производится стандартными изогемагглютинирующими сыворотками на плоскости при комнатной температуре.

Стандартные сыворотки наносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью по одной большой капле (0,1 мл) у предварительно надписанного обозначения. Во избежание ошибки при каждом определении группы крови применяют по два образца сывороток каждой группы (разные серии), так что они образуют два ряда капель в следующем порядке по горизонтали: О альфа бета(анти-(А+В)), А бета(анти-В) и В альфа(анти-А).

Исследуемую кровь наносят по одной маленькой капле, приблизительно в 10 раз меньше капли сыворотки (0,01 мл), рядом с каждой каплей сыворотки. Кровь тщательно перемешивают с сывороткой стеклянной палочкой или углом предметного стекла, которые промывают и досуха вытирают перед размешиванием каждой капли.

Результат реакции

Наблюдение за ходом реакции производят при легком покачивании пластинки в течение пяти минут.

Результат реакции в каждой капле может быть положительным (+) или отрицательным (-).

Положительный результат (+) выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов - агглютинаты видны невооруженным глазом сначала в виде мелких красных зернышек, постепенно сливающихся в более крупные хлопья. При этом сыворотка постепенно обесцвечивается.

При отрицательной реакции (-) капля остается равномерно окрашенной.

Агглютинация наступает обычно в течение 10-30 секунд, однако наблюдение проводят не менее пяти минут ввиду возможности позднего наступления агглютинации в случае слабой агглютинабельности эритроцитов (А2 или А2В).

По мере наступления агглютинации, но не ранее трех минут, в эти капли добавляют по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NаСl для разрушения иногда наступающей ложной агглютинации - неспецифического склеивания эритроцитов, в том числе в так называемые монетные столбики.

В тех случаях, когда положительный результат получается со стандартными сыворотками всех групп (во всех каплях), для исключения неспецифической агглютинации производится дополнительное контрольное исследование испытуемых эритроцитов со стандартной сывороткой группы АВо(IV), не содержащей групповых агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации с сывороткой группы АВо(IV) позволяет учесть положительный результат реакции с сыворотками О альфа бета(I) (анти-А+В), А бета(II) (анти-В) и В альфа(III) (анти-А) как истинный.

Изогемагглютинирующие сыворотки группы			Исследуемая кровь принадлежит к группе
О альфа бета (I) Анти-(А+В)	А бета(II) Анти-В	В aльфа(III) Анти-А
- -	- -	- -	О (I)
+ +	- -	+ +	А (II)
+ +	+ +	- -	В(III)
+ + + + + + Контроль с сывороткой группы АВо(IV)			АВ (IV)

Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы.

Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,

знаком минус (-) - отсутствие ее.

Примечание.

1. При использовании сывороток с титром не ниже, чем 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больных одной серией сывороток каждой группы. При повторном и перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены при первичном определении.

2. Уточнение техники реакции, оценки результатов, возможные ошибки и другие подробности см. в "Инструкции по определению групп крови системы АВО".

Дополнение 2

ХХХ. Подготовка и применение красок при
приготовлении стандартных изогемагглютинирующих сывороток

Для окрашивания изогемагглютинирующих сывороток используются следующие красители:

- для сыворотки группы А-бета(II) - метиленовая синяя, бриллиантовая зелень и трипан-блау вместе или любые две из них, взятые в равных количествах;

- для сыворотки группы В-альфа(III) - эозин (ВА), эозин натрия или конгорот;

- для сыворотки группы АВо(IV) - уранин (флуоресцеин растворимый - динатрий флюоресцеинат).

Краски растворяют в дистиллированной воде или изотоническом растворе NаСl до получения пересыщенного раствора (1 гр. на 50 мл жидкости). Краситель приготавливают, исходя из потребности 50-100 мл, и сохраняют для использования.

При изготовлении сывороток немедленно после фильтрования соответствующие растворы красок добавляют по 3-5 капель на каждые 100 мл сыворотки до получения требуемой окраски: синий или сине-зеленый для группы А-бета(II), светло-красный для группы В-альфа(II) и желтый для группы АВо(IV).

Следует иметь ввиду, что иногда при хранении запаянных ампул на свету синяя краска в сыворотке группы А-бета(II) слегка выцветает, но она восстанавливается после вскрытия ампулы (флакона).

Использование красок безвредно для сывороток, не влияет на титр и срок их годности.

"Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990 года N 05-14/26, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления

организации медицинской

помощи населению

А.И.Вялков