Приложение 19. Инструкция по изготовлению консервированных стандартных эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях

Приложение 19

Инструкция
по изготовлению консервированных стандартных эритроцитов
и их применению в изосерологических исследованиях
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

     Стандартные   эритроциты,    содержащие    определенные    сочетания

аллоантигенов, предназначены для выявления антиэритроцитарных  антител  в

сыворотке  исследуемой   крови,   при   определении   групп   крови   АВО

перекрестным способом, при определении резус -  принадлежности  крови,  а

также для проведения  контроля  специфичности  и  активности  стандартных

изогемагглютинирующих сывороток АВО, сывороток антирезус;  тест-сывороток

и реактивов, предназначенных для определения антигенов  различных  систем

эритроцитов крови человека. Стандартные  эритроциты  группы  О(I)  должны

                                                             w

содержать в эритроцитах клинически значимые антигены: D, С, С , с, Е,  е,

К, k, Fу, Jk, М, N, S, s, Le.

С целью увеличения срока годности стандартных эритроцитов можно производить их консервирование специально изготовленными консервирующими растворами.

I. Требования, предъявляемые к стандартным эритроцитам

Стандартные эритроциты для исследований по системе АВО должны давать четкую, хорошо видимую агглютинацию при взаимодействии со стандартными сыворотками соответствующей специфичности и не давать агглютинации с сыворотками, не содержащими антител против данного антигена эритроцитов.

Стандартные эритроциты группы А(II), предназначенные для выявления агглютинина анти-А, должны иметь титр не ниже 1:64, эритроциты группы В(III), предназначенные для выявления агглютинина анти-В, также должны иметь титр не ниже 1:64.

Титр антигенов А и В устанавливается с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток группы А-бета(II) (анти-В) и В-альфа(III) (анти-А), или соответствующих моноклональных антител, удовлетворяющих требованиям действующих инструкций.

Время наступления агглютинации эритроцитов А1 и В со стандартными изогемагглютинирующими реактивами должно составлять не более десяти секунд; эритроцитов подгруппы А3, В2 - не более двух минут.

Стандартные эритроциты группы крови О(I) не должны давать агглютинации со стандартными сыворотками групп крови О-альфа бета(I), А-бета(II), В-aльфа(III) в течение двадцати минут.

     Стандартные  резус-положительные  эритроциты  группы   крови   O(I),

                                            w

содержащие антиген D, а также антигены С,  С ,  с  и  Е,  е  в  различных

сочетаниях, предназначенные для выявления антител системы  резус,  должны

давать  соответственно  со  стандартными  сыворотками   анти-D,   анти-С,

анти-Сw, анти-с, анти-Е и  анти-е  четкую  агглютинацию  при  определении

методом конглютинации с желатином, экспресс-методом в  пробирках  или  на

плоскости без подогрева или непрямой пробе Кумбса в зависимости от  того,

для  какого  метода   исследования   предназначена   данная   стандартная

сыворотка антирезус.

Стандартные резус-отрицательные эритроциты О(I) фенотипа ссddее не должны давать агглютинации с реактивами антирезус, содержащими антитела анти-D, анти-С, анти-Е во всех методах исследования, для использования в которых предназначены указанные реактивы антирезус.

Время наблюдения за отрицательной реакцией должно соответствовать времени, установленному для каждой из этих реакций.

II. Приготовление консервированных стандартных эритроцитов

Приготовление стандартных эритроцитов производится в условиях строгого соблюдения асептики и состоит из изготовления консервирующего раствора, получения взвеси эритроцитов в консервирующем растворе, розлива эритроцитов, маркировки продукции и контрольных исследований.

1. Изготовление консервирующего раствора для стандартных эритроцитов

Консервирующей средой для приготовления стандартных эритроцитов могут служить растворы следующего состава:

     Консервант N 1

     сорбит                                40,0 г

     глюкоза                                6,0 г

     Nа2НРО4х12Н2О                          2,0 г

     КН2РО4                                 0,9 г

     левомицетин                            0,06 г

     этиловый спирт 96                      100 мл

     вода бидистиллированная                до 1000 мл

     рН раствора                            6,8 -6,9

В случае необходимости доведения рН до требуемой величины добавляется несколько кристаллов аскорбиновой кислоты или Na2НРО4х12Н2О.

Консервант N 2:

     аденин                                 0,03 г

     инозин                                 0,06 г

     лимонная кислота                       1,5 г

     глюкоза                                3,0 г

     Na3РО4                                 0,4 г

     NаОН 1н                                20 мл

     вода дистиллированная                  до 100 мл

     рН раствора                            6,3 -6,4

Консервирующие растворы (консерванты) представляют собой прозрачную бесцветную жидкость без запаха. Стерилизания консервантов производится путем фильтрования их через соответствующие стерилизующие фильтры. Розлив производят в стерильные флаконы емкостью 250 мл или 500 мл, которые немедленно закрывают резиновыми пробками и завальцовывают металлическими колпачками. Срок годности консервантов - шесть месяцев. В случае помутнения консервирующего раствора или появления желтого окрашивания применение его для работы недопустимо.

2. Получение взвеси эритроцитов в консерванте

Источником получения стандартных эритроцитов является эритроцитная масса, получаемая после удаления плазмы из консервированной крови доноров. Кровь берут от доноров, фенотип эритроцитов которых заранее определен. Для получения стандартных эритроцитов, содержащих антигены системы АВО, в качестве исходного материала должна быть использована эритроцитная масса от одного специально отобранного донора.

     А  для  получения  стандартных  эритроцитов  других   систем   можно

испольэовать смесь эритроцитов группы О(I) от  нескольких  (2-4)  доноров

различного фенотипа таким образом, чтобы каждый из редких  антигенов:  К,

 w

С ,  Е  присутствовали  в  эритроцитах  не  менее  чем  у  двух  доноров.

Используется эритроцитная масса,  полученная  не  позднее  2-3  суток  от

момента заготовки крови.

В боксе через стерильную систему путем прокола переливают эритроцитную массу во флакон с заготовленным консервантом так, чтобы соотношение эритромассы и консерванта было 1:4. Содержимое флакона осторожно перемешивают и разливают той же системой в стерильные флаконы по 5, 10 или 25 мл. Используют обычную систему для взятия.

Флаконы (по 5, 10 или 25 мл) закрывают резиновыми пробками, завальцовывают металлическими колпачками, немедленно маркируют (см.п.3) и помещают в рефрижератор при температуре +4°С.

3. Маркировка

На флаконы со стандартными эритроцитами наклеивают этикетки с указанием: учреждения, изготовившего эритроциты, группы крови по системе АВО, антигенного состава эритроцитов, срока годности. Наставление по применению стандартных эритроцитов прилагается при выдаче (см.п.IV).

4. Контроль

Контроль специфичности и активности стандартных эритроцитов производится после их расфасовки и маркировки в изоиммунологической лаборатории станции переливания крови.

5. Хранение и сроки годности

Стандартные консервированные эритроциты хранят при +4°С. Срок годности консервированных стандартных эритроцитов - два месяца. При использовании в качестве стандартных эритроцитов цельной консервированной крови, а также эритроцитной массы в комбинации с другими гемоконсервантами, срок хранения стандартов 1-4 недели.

III. Транспортировка стандартных эритроцитов

Транспортировка стандартных эритроцитов производится аналогично транспортировке консервированной крови в изотермической таре.

IV. Наставление по применению консервированных стандартных эритроцитов
(прилагается при выдаче)

Консервированные стандартные эритроциты используют в постановках реакций в различных методиках в соответствии с действующими инструкциями по изосерологии.

     1. Стандартные эритроциты группы О(I) с  содержанием  в  эритроцитах

                                     w

клинически значимых антигенов D, С, С , с, Е, е, K, k, Fу, Jk, М,  N,  S,

s,   Lе   предназначены   для   выявления   соответствующих    изоимунных

противоэритроцитарных  антител  в  сыворотке  крови  доноров,  больных  и

беременных с помощью реакции конглютинации  в  желатине,  непрямой  пробе

Кумбса,  реакции  агглютинации  и  солевой  среде  в  пробирках  или   на

плоскости.

Для желатинового метода используют осадок стандартных эритроцитов или 10% их взвесь в желатине, для чего к одной части осадка эритроцитов добавляют девять частей 10% раствора желатина, стандартизованного для серологических исследований. В реакции используют по две капли (0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных эритроцитов в желатине используют в течение рабочего дня, на следующий день готовят новую порцию. В непрямой пробе Кумбса и реакции агглютинации в солевой среде используют стандартные эритроциты, отмытые не менее двух раз физиологическим раствором хлористого натрия.

2. Стандартные эритроциты группы О(I), А1(II), А2(II), В(III) предназначены для выявления изогемагглютининов альфа и бета в сыворотке или плазме крови при определении групповой принадлежности крови перекреcтным методом, а также для выявления неполных изоимунных альфа и бета антител в сыворотке крови доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в желатине и непрямой пробе Кумбса. Для перекрестного метода и реакции конглютинации в желатине применяют неотмытые стандартные эритроциты, взятые непосредственно из осадка со дна флакона. Для желатинового метода используют осадок стандартных эритроцитов или 10% их взвесь в желатине, для чего к одной части осадка эритроцитов добавляют девять частей 10% раствора желатина, стандартизованного для серологических исследований. В реакции используют по две капли (0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных эритроцитов в желатине используют в течение рабочего дня, на следующий день готовят новую порцию. В непрямой пробе Кумбса и реакции агглютинации в солевой среде используют стандартные эритроциты, отмытые не менее двух раз физиологическим раствором хлористого натрия.

3. Срок годности консервированных стандартных эритроцитов - два месяца.

Стандартные эритроциты из разгерметизированного флакона пригодны для использования в течение недели.

...

ГАРАНТ:

Ввиду нечитаемости источника документа последние два абзаца Инструкции не приводятся

Начальник Управления организации медицинской помощи населению

А.И.Вялков

-------------------------------------------------------------------------

*(1) Примечание: если необходимо ускорить отделение сыворотки, пробирку с кровью центрифугируют около 5 мин. при 2000-3000 об/мин.

*(2) Примечание: при проведении проб на совместимость по резус-антигену D следует учитывать, что если резус-отрицательному больному будет ошибочно выбрана резус - положительная кровь, это может быть выявлено только в том случае, если у реципиента имеются в крови резус-антитела. Выявить различие в резус-принадлежности крови донора и реципиента, если последний не имеет антител, пробы на совместимость не могут.

Предупреждение таких ошибок должно быть обеспечено предварительным определением резус-принадлежности крови донора и реципиента и тщательной проверкой записей этих результатов в истории болезни и на контейнере с кровью.

*(3) Примечание: для удобства рекомендуется сначала выпустить из флакона через иглу несколько капель крови донора в другую пробирку, а затем оттуда пастеровской пипеткой перенести маленькую каплю в пробирку.

*(4) Примечание: в этой пробе агглютинация сенсибилизированных эритроцитов происходит за счет иммунных антител против белка крови человека, находящихся в сыворотке для пробы Кумбса. Последняя приготавливается из крови животных, предварительно иммунизированных сывороткой крови человека.

*(5) Примечание: при несовместимости в непрямой пробе Кумбса агглютинация обычно наступает в течение первой минуты. Однако следует помнить, что при низком титре резус-антител (или других антител) агглютинация может наступить значительно позже, иногда к концу 20-й минуты.

*(6) Стандартные эритроциты приготавливаются учреждениями службы крови в консервированном виде. Можно использовать и нативные свежие стандартные эритроциты, приготовленные малыми дозами в соответствии с действующей инструкцией по их изготовлению.

*(7) Амниотическая жидкость нейтрализует альфа и бета антитела, относящиеся к классу IgM, неполные альфа и бета антитела, относящиеся к классу IgG, при этом не нейтрализуются.

*(8) Примечание: сыворотку антирезус с более высоким титром можно развести до этого значения сывороткой группы АВ(IV), стандартным разводителем или 2,5% раствором альбумина в изотоническом растворе NаСl.

*(9) Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.

*(10) Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.

*(11) Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина

*(12) Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина

*(13) Составители: С.И.Донсков, А.Г.Башлай, Т.М.Пискунова, В.И.Червяков, И.С.Липатова.

*(14) 1 мл сыворотки анти-К расходуется на 15-20 исследований.

*(15) Контроль в отношении возможного ложно-положительного результата за счет активных полных антител не требуется, т. к, в данном случае непрямая проба Кумбса ставится как дополнение только при отрицательном результате в солевой среде.